专利名称：脊索瘤细胞株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及脊索瘤细胞株及其用途，属于肿瘤生物学领域，更具体地，涉及ー种人脑脊索瘤细胞系(BHC2)的建立及其用途
背景技术：
脊索瘤来源于脊索胚胎残余组织产生的原发性骨性肿瘤，是ー种少见的慢性进展的恶性肿瘤，占全部原发恶性肿瘤的3% 4%，居原发性恶性骨肿瘤第4位。有约1/3起源于颅底部，其余可起源于脊柱、骶尾部或中线以外的位置。该肿瘤发展缓慢且具有恶性肿瘤的生长方式，常生长于斜坡骨质，部位深在，且常呈广泛性生长，部分还有分隔，并毗邻重要的血管和神经，彻底切除非常困难，而且该肿瘤对放、化疗不敏感，因此颅底脊索瘤治疗极其困难，复发率高且预后相对较差，中位生存期约为6年，10年生存率仅为40%，大约50-70%的患者无治而终，对患者及其家庭乃至社会都造成一定程度的危害。因此，开发更为有效的肿瘤治疗方案和治疗药物是非常重要的。脊索瘤从组织形态学将其分为普通型脊索瘤、软骨样脊索瘤和低分化型脊索瘤。光镜下呈条索状排列的空泡细胞。脊索瘤的确诊依赖免疫组织化学染色。目前常用的标志蛋白有S-100、上皮细胞膜抗原(Epithelial Membrane Antigen, EMA)、细胞角蛋白(Cytokeratin, CK)以及vmientin蛋白。Vujovic等人对胚胎脊索组织、53例脊索瘤及其它323例肿瘤组织(包括163例软骨肿瘤)进行了 Brachyury蛋白的免疫组化研究，发现胚胎脊索组织和所有脊索瘤细胞均Brachyury蛋白(+)，而所有其它肿瘤及正常组织均为(_)。这个研究表明脊索瘤组织中的软骨样细胞和脊索样细胞都是来源于脊索细胞，所以Brachyury蛋白可作为鉴别脊索组织及脊索组织来源的肿瘤特异性标志物。Schwab等人比较了 6例经典脊索瘤和14例原发脊索肉瘤，发现Brachury和⑶24只在脊索瘤中表达。Brachury是新近发现的ー种脊索瘤相关分子标志物,其它的生物标志蛋白还有癌胚抗原(Carcino Embryonic Antigen,CEA)、半乳糖苷酶结合蛋白(Galenctin-3)、Fascin_l、生长因子类(Growth factors,GFs)、基质金属蛋白酶类(Matrix Metalloproteinase,MMPs)等。脊索瘤细胞系是研究肿瘤生物学特性的重要工具，并且是研究抗肿瘤药物的有用工具。将来的治疗策略应该是靶向清除脊索瘤细胞，从而获得对肿瘤的有效治疗。开发靶向药物首先需要一个性质稳定的脊索瘤细胞系，以此脊索瘤细胞系为基础才可能研发出特异性靶向脊索瘤的药物，但目前这种细胞系国内尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一株能够在体外长期传代培养的、性质稳定的脊索瘤细胞系(BHC2)。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案人脑脊索瘤细胞系(BHC2)，其特征在于所述细胞系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO :5321。
所述的人脊索瘤细胞系，生物学特性为细胞呈长梭型，贴壁生长，胞浆存在大量空泡。所述的人脊索瘤细胞系，有Brachyury、S100、Galectin-3、Fascin-I多种脊索来源细胞特异性标志蛋白的表达。所述细胞系的染色体为异倍体核型。所述的人脊索瘤细胞系，该细胞周期各时相的细胞百分率分别Gl期51. 3%、S期23. 6%、G2-M期25%、G2/G1 ^ 2，表现出肿瘤细胞增殖特性。本发明提供一种人脊索瘤细胞系，该人脊索瘤细胞系HBC2已于2011年9月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，其保藏编号为 CGMCC No. 5321，建议的分类名为人脊索瘤细胞。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。本发明所述的人脑脊索瘤细胞系HBC2是发明人从颅底脑脊索瘤患者的肿瘤组织中分离培养获得，该细胞通过细胞因子依赖法和反复贴壁法筛选纯化后获得增殖能力很强的HBC2细胞，在体外经过超过14次的传代培养，细胞仍保持脊索肿瘤特性。