专利名称：产生褐藻胶裂解酶的菌株及其发酵方法
技术领域：
本发明属于微生物菌株及其应用，涉及一株新的海洋细菌菌株sp. ZJU HZ22，菌株保藏号为CGMCC No. 5324。本发明还涉及该菌株发酵产生的褐藻胶裂解酶 (ALG22)及其制备方法。
背景技术：
褐藻胶(alginate)是褐藻酸、褐藻酸盐及其它衍生物的统称，广泛存在于海带、马尾藻、巨藻等上百种褐藻的细胞壁中，主要由1，4 - ^ - D -甘露糖醛酸(M)及1，4 -a - L -古罗糖醛酸(G)两种糖醛酸单体聚合而成，聚合形式包括以poly M或者
poly G的形式构成均聚多糖,或者以poly MG的形式(包括M、G单体--交替聚合或者以
不同比例随机聚合)构成杂聚多糖。褐藻胶裂解酶(alginate lyase)是一种专一作用于I — 4糖苷键,通过@消去机制切断褐藻胶糖链的酶。由于尚未发现能够作用于褐藻胶的水解酶，因此，褐藻胶裂解酶是目前唯一有效的褐藻胶降解酶类。褐藻胶裂解酶在海洋藻类、软体动物、棘皮动物中均存在，但大部分都来源于海洋细菌、土壤细菌以及真菌。通过文献查新获悉，目前国外获得的海洋产酶菌株主要分布在^lginoVibrio, Alteromonas, Beneckea, Halomonas, Photobacterium, Pseudomonad, Pseudomonas, Vibrio 等属中。国内有文献报道的产酶菌株主要包括海洋来源的弧菌(K/Ario)、交替假单胞菌QPseudoalteromonas)、不动妖M (A cine tobac ter ) > Agari vorans细菌，以及土壤来源的芽孢杆菌{Bacillus、等。专利检索的结果表明，目前国内涉及褐藻胶裂解酶的专利有9个,产酶菌株包括
X8 (CCTCC No. 209110), AgarivoransalbusYM-M, Vibrio sp. JG07-007 (CCTCC M207068), Vibrio sp. miQl, Vibriofluvialis (CCTCC M200015),Pseudomonas sp. QDA, 以及一株新的嗜碱菌N19-2 (CGMCC No. 0464)。综上所述，属的细菌在国内外均尚未有褐藻酸裂解酶的报道。褐藻胶裂解酶最初是一种重要的生物学工具酶，作为解壁酶应用于褐藻单细胞、 原生质体的制备，以及褐藻胞内物质的提取等，在海藻遗传工程研究中有广泛地应用。而近年来，褐藻胶裂解酶作为一种潜在的工业用酶在褐藻的液化以及褐藻寡糖的制取中成为研究热点。前者主要通过该酶与其他海藻多糖水解酶的共同作用实现藻体生物质的液化，最大程度地提取海藻有机碳，进而作为海藻深加工品的生产原料。后者主要作为活性褐藻寡糖的生产用酶，因为酶解获得的褐藻寡糖在其非还原性末端具有c4，5不饱和双键，从而使其具备了独特的物理特性、生理活性和药用功能，而物化方法制备的褐藻寡糖则没有相应的性质。目前的研究证明，褐藻寡糖的物理特性主要可应用于食品原材料和添加剂，造纸添加剂，农业杀虫剂和农药稳定剂、调节剂等；生理活性主要可应用于整肠、解毒、降血糖血脂、 抗炎、抗菌、免疫调节等；药用活性主要可应用于抗肿瘤、抗病毒和治疗心脑血管疾病的寡糖药物。我国海藻资源丰富，海带、紫菜等经济海藻的养殖尤其发达，但藻类加工业的发展则相对滞后，加工产品种类少、附加值低、市场竞争力弱。在此背景之下，以褐藻胶裂解酶、 琼胶酶为代表的一系列海藻多糖降解酶的研发，对于藻类生物质在诸如食品、医药、农业、 能源等领域的精深化和多样化利用具有重要的推动作用，对我国海洋经济发展具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株新的产生褐藻胶裂解酶的菌株。本发明涉及的菌株 ZJU HZ22来源于野生海藻及其生长区域的天然海水，样品经摇瓶选择性富集和平板分离筛选后获得产酶菌株。该菌株代表了海洋细菌属的一个新种。目前，属的菌株在国内外均尚未有产生褐藻胶裂解酶的报道。菌株ZJU HZ22已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为sp.，保藏号为CGMCC No. 5324，保藏日 2011年10月14日，菌株名称ZJU HZ22。形态特征、生长条件、生理生化指标以及系统发育分析研究表明，菌株ZJU HZ22C = CGMCC No. 5324)具有以下特点
