专利名称：：次血红素短肽化合物在抗脑缺血药物制备中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明提供一种次血红素短肽化合物新的医药用途，即在抗脑缺血药物制备中的应用，属于生物制药
技术领域：
。技术背景本发明涉及的次血红素短肽化合物包括次血红素(Deuterohemin，用Dh表示)、短肽(用e-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys表示，命名为D1)。它是以铁卟啉为辅基的微过氧化物酶，具有预防和治疗早期白内障的医疗作用。
发明内容本发明提供了次血红素短肽化合物在抗脑缺血药物制备中的用途，用于治疗脑缺血及脑出血后脑损伤疾病。本发明中化合物的制备方法以本领域技术人员所通常的Fmoc固相肽合成法合成。药理实验证明本发明具有治疗脑缺血相关疾病的药理活性，见如下实验例次血红素短肽化合物Dl对脑缺血及脑出血后脑损伤保护作用的实验资料实验例l:Dl对脑缺血保护作用摘要通过建立大鼠脑缺血模型，观察Dl三个剂量(1.0mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg)的抗脑缺血作用，结果表明，Dl对脑缺血具有抑制作用。与模型组比较D1高剂量组能明显提高血浆及脑组织超氧化物歧化酶SOD的活性(P<0.05，PO.05),D1高、中剂量组明显降低MDA的含量(PO.Ol，P<0.05)。目的通过大鼠实验性脑缺血的实验，观察D1抑制大鼠脑缺血作用，为其应用提供药效学试验的实验室依据。一、材料与方法l试验材料l.l试验药品与试剂Dl，由吉林大学生命科学院提供；丹参注射液，由由正大青春药业有限公司生产,批号0709135;LDH试剂盒南京建成生物工程研究所生产，批号:20080910;SOD试剂盒:南京建成生物工程研究所生产，批号20080910;MDA试剂盒南京建成生物工程研究所生产，批号20080910;CK试剂盒南京建成生物工程研究所生产，批号200809101.2试验动物健康wistar大鼠，56只，体重250280g，由吉林大学实验动物中心提供。1.3实验仪器紫外分光光度计755B型，上海精密科学仪器有限公司生产；电子天平ESJ60-4型，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司生产；索孚D-37520型超速冷冻离心机德国产；529型电热三用水箱北京医疗设备厂生产；DY89-II型电动玻璃匀浆机宁波新芝生物科技股份有限公司生产。2、试验方法大鼠不完全脑缺血损伤模型的制备及分组56只大鼠，雄性，按体重随机分为7组，每组8只，即正常组、假手术组、模型组、阳性对照药丹参注射液组(3.6ml/kg)、注射用测试药D1大剂量组(lmg/kg)、中剂量组(0.3mg/kg)、小剂量组(0.1mg/kg)。每天腹腔注射一次药物(lml/100g)，前三组给于生理盐水，连续三曰。末次给药后lh,各组大鼠给于10。/。水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，颈部手术，用丝线结扎双侧颈总动脉造成急性不完全脑缺血模型，正常组不做任何处理，假手术组不结扎动脉。二、试验结果1、注射用Dl对脑缺血大鼠脑组织中SOD活性、MDA含量的影响与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中SOD活性明显降低(PO.001);MDA明显增加(PO.Ol)。与模型组比较，注射用Dl高剂量组SOD活性均明显升高(PO.01);注射用D1高、中剂量组MDA含量明显下降(PO.Ol，PO.05);与模型组比较阳性药丹参注射液组SOD活性明显升高(PO.05);MDA含量明显下降(PO.05)，结果见表1。表l注射用D1对脑缺血大鼠脑组织中SOD活性、MDA含量的影响(x士S，n-6)组别剂量MDASOD空白对照组1.29±0.08194.45±17.74假手术1.33±0.14188.31±9.76模型组2.01±0.40AA69.28土19.09織阳性药组3.6ml/kg1.53±0.20*97.60±22.51*Dl高剂量1.0mg/kg1.34土0.16**114.97i29.il**Dl中剂量0.3g/kg1.46±0.38*73.50±20.97<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>与假手术组比较AAAP0.001;与模型组比较"P〈0.01,PO.05.2、注射用Dl对脑缺血大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影响与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中SOD活性明显降低(PO.01);MDA含量明显增加(PO.01)。