专利名称：用于检测转基因玉米mir162的特异性引物、探针及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及探针，及其在基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件中的应用，属于分子生物学领域。
背景技术：
90年代初，市场上第一个转基因食品出现在美国，是一种保鲜番茄。随后十几年， 转基因产产品陆续诞生，尤其在食品、医药方面取得很大成绩。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，相继有40多个国家和地区建立和实施了转基因标识制度。随着这些制度的建立与不断完善，人们对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格的要求，各种转基因产品的检测技术也成为了研究热点。根据不同转基因产品的检测目的不同，鉴定转基因产品的主要方式有筛查法、基因特异性检测方法、转化体特异性检测方法和构建特异性检测方法。其中转化体特异性检测是特异性最强，应用最多的检测方法。从技术层面讲，在上述检测中应用最多的是PCR技术，包括定性PCR、巢式PCR、复合PCR、竞争性定量PCR和荧光定量PCR等。转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫品种。申请人经过对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因玉米MIR162转化体特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及探针，及其在基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件中的应用，属于分子生物学领域。本发明是通过以下技术方案实现的—种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，其序列为MIR162-F 5/ -CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；MIR162-R 5/ -GTGACTCCCTTAATTCTC-3'；如SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示。所述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物可以用于定性检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件，具体应用时，步骤为(I)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用MIR162-F和MIR162-R引物组合进行PCR扩增；(2) PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品中含有MIR162转化事件；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有MIR162转化事件。所述步骤(I)中，PCR程序为95°C 5min 预变性；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C延伸7min。所述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物可以用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件，具体应用时，步骤为(I)建立MIR162转化体特异性引物的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162转化事件的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162转化事件的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线；(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后， 测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米 MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。所述步骤⑴①和⑵中，zSSIIb引物序列(国家标准)如下zSSIIb-F 5/ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；zSSIIb-R 5/ -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'。所述步骤⑴①和⑵中，扩增的参数如下扩增反应体积为20uL，2XPremix Ex Taq (Rox) IOuL,浓度为 10umol/L 的 Forward primer O. 4uL,浓度为 10umol/L 的 Reverse primerO. 4uL, ddH20 8. 2uL, DNA 模板 IuL ；扩增反应条件95°CIOmin 预变性；95°C 15s,50°C 30s,72°C 30s，在 72°C收集荧光信号，共计40个循环。一种用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，序列为MIR162-P :FAM-5' -C AGATTGTCGTTTCCCGCCTTC-3' -Eclipse，如 SEQ ID NO. 3所示，探针的 5'端连接一个荧光报告集团FAM，3'端连接有一个荧光淬灭集团Eclipse。上述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，可以用于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有 MIR162转化事件，具体应用时，步骤为(I)建立MIR162转化体特异性引物的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和 zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162转化事件的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162转化事件的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线；(2)提取待检测样品基因组DNA,得基因组DNA提取液,然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。所述步骤⑴①和⑵中，zSSIIb引物和探针序列(国家标准)如下zSSIIb-F 5/ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；zSSIIb-R 5/ -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'；zSSIIb-P FAM-5/ -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3' -TAMRA。所述步骤⑴①和⑵中，扩增的参数如下扩增反应体积为20uL, 2XPremix Ex Taq (Rox) 12. 5uL,浓度为 10umol/L 的 Forward primer IuL,浓度为 10umol/L 的 Reverse primer IuL,浓度为 lOumol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ；扩增反应条件95°CIOmin 预变性；95°C 15s,50°C 30s,72°C 30s，在 72°C收集荧光信号，共计45个循环。本发明设计了针对转基因玉米MIR162转化事件外源插入载体旁侧基因的引物与探针序列，建立了转基因玉米MIR162转化体特异性定性PCR检测方法、SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法经实验验证，灵敏、准确、简单、可靠，具有广阔的应用价值与市场前景。
