专利名称：一种鹅血红素提取方法
技术领域：
本发明属于血红素制备技术领域，具体涉及一种鹅血红素的提取方法。
背景技术：
血红素(分子式=C34H32N4FeO4)是血红蛋白、肌红蛋白、红细胞的辅基，是重要的天然卟啉铁化合物。动物机体中的铁大约70%以血红素的形式存在，其功能是血液输送氧气和二氧化碳的物质，它和蛋白质结合成血红蛋白，是一种生物铁，是人体缺铁性贫血的天然补血铁剂，很容易被吸收，对缺铁人群具有重要的保健功能。在畜禽肉类加工过程中会有大量血液产生，这些血液作为副产品目前多数被用作饲料、食用或被废弃，造成大量优质资源浪费甚至间接环境的污染。有资料报道，鹅血富含蛋白质、矿物质及抗癌因子等。然而，目 前国内外对鹅血有效活性物质和功能缺乏深入研究，从鹅血中直接提取血红素技术还处于空白，市场上也没有鹅血红素产品，为此，对该产品的开发利用具有重要意义和市场发展前
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发明内容
本发明的目的是提供一种鹅血红素的提取方法，即采用酶解法制备鹅血红素，以填补目前该方面的空白。申请人:通过长时间的研究，经过各种因素的筛选，确定出酶解法制备鹅血红素的最佳工艺条件。本发明的鹅血红素制备方法，包括血球粉的制备和酶解处理步骤I)血球粉的制备首先收集鹅血中的红细胞，再用NaCl溶液洗涤红细胞，然后将红细胞真空冷冻干燥完成血球粉的制备；2)酶解处理将制备的血球粉用水溶解后制成血球粉溶液，加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，酶解液即为鹅血红素溶液。上述步骤I)中NaCl溶液的质量体积百分比浓度为O. 9% ;真空冷冻干燥的条件为-2(TC -45°C、20Pa lOOPa。上述步骤2)中碱性蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1:1 3。上述步骤2)中碱性蛋白酶和风味蛋白酶在酶解液中的加入量为3°/Γ4%。上述步骤2)中酶解温度为45°C 55°C，酶解时间为3. 5h 4. 5h血球粉的浓度为O. Γ0. 2g/mL。上述步骤2)所得酶解液用截留分子量为lkDa 14kDa孔径的透析袋进行低温下透析即可得到鹅血红素含量更高的产品。本发明采用了真空冷冻干燥法，避免了血球粉制备过程中与氧的接触，有效防止了在制备过程中血红素的损耗，避免了现有方法温度过高的缺点。离心后鹅血球制成血球粉后，克服血液本身易氧化变质的缺陷，有效防止了加工过程中血红素的损耗，其稳定性及方便性均得到一定提高，大大延长了产品的货架期，有利于保持血红素的活性。而采用酶解法提取血红素避免了传统有机溶剂法带来的化学污染，有利于鹅血红素在食品方面的进一步加工，填补了鹅血红素提取技术方面的空白，为鹅血红素生产工艺提供科学的参考。
图I :本发明中单酶酶解温度与酶解时间交互作用响应面图；图2 :本发明中双酶酶解时间与酶用量交互作用响应面图。
具体实施例方式本发明采用酶解的方法制备鹅血红素微胶囊，分别以不同比例的碱性蛋白酶和风味蛋白酶为肽链内切酶和肽链外切酶。以酶解液中血红素含量为响应值，酶解时间、酶用量和酶总量比为响应因子，设计响应面试验，得到制备鹅血红素的最佳工艺条件。 本发明的制备方法，包括如下的步骤I)血球粉的制备首先收集鹅血中的红细胞，再用NaCl溶液洗涤红细胞，离心后将红细胞真空冷冻干燥完成血球粉的制备；真空冷冻干燥处理中，样品于-40°C预冷，这是因为根据热力学中的相平衡理论，水的三相点(汽、液、固三相共存)温度为O. 0098°C，三相点压力为609. 3pa(4. 57mmHg)在水的相变过程中，当压力低于三相点压力时，固态冰可以直接转化为气态的水蒸气即冰晶升华。真空冷冻干燥即是把含有大量水的物质预先冷冻，使物质中的游离水结晶，冻结成固体，然后在高真空条件下使物质中的冰晶升华，待冰晶升华后再除去物质中部分吸附水，最终得到残余水量为1°/Γ4%左右的干制品。在冷冻干燥前必须将物料进行彻底冷冻才能实现，如物料冷冻不完全，干燥处理中会出现大量泡沫，这会严重阻碍水分的升华。2)酶解法提取鹅血红素将制备的血球粉用水溶解后制成血球粉溶液，加入蛋白酶进行酶解，酶解液即为鹅血红素溶液；经过单酶的筛选，双酶酶解的筛选，最终通过单酶和双酶酶解效果之间的比较，最终选取最佳酶解方法。碱性蛋白酶与风味蛋白酶分别作为肽链内切酶和肽链外切酶逐步发生酶解反应，水解程度将得到提高，经外肽酶催化的血红蛋白水解形成低分子量多肽和氨基酸，这种小分子物质可以不管疏水相互作用而通过透析膜。因此，所得酶解液可再用截留分子量为lkDa 14kDa孔径大小的透析袋，低温下透析即可得到鹅血红素含量更高的产品。下面结合实施案例对本发明的方法进行详细描述。实施例I :单酶最佳工艺的筛选I)鹅血球粉的制备收集检疫合格的16周龄肝用型青农灰鹅的新鲜鹅血50ml于离心管，在3000r/min条件下离心15min，收集红细胞。将收集的红细胞用O. 9%的NaCl溶液洗涤红细胞，同条件离心，重复2次；最后将血球在_30°C -45°C、20Pa IOOPa条件下冷冻干燥得血球粉20g ；可以将血球粉密封包装于干燥器内备用。2)标准曲线的绘制血红素标准溶液鹅血红素标准品16. 0±0. Img,置于IOOmL容量瓶中，加O. Imol/L NaOH溶液适量使完全溶解后，再用O. lmol/L NaOH溶液稀释至刻度，摇匀得标准液。取10支具塞试管，分别加入血红素标准溶液，精密量取血红素标准液0、0. 1,0. 2、O. 