(I)菌落形态菌落呈圆形，表面光滑，蜡状光泽，凸起，边缘平整，半透明，呈亮黄色。(2)细胞形态革兰氏阴性杆菌(图I)。(3)生长条件严格好氧，最适生长温度28_32°C (图2)，最适生长pH 7.0-7. 5(图 3),最适生长海盐(sea salt)浓度2% (图4)。(4)生理生化特征氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，褐藻胶裂解酶阳性(图5)，果胶酶阴性，淀粉酶阴性，纤维素酶阴性。(5) 16S rDNA序列比对以及系统发育分析菌株ZJU HZ22的16S rRNA基因全长序列共 1479 nt(Seq ID No. I),已递交至 GenBank Database,序列登录号为 JN620360。比对分析结果表明，ZJU HZ22 与标准菌株agarivorans Jff-26 (T)认及 Algibacter lectus KMM 3902⑴的序列相似性最高，分别为96. 834%和96. 765%,但均低于97%的种间黄金分割线，因此认为其代表了一个新的细菌种。同时，系统发育分析结果表明，ZJU HZ22 在系统发育树上与Tamlma属菌株的亲缘关系最近，因此认为其代表了 Tamlma属的新种 (图 6)。综上所述，参照原核微生物分类权威杂志《International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology》中有关属的描述，菌株 CGMCC No. 5324 命名为 sp. ZJU HZ22 (种名未定)。本发明的另一个目的是提供一种由菌株CGMCC No. 5324发酵产生的褐藻胶裂解酶(ALG22)及其制备方法。本发明涉及的褐藻胶裂解酶ALG22的发酵方法包括以下步骤
(1)将CGMCCNo. 5324的斜面培养物(4°C保存)接种至种子培养基中，于28-32°C (优选28°C)、120 rpm条件下培养14-16小时培养至对数生长期，得种子液；
(2)生长良好的种子液以0.2%的接种量转接发酵培养基，相同条件下培养48小时，得发酵液；
(3)发酵液经高速离心获取上清液，此即褐藻胶裂解酶(ALG22)酶液。
上述方法的步骤(1)中，种子培养基为marine broth 2216 (以下简称2216),配方 如下(L—1):蛋白胨5 g,酵母抽提物1 g,朽1檬酸铁0.1 g,氯化钠19. 45 g,六水合氯化 镁12. 6 g,七水合硫酸镁6. 64 g,氯化钙1. 8 g,氯化钾0. 55 g,碳酸氢钠0. 16 g,溴 化钾0. 08 g,六水合氯化锶57. 00 mg,硼酸22. 00 mg,九水合硅酸钠9. 30 mg,氟化钠 2. 40 mg,硝酸铵2. 40 mg,磷酸氢二钠8. 00 mg, pH 7. 0-7. 5 (优选7.0)。也可以直接使 用生物公司外售的marine broth 2216,或者使用生物公司外售的sea salt代替上述无机 盐成分配制。上述方法的步骤(2)中，发酵培养基为含0. 4%海藻酸钠的2216培养基，其中，海 藻酸钠作为提高褐藻胶裂解酶分泌量的刺激底物。发酵体系按200 ml培养基/500 ml摇 瓶比例设置，于28 °C，120 rpm条件下培养。上述方法的步骤(3)中，发酵液于12000 g X 10 min离心去除菌体即可。针对上述方法获取的ALG22酶液，分别测定其在不同温度、pH和盐浓度下的酶活 变化，及其在4°C保存条件下的酶活稳定性，结果表明，菌株CGMCC No. 5324产生的褐藻胶 裂解酶ALG22具有以下特性