该细胞具有脊索细胞的超微结构，并表达多种脊索来源组织的标志蛋白，同时也具有肿瘤特性和成瘤能力。通过光学显微镜和电子显微镜方法证实，本发明所述的人脊索瘤细胞系在胞浆中存在特征性空泡结构。通过免疫组织化学方法证实，本发明所述的人脊索瘤细胞系表达多种脊索来源组织的标志蛋白 Brachyury、S100、Galectin-3、Fascin-1。通过流式细胞术方法证实，本发明所述的人脊索瘤细胞系细胞周期各时相的细胞百分率G1 期 51. 3%、S 期 23. 6%、G2-M 期 25%、G2/G1 ^ 2。本发明所述的人脊索瘤细胞系染色体呈多倍体核型，而且接种BALB/C免疫缺陷鼠后具有成瘤能力。本发明所要解决的另一个技术问题是提供人脊索瘤细胞系在制备或筛选靶向肿瘤细胞药物中的应用。将本发明所述的人脊索瘤细胞系用于研发靶向脊索瘤的药物，例如，制备并筛选出HBC2特异抗体，通过体外实验挑选出具有抑制和杀伤HBC2细胞的抗体，可以将此抗体作为抗脊索瘤药物的主要成份；或挑选出特异识别HBC2的抗体并作为靶向工具，制备抗脊索瘤的靶向药物。人脊索瘤细胞系(BHC2)的用途，包括但不限于以下用途用于制备肿瘤诊断试剂。 用于筛选和/或制备抗肿瘤药物。用于制备肿瘤动物模型。用于开发肿瘤药物靶点。用于肿瘤的体外研究。本发明所述的人脊索瘤细胞系主要优势在于I.本发明所述的人脊索瘤细胞系既具有胞浆空泡结构，表达多种脊索来源组织的标志蛋白；同时也具有染色体呈多倍体核型、细胞周期中S期细胞百分率大于14%和成瘤能力的肿瘤细胞特性。
2.本发明所述的人脊索瘤细胞系可以体外传代培养14代而保持脊索瘤性质不变，适合作为研发脊索瘤相关药物的细胞材料。以下通过附图和具体实施例详细说明本发明技术方案，并不以此限定本发明的实施范围。
图1为病人病理诊断细胞片状样排列，核圆形或椭圆形，胞质略透明，含大量皂泡样结构0 ，X 200)图2为培养第14代的HBC2.细胞呈多角形，有长短不等的突起；胞核圆形，位于中央，见明显的核仁，偶见双核；胞浆内见大量大小不等的空泡和黑色颗粒(相差显微镜，X 400)图3为透射电镜检测HBC2超微结构.胞膜表面大量微绒毛，胞核形态不规则，核膜凹陷，核仁大、明显，胞浆内大量低电子密度的粘液空泡(X 6000)图4 为免疫组织化学染色检测 HBC2S100、Galectin-3、Fascin-1> Brachyury标志蛋白的表达.阳性细胞为胞浆中充满致密的棕褐色颗粒，SlOO蛋白表达呈强阳性，Galectin-3蛋白表达呈弱阳性，Fascin-I蛋白中等表达，Brachyury蛋白表达呈强阳性(DAB, X200)图5为HBC2染色体核型分析 染色体为84条异倍染色体核型(油镜，X 1000)图6为流式细胞术分析HBC2细胞周期图7为HBC2体内成瘤实验.I. 8X IO7个细胞注射到裸鼠腋下皮下，第4周时见裸鼠腋下有2厘米大小的肿瘤
具体实施例方式实施例1 :人脊索瘤细胞系的建立HBC2原代培养本发明所述细胞系是从手术病人颅底脑脊索瘤组织分离培养获得。肿瘤组织取自首都医科大学附属北京天坛医院神经外科中心的一位患者手术标本，病理诊断为脑脊索瘤，显微镜下细胞片状样排列，核圆形或椭圆形，胞质略透明，含大量皂泡样结构(图I)。具体方法如下无菌超净台内用含破红液的Hank’ s(l I)将组织块洗2次，去除血管和坏死组织，用组织剪将组织块剪成约Imm3大小，加入3ml 0. 04%EDTA/0. 5%胰蛋白酶，37°C水浴消化10分钟，显微镜下观察，待消化成单细胞后，加入300ul胎牛血清终止消化。用200目的金属筛网过滤，去除未消化的组织。过滤后的细胞悬液在无血清DMEM溶液中通过离心(800rpm/分，10分钟)洗涤2次，收集离心管底部的沉淀细胞，将细胞悬浮于含有生长因子的培养液(培养液的配制90% Neurocult NS-ABasal Medium(Human), 10% Neurocult NS-A proliferation supplement (Human),终浓度为lOng/ml的喊性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF),终浓度为20ng/ml的表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)中，接种于T25培养瓶内，置于37°C、5% CO2培养箱中培养。