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、I. OmL,用 O. lmol/L 的 NaOH 溶液定容于 IOOmL 容量瓶，摇匀，以O. lmol/L的NaOH溶液为空白，在383nm波长处测定其吸光值，通过OriginPro 8. 5. I软件拟合标准曲线。3)单酶单因素酶解试验取一定量血粉，放入锥形瓶中，加入一定量蒸馏水摇匀，超声波溶血，再加入一定量的蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)，在恒温水浴中酶解一定时间，383nm波长处测定其吸光值，根据所得指标高低，选取最佳酶。①酶解温度对鹅血红素提取的影响试验结果表明，温度对提取鹅血红素的影响比较显著。随着温度的升高，吸光值呈上升趋势，其中碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶解效果占优。当温度分别超过各自最适温度之后，因为酶失活导致酶解效果的下降，吸光值开始降低，并且当温度超过60°C时，血红蛋 白明显变性，呈果冻状，不利于酶解的进行。②酶解时间对鹅血红素提取的影响试验结果表明，每一种酶在开始阶段，吸光值升高趋势明显，当时间延长至最佳酶解时间后，吸光值不再上升，相反还有一定下降趋势，说明酶解达到平衡。根据吸光值的高低，可以看出碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶解效果要优于其余三种酶。③酶用量对鹅血红素提取的影响试验结果表明，碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶解效果优于其它。随着酶用量的增力口，吸光值有所升高，但是酶用量对酶解效果的影响作用不大，而且当酶用量超过一定量时，还会对酶解起到反作用。④底物浓度对鹅血红素提取的影响试验结果表明，底物浓度的增加有助于反应的进行，对提取血红素的影响比较显著，但底物浓度过大，也会因液相黏度过大而阻碍反应的进行。同时也可以清晰的发现，碱性蛋白酶的酶解效果最佳。⑤pH对鹅血红素提取的影响试验结果表明,pH对鹅血红素提取的有影响,但在最适pH范围内，影响效果不大。同时，根据数据发现，碱性蛋白酶是单酶酶解的最佳选择。4)单酶酶解响应面试验以酶解温度、酶解时间和底物浓度为自变量，血红素含量为响应值，进行Box-Behnken设计,利用Design Expert 8. 06软件进行响应面分析,建立回归模型。在单因素试验的基础上，确定最佳工艺。响应面试验方案及结果如下表I响应面优化设计试验数据
权利要求
1.一种鹅血红素提取方法，其特征在于，包括血球粉制备和酶解处理步骤 1)血球粉制备首先收集鹅血中的红细胞，再用NaCl溶液洗涤红细胞，然后将红细胞真空冷冻干燥完成血球粉的制备； 2)酶解处理将制备的血球粉用水溶解后制成血球粉溶液，加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，酶解液即为鹅血红素溶液。
2.如权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤I)中NaCl溶液的浓度为O.9%。
3.如权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤I)中真空冷冻干燥的条件为-2(TC -45°C、20Pa lOOPa。
4.如权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤2)中碱性蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为I: I 3。
5.如权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤2)中碱性蛋白酶和风味蛋白酶在酶解液中的加入量为3°/Γ4%。
6.如权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤2)中酶解温度为45°C 55°C，酶解时间为3. 5h 4. 5h。
7.如权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤2)中血球粉的浓度为O.1^0. 2g/mL。
8.如权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤2)中制备的酶解液用截留分子量为lkDa 14kDa孔径的透析袋进行低温下透析。
全文摘要
本发明涉及一种鹅血红素的提取方法，包括血球粉的制备和酶解处理步骤，其中酶解处理是用碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解。本发明采用了真空冷冻干燥法，避免了血球粉制备过程中与氧的接触，有效防止了在制备过程中血红素的损耗，避免了现有方法温度过高的缺点。离心后鹅血球制成血球粉后，克服血液本身易氧化变质的缺陷，有效防止了加工过程中血红素的损耗，其稳定性及方便性均得到一定提高，大大延长了产品的货架期，有利于保持血红素的活性。而采用酶解法提取血红素避免了传统有机溶剂法带来的化学污染，有利于鹅血红素在食品方面的进一步加工，填补了鹅血红素提取技术方面的空白，为鹅血红素生产工艺提供科学的参考。
文档编号C12P17/18GK102876747SQ20121039598
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者王宝维, 高顺, 葛文华, 张名爱, 岳斌 申请人:青岛农业大学