图I为实施例I中转基因玉米MIR162转化体特异性定性PCR扩增结果电泳示意图。图2为实施例2中内标准基因zSSIIb的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。图3为实施例2中转基因玉米MIR162转化体SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。图4为实施例3中内标准基因zSSIIb的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。图5为实施例3中转基因玉米MIR162转化体TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步的说明。实施例I转基因玉米MIR162转化体特异性定性PCR检测方法引物由大连Takara公司合成,稀释成10umol/L备用。合成的引物序列如下MIR162-F 5/ -CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；
MIR162-R 5/ -GTGACTCCCTTAATTCTC-3'。分别提取转基因玉米MIR162、M0N810、NK603、Btl76、M0N88017、GA21、TC1507、 MIR604、Btll,转基因大豆GTS40-3-2、M0N87701,非转基因大豆1138-2，转基因棉花 M0N88913、LLcotton25、M0N531、M0N1445，转基因水稻TT51、科丰6号，非转基因玉米郑单 958基因DNA为模板，分别用MIR162-F和MIR162-R引物组合进行PCR扩增。PCR程序为 950C 5min 预变性；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s, 35 个循环；72°C延伸 7min。PCR 扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。结果利用所设计的引物以提取的基因组为模板进行PCR扩增，结果如图I所示， 由图可见，只有转基因玉米MIR162基因组成功扩增出94bp特异性产物，而其他转基因和非转基因样品模板都没有可观察到的扩增产物。由此证明，该引物具有良好的特异性，适合于转基因玉米MIR162转化体特异性的定性检测。实施例2转基因玉米MIR162转化体特异性SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA，按5倍倍比分别稀释至5°，5—1，5_2，5_3， 5^4 ;相应的拷贝数设为100000，20000，4000，800，160，每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。引物由大连Takara公司合成,稀释成10umol/L备用。合成的MIR162引物序列如下MIR162-F 5/ -CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；MIR162-R 5/ -GTGACTCCCTTAATTCTC-3'。玉米内标引物(zSSIIb)采用国家标准引物，其序列如下zSSIIb-F 5/ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；zSSIIb-R 5/ -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'。扩增反应体积为20uL, 2 XPremix Ex Taq (Rox) IOuL,浓度为 10umol/L 的 Forward primerO. 4uL,浓度为 10umol/L 的 Reverse primer 0. 4uL, ddH20 8. 2uL, DNA 模板 luL。扩增反应条件95°C IOmin预变性；95°C 15s，50。。30s, 72°C 30s，在72°C收集荧光信号，共计 45个循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水(ddH20，空白)和非转基因样品(郑单958，阴性)对照。结果通过对不同MIR162标准品拷贝数为100000，20000，4000，800，160的DNA进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因玉米MIR162标准Bnn (1%,0.5%,0. I %, 0. 05 %, 0. 01 % ) 性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MIR162的转化体特异性引物对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图2所示，该曲线的斜率为-3. 25，相关系数R2为0. 999。转基因玉米MIR162的转化体特异性引物的标准曲线如图3所示，该曲线的斜率为-3. 332，相关系数R2为0.999.因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式
样品中转基因玉米MIR162含量=(外源基因MIR162拷贝数/内标基因zSSIIb 拷贝数)X 100%可以计算出待测样品中转基因成分MIR162的百分含量。实施例3转基因玉米MIR162转化体特异性TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA，按5倍倍比分别稀释至5°，5—1，5_2，5_3， 5^4 ;相应的拷贝数设为100000，20000，4000，800，160，每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。引物和探针由大连Takara公司合成,稀释成10umol/L备用。合成的MIR162引物与探针序列如下MIR162-F 5/ -CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；MIR162-R 5/ -GTGACTCCCTTAATTCTC-3'；MIR162-P FAM-5/ -CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTC-3' -Eclipse。玉米内标引物与探针(zSSIIb)采用国家标准引物与探针，其序列如下zSSIIb-F 5/ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；zSSIIb-R 5/ -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'；zSSIIb-P FAM-5/ -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3' -TAMRA。扩增反应体积为20uL, 2 X Premix Ex Taq (Rox) 12. 5uL,浓度为 10umol/L 的 Forwardprimer IuL,浓度为 10umol/L 的 Reverse primer IuL,浓度为 10umol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ;扩增反应条件95 °C IOmin 预变性；95 °C 15s, 50°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集荧光信号，共计45个循环，每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水(ddH20，空白)和非转基因样品(郑单958，阴性)对照。