细胞纯化细胞培养24h后弃悬浮细胞，贴壁细胞换含20%胎牛血清的DMEM/F12继续培养，待细胞生长接近90%汇合时，Hank’ s洗2次，加入0. 4ml 0. 04% EDTA/0. 5%胰蛋白酶消化3分钟，加上述培养液吹打分瓶，37°C培养30分钟，收集悬浮细胞，弃贴壁细胞，悬浮细胞37°C培养30分钟，待细胞再次贴壁后，收集悬浮细胞，弃贴壁细胞，悬浮细胞再37°C培养30分钟，通过反复贴壁法，最终去除成纤维细胞。传代培养纯化后的细胞生长达90%汇合时，加入0.4ml 0. 04% EDTA/0. 5%胰蛋 白酶消化2分钟，加上述培养液吹打、分瓶，37°C、5% CO2培养箱中传代培养。重复上述过程，直至传14代，行以下各项检测。相差显微镜下第14代HBC2细胞生长特性细胞呈多角形，有长短不等的突起；胞核圆形，位于中央，见明显的核仁，偶见双核；胞浆内见大量大小不等的空泡和黑色颗粒(图 2)。实施例2 :透射电子显微镜观察细胞的超微结构HBC2细胞传代培养14代时，待细胞生长达90%汇合时，弃培养液，加入3ml 0. IMPBS (PH7. 4)，用橡皮细胞刮刮取细胞，收集细胞，离心(800rpm/分，10分钟)，弃上清，戊二醛/四氧化锇前固定2小时，0. IM PBS (PH7. 4)洗3次，10分钟/次。然后行标本的后固定、脱水、浸透、包埋、切超薄切片和重金属染色(北京市神经外科研究所电镜室完成)。透射电镜观察HBC2超微结构，可见胞膜表面大量微绒毛，胞核形态不规则，核膜凹陷，核仁大、明显，胞浆内大量低电子密度的粘液空泡(图3)。实施例3 :免疫组织化学染色检测脊索组织来源的标志蛋白HBC2细胞传代培养14代时，待细胞生长达90%汇合后，用Hank’ s洗2次。力口A 3ml 0. 04% EDTA/0. 5%胰蛋白酶消化约2分钟，加2ml含血清培养基终止反应，离心(800rpm/分，10分钟)洗涤I次，收集离心管底部的沉淀细胞。将细胞重悬于5ml含20%血清的DMEM/F12培养液中，接种于铺有盖玻片的培养皿中培养，待细胞生长90%汇合后弃培养液，0. IM PBS (PH7. 4)洗3次，加入冷丙酮4°C固定10分钟，0. IM PBS (PH7. 4)洗3次，5分钟/次，3 %过氧化氢室温10分钟(消除内源性过氧化物酶)。0. IMPBS (PH7. 4)洗3次，5分钟/次，封闭液(1%羊血清，0. 5%血清白蛋白，0. 1% TritonX-100，0. 1MPBS)封闭30分钟,37。。,弃封闭液，加Brachyury、S100、Galectin-3和Fascin-I单克隆抗体(I 100稀释)，4°C过夜，对照培养皿加0. IM PBS (PH7. 4)。次日用含Tween-20的PBS洗3 次，分别加 I 滴鼠 Polymer Helper (即用型)(S100、Galectin-3、Fascin-1)和 I 滴兔Polymer Helper (即用型)(Brachyury) 37°C孵育 30 分钟，用含 Tween-20 的 PBS 洗 3 次，分别加 Poly-HRP anti-mouse IgG(S100、Galectin-3、Fascin-1)和 Poly-HRP anti-rabbitIgG (Brachyury) 37°C孵育30分钟，用含Tween-20的PBS洗3次，DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，脱水、透明、封片。显微镜下观察，阳性细胞的特点为胞浆中充满致密的棕褐色颗粒，SlOO蛋白表达呈强阳性，Galectin-3蛋白表达呈弱阳性,Fascin-I蛋白中等表达,Brachyury蛋白表达呈强阳性(图4)。实施例4 HBC2细胞的肿瘤特性分析(I)染色体核型分析HBC2细胞传代培养14代时，待细胞生长达90%汇合后，换液并加入终浓度为0. 5ug/ml的秋水仙素工作液使细胞停止在分裂中期，4h后收获细胞，KCl (0. 075M)低渗处理30分钟，37°C，新鲜配置的甲醇冰醋酸(3 I)预固定细胞30分钟，离心(SOOrpm/分，10分钟)弃上清，再加新鲜配置的甲醇冰醋酸(3 I)固定细胞30分钟，离心(800rpm/分，10分钟)弃上清，留300ul固定液吹打、滴片，80°C烤片2小时，吉姆萨染色。