与模型组比较，注射用Dl高剂量组SOD活性均明显升高(P0.05);注射用Dl高、中、低剂量组MDA含量明显下降(PO.01，PO.01,PO.05);阳性药丹参注射液组SOD活性明显升高(PO.05);MDA与模型组比较明显下降(PO.01)，结果见表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>与假手术组比较AAP0.01;与模型组比较"PO.01浐PO.05.3、注射用Dl对完全脑缺血损伤大鼠血清CK和LDH活性的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清中CK和LDH含量显著升高，具有显著性差异(PO.Ol，PO.05);与模型组比较，注射用D1大剂量组明显降低大鼠血清中CK和LDH的含量，具有显著性差异(P<0.05，P<0.05)，阳性对照药丹参注射液能明显降低大鼠血清中CK和LDH的含量，具有显著性差异(P<0.05，PO.01)，结果见表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>阳性药组3.6ml/kg4243.95±401.38**0.68±0.19*Dl高剂量1.0mg/kg4394.79±514.72*0.58±0.28*Dl中剂量0.3g/kg4545.62±631.640.86±0,40Dl低剂量0.1g/kg4720.67±751.210.89±0.32与假手术组比较^P〈0.01，AP<0.05;与模型组比较^PO.01,PO.05.实验例2:Dl对脑出血后脑损伤的保护作用摘要通过建立大鼠脑出血模型，观察Dl三个剂量(1.0mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg)对脑出血后脑损伤的保护作用，结果表明，Dl对脑出血后脑损伤具有保护作用。与模型组比较D1各剂量组均能显著改善脑出血大鼠的神经功能缺损症状(PO.001,PO.01，PO.05),D1高、中剂量组脑系数明显下降(PO.Ol，P〈0.05)'Dl高剂量组能明显抑制大鼠脑出血后血浆及脑组织中NO的升高(P<0.05)，并能明显提高血浆及脑组织超氧化物歧化酶SOD的活性(PO.05),降低MDA的含量(P<0.01)。目的通过大鼠实验性脑出血的实验，观察D1保护大鼠脑出血后脑损伤的作用，为其应用提供药效学试验的实验室依据。一、材料与方法1、试验材料1.1试验药品与试剂Dl，由吉林大学生命科学院提供；丹参注射液，由正大青春药业有限公司生产,批号0709135;磷酸锌水门汀由上海牙科器械有限公司生产，批号200510;SOD试剂盒:南京建成生物工程研究所生产，批号:20080910;MDA试剂盒南京建成生物工程研究所生产，批号:20080910;NO试剂盒南京建成生物工程研究所生产，批号:20080924。1.2试验动物wistar大鼠，雄性，80只，体重250280g，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，动物合格证号SCXK(吉)2003—0001。1.3实验仪器紫外分光光度计755B型，上海精密科学仪器有限公司生产；立体定位仪03-816-0757型，日本产；台式牙钻车SER.NO.75.7.1440，上海产；电子天平ESJ60-4型，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司生产；索孚D-37520型超速冷冻离心机德国产；529型电热三用水箱北京医疗设备厂生产；50微升微量注射仪上海医用激光仪器总厂生产；DY89-II型电动玻璃匀浆机宁波新芝生物科技股份有限公司生产2、试验方法取wistar大鼠80只，模型成功者56只大鼠(神经行为评分>1)纳入试验，随机分为7组，分别为生理盐水对照组、假手术组、模型组、注射用Dl高剂量组(lmg/kg)、中剂量组(0.3mg/kg)、低剂量组(0.1mg/kg)及丹参注射液组(3.6ml/kg)。每组8只，6只用于生化指标测定，2只用于病理组织学观察。大鼠称重后以20。/。乌拉坦按照0.5ml/100g体重腹腔麻醉后俯卧位固定于立体定位仪上，头部正中皮肤切lcm纵切口，暴露前囟，调整立体定位仪，根据立体定位图谱，使其上的微量注射仪套管尖端定位于前囟前0.5mm，中线向右旁开3mm，用牙科微型电钻钻一直径lmm的圆孔，穿透颅骨但不伤透脑组织。剪尾取血，用微量注射仪吸取新鲜血液50ul，插入己钻好的孔内，向内进针6mm(相当于尾状核部位)。在2.5min内注入自体不凝血，留针3min后缓慢退针，颅孔用磷酸锌水门汀封闭。假手术组注入0.9%生理盐水50ul，盐水对照组不予任何处理。动物造模后，每天腹腔注射给药一次，给药容积为lml/kg，前3组为相同体积的生理盐水，于给药3d将大鼠麻醉，取血以及脑组织。二、试验结果1、注射用Dl对ICH大鼠神经功能评分的影响ICH大鼠各组均表现出明显的神经功能缺失症状，主要表现在提鼠尾可见其左前肢不能完全伸展。部分大鼠手术对侧的肢体瘫痪，出现运动旋转。部分肢体完全瘫痪无法行动及意识丧失。术后三天观察结果显示，与模型组比较，注射用D1各剂量组及丹参注射液组均能显著的改善脑出血大鼠的神经功能缺损症状(P<0.001,P<0.001，P<0.01)，见表l。