(1)最适反应条件最适反应温度40-50°C (图7);最适反应pH 7. 0-8. 0 (图8)。(2)耐盐性在原有2216培养基的盐浓度前提下，最适反应MgCl2浓度15-30 mM (图9)，换算成总Mg2.浓度则为60-75 mM ;能够耐受0. 75 M的NaCl(图10)，换算成总NaCl 浓度则为0. 94 M。(3)半衰期ALG22在2216培养基的盐浓度下，在4°C保存条件下的酶活半衰期约 为96小时，前48小时内酶活基本不变(图11)。本发明发现的菌株CGMCC No. 5324代表了一个新的海洋细菌种，丰富了褐藻胶裂 解酶产酶菌株的多样性和可选择性。该菌株生长周期短，14小时就达对数生长期，易于人 工培养和扩大培养。同时，该菌株在没有诱导底物的情况下也能本底表达褐藻胶裂解酶，并 可通过底物刺激的方法提高表达量，发酵制备方法简便。此外，菌株CGMCC No. 5324产生的 褐藻胶裂解酶ALG22为胞外酶，发酵液经简单的除菌处理即可获得显著且稳定的酶活，既 可直接应用于褐藻胶降解，也易于进一步分离纯化。综上所述，本发明提供的产酶细菌ZJU HZ22菌株新颖，酶制备工艺简单，所产褐藻胶裂解酶ALG22具有突出的耐盐性，在褐藻胶降 解以及褐藻寡糖的制取中具有应用潜力。
图1菌株CGMCCNo. 5324的细胞形态。图2菌株CGMCCNo. 5324的最适生长温度曲线。图3菌株CGMCC No. 5324的最适生长pH曲线。图4菌株CGMCCNo. 5324的最适生长海盐浓度曲线。图5菌株CGMCC No. 5324的褐藻胶裂解酶平板筛选结果。图6菌株CGMCCNo. 5324及其相近菌株的系统发育树。图7褐藻胶裂解酶ALG22的粗酶最适反应温度曲线。图8褐藻胶裂解酶ALG22的粗酶最适反应pH曲线。图9褐藻胶裂解酶ALG22的粗酶最适反应MgCl2曲线。
图10褐藻胶裂解酶ALG22的粗酶NaCl耐受曲线。图11褐藻胶裂解酶ALG22粗酶的低温保藏(4°C)稳定性曲线。图12菌株CGMCC No. 5324发酵产酶过程中对海带底物的降解效果。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例I :菌株sp. ZJU HZ22 的分离
采集我国东海舟山海域的野生海藻以及周边海水，藻体在无菌条件下碾碎，并与200 ml海水样品一起转入500 ml无菌摇瓶，同时加入少量无菌新鲜海带块以及peptone (终浓 I g/1)和yeast extract(终浓I g/1),于28°C, 120 rpm条件下持续培养,观察培养液混池度变化以及海带残留情况。以寡营养2216培养基替代天然海水，同样加入适量新鲜海带块 (200 g/l)，121°C，30 min灭菌后，按10%接种量从上述有海带降解效果的摇瓶中取培养液转接，在相同条件下培养至海带降解，并如此重复转接2-3代至获取具有稳定降解效果的菌群。以2216平板对上述菌群进行菌株的分离纯化，并以冻干管形式保藏，以褐藻胶2216 平板进行产酶菌株的筛选，其中，产酶菌株ZJU HZ22保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 5324。寡营养2216培养基即将2216培养基中的peptone成分降至I g/1。褐藻胶2216培养基补加10 g/1褐藻酸钠的2216培养基。实施例2 :菌株sp. ZJU HZ22 (CGMCC No. 5324)的 16S rRNA 基因的扩增、序列测定与分析
菌株ZJU HZ22划线于2216斜面，28°C培养至形成菌苔。无菌接种环刮取一环菌体置于I. 5 ml无菌离心管中，采用细菌基因组快速抽提试剂盒(东胜生物)抽提基因组DNA，作为模板直接用于PCR。扩增16S rRNA基因的通用引物如下
正向引物5’_ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’ ；
反向引物5’_ ACGGTTACCTTGTTACGACTT -3’ ；