结果通过对不同MIR162标准品拷贝数为100000，20000，4000，800，160的DNA进行TaqMan实时突光定量PCR扩增,计算机软件自动生成标准曲线,纵坐标为Ct,横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因玉米MIR162标准Bnn (I%,0.5%,0. I%,0.05%,0.01% ) 性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MIR162的转化体特异性引物对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，分别得到 PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图 4所示，该曲线的斜率为-3. 557，相关系数R2为0. 999。转基因玉米MIR162的转化体特异性引物的标准曲线如图5所示，该曲线的斜率为-3. 556，相关系数R2为0.997.因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式样品中转基因玉米MIR162含量=(外源基因MIR162拷贝数/内标基因zSSIIb 拷贝数)X 100%可以计算出待测样品中转基因成分MIR162的百分含量。以上结果可以证明，本发明为转基因玉米MIR162的定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测提供了简单、可靠的测定方法，可以用于转基因玉米MIR162的检测。本发明为转基因标识提供了一种强有力的技术支撑，为转基因产品的控制提供了必要的手段。
权利要求
1.一种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，其特征在于所述引物由上游引物和下游引物组成，其序列如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示。
2.权利要求I所述的用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物在定性检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件中的应用。
3.权利要求I所述的用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物在SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件中的应用。
4.一种用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，其特征在于所述探针的序列如 SEQ ID NO. 3所示，探针的5'端连接一个荧光报告集团FAM，3'端连接有一个荧光淬灭集团 Eclipse。
5.权利要求I所述的用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及权利要求4所述的用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针在TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件中的应用。
6.一种定性检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件的方法，其特征在于步骤为(1)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用MIR162-F和MIR162-R引物组合进行PCR扩增；(2)PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品中含有MIR162转化事件；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有MIR162转化事件。
7.一种SYBR Green I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件的方法，其特征在于步骤为(1)建立MIR162转化体特异性引物的SYBRGreen I实时荧光定量PCR标准曲线和 zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入 MIR162转化事件的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162转化事件的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线.(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR 标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162 基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤⑴①和⑵中，扩增的参数如下:扩增反应体积为 20uL, 2XPremix Ex Taq(Rox) IOuL,浓度为 10umol/L 的 Forward primer 0.4uL,浓度为 lOumol/L 的 Reverse primer 0. 4uL, ddH20 8. 2uL, DNA 模板 IuL ;扩增反应条件95°C IOmin预变性；95°C 15s，50。。30s, 72°C 30s，在72°C收集荧光信号，共计 40个循环。
9.一种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件的方法，其特征在于步骤为(1)建立MIR162转化体特异性引物的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和 zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入 MIR162转化事件的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162转化事件的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线.(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤(I)①和(2)中，扩增的参数如下扩增反应体积为20uL,2XPremix Ex Taq(Rox) 12. 5uL,浓度为10umol/L的 Forward primer IuL,浓度为 10umol/L 的 Reverse primer IuL,浓度为 lOumol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ；扩增反应条件95°C IOmin预变性；95°C 15s, 50°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集荧光信号，共计45个循环。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5′端连接一个荧光报告集团FAM，3′端连接有一个荧光淬灭集团Eclipse。本发明还公开了利用该引物和探针进行基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件的检测方法，该检测方法经实验验证，灵敏、准确、简单、可靠，具有广阔的应用价值与市场前景。
文档编号C12Q1/68GK102586442SQ20121005359
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者孙红炜, 张广远, 李凡, 杨淑珂, 路兴波 申请人:山东省农业科学院植物保护研究所