表1Dl对ICH大鼠神经功能评分的影响(x±S，n=8)组别剂量评分空白对照组0假手术0.2±0.08模型组2.5±0.33AAA阳性药组3.6ml/kg1.6±0.21***Dl高剂量1.0mg/kg1.4土0.13***Dl中剂量0.3mg/kg1.5±0.24***Dl低剂量O.lmg/kg2.0±0.09**与假手术组比较AAAP0.001;与模型组比较"+PO.001;"PO.01.2、注射D1对ICH大鼠脑系数的影响大鼠脑出血后，造成周围脑组织受损，引起脑内水肿，直接导致脑系数的数值明显增加。与模型组比较，注射用D1高、中剂量组脑系数明显下降(P<0.01，P<0.05)，说明注射用D1具有抗脑水肿，实验结果见表2。表2注射用D1对ICH大鼠脑系数的影响(x±S，n=8)组别剂量脑系数(％)空白对照组0.68±0.035假手术0.69±0.22模型组0.74±0.10AAA阳性药组3.6ml/kg0.72±0.18*Dl高剂量1.0mg/kg0.72±0.13"Dl中剂量0.3mg/kg0.72±0.18*Dl低剂量O.lmg/kg0.73±0.13与假手术组比较AAAPO，001;与模型组比较"PO.01卢PO.05.3、注射用Dl对ICH大鼠脑组织中SOD活性、MDA以及NO含量的影响与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中SOD活性明显降低(PO.01);MDA以及NO含量明显增加(PO.Ol)。与模型组比较，注射用D1高剂量、中剂量组SOD活性明显升高(PO.Ol，PO.05);注射用Dl高剂量组MDA含量明显下降(PO.01);注射用D1高剂量、中剂量组NO含量也明显下降(P<0.05，PO.05);阳性药丹参注射液组SOD活性明显升高(P<0.01);MDA及NO含量与模型组比较明显下降(P<0.05，PO.Ol)，结果见表3。表3注射用Dl对ICH大鼠脑组织中SOD活性、MDA以及NO含量的影响(X±S，n=6)组别剂量MDASODNO空白对照组0.68士0.20126.69±23.843.53±0.91假手术0.77±0.25119.01±12.783.74±0.71模型组1.24±0.20AA91.21±12.78AA6.55±1.92AA阳性药组3.6ml/kg0.76±0.40*112.18±7.16**3.84±0.49**Dl高剂量l.Omg/kg0.68士0.33**110.01土10.08*4.09±0.90*Dl中剂量0.3mg/kg0.71±0.26107.28±18.134.25±0.73*Dl低剂量0.1mg/kgUl±0.26106.17±13.124.76±1.72与假手术组比较^PO.01:与模型组比较"P0.01,P<0.05.4、注射用D1对ICH大鼠血清中SOD活性、MDA以及NO含量的影响与假手术组比较，模型组大鼠脑组织屮SOD活性明显降低(PO.01);MDA以及NO含量明显增加(PO.OOl)。与模型组比较，注射用D1高剂量组SOD活性均明显升高(P<0.05);注射用D1高、中剂量组MDA含量明显下降(P<0.01，PO.05);注射用Dl高剂量组NO含量明显下降(PO.05);阳性药丹参注射液组SOD活性明显升高(P〈0.05);MDA及NO含量与模型组比较明显下降(P<0.01,P<0.05)，结果见表4。表4注射用Dl对ICH大鼠血清中SOD活性、MDA以及NO含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与假手术组比较AAAPO.001;与模型组比较**<0.01;*PO.05.结论Dl对实验性脑缺血及脑出血后脑损伤具有保护作用，此作用与D1能减少自由基的生成，提高机体清除自由基能力，抗脂质过氧化反应，抑制因自由基所导致的损伤有关。具体实施例方式本发明的化合物具有清除自由基抗脑缺血的活性，按照常规的制药技术，可以将其制备成任何一种常规药剂，例如片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、透皮吸收剂、注射剂等。做为含有本发明化合物组合药，其组成为含有治疗有效量的本发明化合物，所说的化合物在药物组合物当中可以是单独使用，也可以与其他药物配合使用。本发明的药物组合物除了含有上述化合物之外，还含有常规的药物赋形剂，例如粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、调味剂、增溶剂、溶剂、防腐剂等。权利要求1、次血红素短肽化合物在抗脑缺血药物制备中的用途。2、按照常规的制药技术，可以将次血红素短肽化合物制备成任何一种常规药剂，包括片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、透皮吸收剂、注射剂。全文摘要本发明提供了次血红素短肽化合物在抗脑缺血药物制备中的用途，用于治疗脑缺血及脑出血后脑损伤疾病。按照常规的制药技术，可以将次血红素短肽化合物制备成任何一种常规药剂，包括片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、透皮吸收剂、注射剂。文档编号A61K38/43GK101554475SQ20091006699公开日2009年10月14日申请日期2009年5月22日优先权日2009年5月22日发明者惟李,杨世杰,王丽萍,辉薛申请人:长春大政药业科技有限公司