上述引物分别对应大肠杆菌16S rRNA基因的8-27和1510-1492位碱基。50 u I PCR 反应体系为10Xbuffer 5 u 1,10 mM dNTPs I U 1,4 iiM 引物各 I iil，ddH20 42 u L, Taq 酶 0.5 U I (2.5 U)，DNA 模板 0.5 U I (10-100 ng)。PCR 反应条件为94°C变性 5 min;95°C变性 30 s，55°C退火 30 s，72°C延伸 75 s ;33 个循环后 72°C后延伸 10 min。获得的PCR产物经过胶回收试剂盒(Axygen)纯化后与TA克隆载体连接(pMD 19-T Vector Kit, TaKaRa),连接液转化感受态细胞(TransGen Biotech)后,挑取阳性克隆送测。 序列测定由生工生物工程(上海)有限公司完成。菌株ZJU HZ22的16S rRNA基因的全长序列为1479 nt (详见序列表)。采用 EzTaxon Server提供的全局比对工具进行序列的相似性分析，结果表明，ZJU HZ22与菌株 Tamlanaagarivorans Jff-26 (T)有最高的序列相似性(96. 834%),与Tamlaim属另一个种的标准菌株HST1-43 (T)的序列相似性为94. 872%。采用Mega 5. 0进行相关16S rDNA序列间的多序列比对和系统发育关系分析，结果表明，ZJU HZ22在系统发育树上与Trnilma属的标准菌株处于同一个进化分支。综合上述两项分析结果，可将菌株ZJU HZ22划分至TmilBim属。此外，基于ZJU HZ22的16S rDNA序列相似性均低于97%这一新种评估的黄金分割值，同时其在系统发育树上与其他Taml觀菌株的进化距离亦已达到种间差异，因此认为，菌株ZJU HZ22代表了 Tsmlsrm属的一个新种。实施例3 :菌株sp. ZJU HZ22 (CGMCC No. 5324)的形态及生理学特性
鉴定
用于鉴定的菌株ZJU HZ22均接种于2216培养基，制备固体培养基时可再加入15 g/1 的琼脂，121°C灭菌30 min。经平板划线培养获取单菌落，同时挑取菌落制备菌悬液，涂布载玻片进行镜检，结果表明，该菌株具有以下形态特征(I)菌落形态菌落呈圆形，表面光滑，蜡状光泽，凸起， 边缘平整，半透明，呈亮黄色。(2)细胞形态革兰氏阴性菌，光学显微镜(Olympus，BX40) 下呈典型杆状细胞，单个排列，中间裂殖。以2216为基础培养基，根据《常见细菌系统鉴定手册》进行生理学特性的鉴定， 结果表明，该菌株具有以下生理生化特征严格好氧，最适生长温度28-32°C，最适生长pH
7.0-7. 5，最适生长海盐(sea salt)浓度2%，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，褐藻胶裂解酶阳性，果胶酶阴性，淀粉酶阴性，纤维素酶阴性。实施例4 :褐藻胶裂解酶ALG22的制备
将产酶菌株sp. ZJU HZ22 (CGMCC No. 5324)的斜面培养物(4°C保存)接种至2216培养基中，于28°C，120 rpm条件下培养14-16小时至对数生长期，再以O. 2%的接种量转接发酵培养基，发酵培养基可采用海藻酸钠2216培养基或者直接使用成本较低的海带2216培养基，前者200 ml培养基/500 ml装液量，28°C，120 rpm条件下培养48小时左右，后者相同条件下培养36小时左右。当采用海带2216培养基进行发酵时，菌株Tamlana sp. ZJU HZ22可造成海带藻体的降解(图12)，因此可通过海带残体的观察直观地控制发酵产酶的时间。发酵液经高速离心获取上清液，即褐藻胶裂解酶酶液。图12中图A :菌株ZJU HZ22的海带2216发酵培养液，图B :空白的海带2216发酵培养基。海藻酸钠2216培养基补加4 g/Ι褐藻酸钠的2216培养基，pH 7. O。海带2216培养基2216培养基的基础盐溶液(即不含peptone及yeast extract 配方)1000 ml,新鲜海带块 200 g, peptone I g, yeast extract O. 5 g，pH 7.0。实施例5 :褐藻胶裂解酶ALG22的酶学特性评估