显微镜(Nikon 80i型，日本)和PCI图像采集系统采集图像，行染色体核型分析。油镜下观察并染色体计数，见染色体为异倍体核型,84条染色体(图5)。(2)流式细胞术检测细胞周期HBC2细胞传代培养14代时，取对数生长期细胞，弃培养液，胰酶消化细胞，加培养液，离心(800rpm/分，14分钟)，去上清。PBS洗2次，0. 5mlPBS吹打，用5ml注射器吸 取细胞，然后用力打入5ml 70% (预冷)乙醇中，封口膜封口，4°C固定过夜。离心(800rpm/分，14分钟)，收集固定细胞，PBS洗2次，0. 4ml PBS重悬细胞并轻轻吹打(防止细胞破碎)。加RNase-A约3 yl (终浓度为50 u g/ml)，37°C水浴消化30分钟，加50 ill PI(终浓度为65 u g/ml)，冰浴中避光染色30分钟，300目(孔径40 50微米)尼龙网过滤，上机检测(图6)。HBC2细胞周期各时相的细胞百分率为G1期51. 3%、S期23. 6%、G2-M期25%、G2/G1 ^ 2。(3)成瘤能力检测为了检测细胞的成瘤能力，将1.8X107个HBC2细胞接种于N0D/SCID裸鼠腋下皮下，接种后每天观察肿瘤的生长情况，记录成瘤潜伏期和肿瘤大小。结果发现在第10天时裸鼠腋下有肿瘤出现，第4周时肿瘤大小达2厘米(图7)。
权利要求
1.人脊索瘤细胞系(BHC2)，其特征在于所述细胞系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO 53210
2.根据权利要求I所述的人脊索瘤细胞系，其特征在于所述细胞系的生物学特性为细胞呈长梭型，贴壁生长，胞浆存在大量空泡。
3.根据权利要求I所述的人脊索瘤细胞系，其特征在于所述细胞系有Brachyury、S100、Galectin-3、Fascin-I多种脊索来源细胞特异性标志蛋白的表达。
4.根据权利要求I所述的人脊索瘤细胞系，其特征在于所述细胞系的染色体为异倍体核型。
5.根据权利要求I所述的人脊索瘤细胞系，其特征在于，该细胞周期各时相的细胞百分率分别Gl期51. 3%、S期23.6%, G2-M期25%、G2/G1 ^ 2，表现出肿瘤细胞增殖特性。
6.权利要求I所述的人脊索瘤细胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于制备肿瘤诊断试剂。
7.权利要求I所述的人脊索瘤细胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于筛选和/或制备抗肿瘤药物。
8.权利要求I所述的人脊索瘤细胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于制备肿瘤动物模型。
9.权利要求I所述的人脊索瘤细胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于开发肿瘤药物革巴点。
10.权利要求I所述的人脊索瘤细胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于肿瘤的体外研究。
全文摘要
本发明公开了一株脊索瘤细胞株及其用途，属于肿瘤生物学领域。人脊索瘤细胞系(BHC2)，保藏号为CGMCC NO5321。该细胞系从颅底脑脊索瘤患者手术切除的脊索瘤组织中分离培养获得，在体外传代培养超过14代。该细胞具有脊索来源细胞的生物学特性光学显微镜下呈条索状排列的空泡细胞，透射电子显微镜下胞浆中存在大量的空泡结构，表达多种脊索来源细胞的标志蛋白Brachyury、S100、Galectin-3、Fascin-1。该细胞具有染色体为异倍体核型的肿瘤特性；细胞周期各时相的百分率分别为G1期51.3％、S期23.6％、G2-M期25％、G2/G1≈2，表现出肿瘤细胞增殖特征；细胞注入裸鼠体内后有成瘤能力。由于其在体外可长期培养并保持细胞特性不变，是研制靶向脊索瘤肿瘤药物的有力工具。
文档编号C12Q1/02GK102618499SQ20121005296
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者万虹, 冯洁, 历俊华, 吴震, 孙异临, 张俊廷, 李德志, 王亮, 郝淑煜 申请人:北京市神经外科研究所