选取海藻酸钠2216培养基按上述方法制备新鲜酶液，对其进行最适反应条件、耐盐性以及低温保存稳定性的评估。酶活测定采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法。酶反应体系为2 ml酶液+ I. 2 ml O. 8%海藻酸钠溶液(1/15N磷酸盐缓冲液现配，pH 7. 5)+ 0.8 ml 1/15N磷酸盐缓冲液(pH 7. 5)，测定最适反应pH时，需同时采用1/15N碳酸盐缓冲液。酶活测定方法为将反应体系混匀后立即置于设定温度下温育I小时；加入2ml DNS试剂混匀后立即转入沸水浴处理20 min ;体系冷却后于540 nm处测定吸光度。经沸水浴预处理20 min的失活酶液作为酶活测定的阴性对照。每分钟催化底物水解生成I μ g还原糖所需的酶量定义为I个酶活力单位(U)。评估结果表明，ALG22的最适反应条件为40_50°C，pH 7. 0-8. 0,15-30 mM MgCl2 (换算成总Mg2+浓度约为60-75 mM，即包括发酵培养基中的Mg2+)。在上述发酵条件以及最适反应条件下获得的酶活为11-12 U/ml。此外，ALG22能够耐受O. 75 M的NaCl (换算成总NaCl浓度约为O. 94 M，即包括发酵培养基中的NaCl)。在2216培养基的盐浓度下，ALG22在4°C保存条件下的酶活半衰期约为96小时，其中，前48小时的酶活基本不变。
权利要求
1.一株产生褐藻胶裂解酶的菌株，分类命名为sp.，保藏号为CGMCC No. 5324，保藏日2011年10月14日，菌株名称ZJU HZ22。
2.一种根据权利要求I所述菌株发酵制备褐藻胶裂解酶的方法，通过以下步骤实现(1)将菌株的斜面培养物接种至种子培养基中，于28-32°C、120rpm条件下培养14-16 小时至对数生长期，得种子液；(2)生长良好的种子液以O.2%的接种量转接发酵培养基，相同条件下培养48小时，得发酵液；(3)发酵液经高速离心获取上清液，此即褐藻胶裂解酶酶液；步骤(I)所述种子培养基为marine broth 2216,配方如下蛋白胨5 g,酵母抽提物I g,柠檬酸铁O. I g,氯化钠19. 45 g,六水合氯化镁12. 6 g,七水合硫酸镁6. 64 g,氯化隹丐L 8 g,氯化钾O. 55 g,碳酸氢钠O. 16 g,溴化钾O. 08 g,六水合氯化银57. 00 mg, 硼酸22. 00 mg,九水合硅酸钠9. 30 mg,氟化钠2. 40 mg,硝酸铵2. 40 mg,磷酸氢二钠8.00 mg, pH 7. 0-7. 5 ；步骤(2)所述发酵培养基为含O. 4%海藻酸钠的2216培养基，其中，海藻酸钠作为提高褐藻胶裂解酶分泌量的刺激底物，发酵体系按200 ml培养基/500 ml摇瓶比例设置，于 28°C，120 rpm条件下培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵液于12000g X 10 min离心去除菌体。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述种子培养基直接选用生物公司外售的marine broth 2216,或者由生物公司外售的sea salt代替上述无机盐成分配制。
全文摘要
产生褐藻胶裂解酶的菌株及其发酵方法。本发明提供产生褐藻胶裂解酶的菌株，分类命名为Tamlanasp.，菌株名称ZJUHZ22，保藏号CGMCCNo.5324，保藏日2011年10月14日。该菌株在没有诱导底物的情况下能本底表达褐藻胶裂解酶，并可通过底物刺激的方法提高表达量，本发明提供的发酵方法简便，菌株CGMCCNo.5324产生的褐藻胶裂解酶ALG22为胞外酶，所产褐藻胶裂解酶ALG22具有突出的耐盐性，发酵液经简单的除菌处理即可获得显著且稳定的酶活性，既可直接应用于褐藻胶降解，也易于进一步分离纯化，在褐藻胶降解以及褐藻寡糖的制取中具有应用潜力。
文档编号C12N9/88GK102586150SQ20121005338
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月3日 优先权日2012年3月3日
发明者吴敏, 张心齐, 柏超, 迟方涛, 郑刚 申请人:浙江大学舟山海洋研究中心