一种抗肝素的血清总胆红素(钒酸盐氧化法)检测试剂盒的制作方法

本发明涉及血清总胆红素(钒酸盐氧化法)检测技术领域，特别涉及一种适合全自动生化分析仪的血清总胆红素(钒酸盐氧化法)检测试剂。

背景技术：

总胆红素是直接胆红素和间接胆红素二者的总和。总胆红素来源主要有：①80%～85%的胆红素来自衰老的红细胞崩解;②约15%由造血过程中尚未成熟的红细胞在骨髓中被破坏（骨髓内无效性红细胞生成）而形成的;③少量来自含血红素蛋白（hemoprotein），如肌红蛋白、过氧化物酶、细胞色素等的破坏分解。

总胆红素主要用来诊断是否有肝脏疾病或胆道是否发生异常，总胆红素正常值在3.4～17.1μmol/L之间，17.1-34.2μmol/L可视为隐性疸;34.2-170μmol/L之间为轻度黄疸;170-340μmol/L为中度黄疸;大于340μmol/L则为重度黄疸。

临床上常用的血清总胆红素检测方法有重氮法、胆红素氧化酶法和钒酸盐氧化法。重氮法试剂有较高的实验灵敏度、试剂价格便宜、检测操作方法简单，但重复性不稳定;胆红素氧化酶法具有特异性好、灵敏度高、重复性好，操作简便等优点，但由于试剂价格较高，目前仍未广泛使用。后来随着钒酸盐法检测血液中胆红素方法的出现以及在国内的逐渐推广，临床中的评价也较多，其拥有者良好的特异性和稳定性，得到了临床使用者的好评，但是随着临床使用的逐渐推广发现，在针对于临床中使用肝素处理获得的血浆样本，在使用钒酸盐法检测总胆红素时，造成检测结果不准确，反应曲线异常且检测结果不正常，容易导致检测结果偏低甚至出现负值，这给临床中的推广和使用造成非常大的困扰。

技术实现要素：

针对于血清总胆红素检测，本发明提供了一种抗肝素的血清总胆红素(钒酸盐法)检测试剂盒，该试剂盒与常规检测方法相比，检测结果不受肝素影响，且使用简单、方便，具有很好的准确度、重复性及良好的检测范围，有利于试剂在临床上的推广应用。

本发明是通过以下措施实现的：

使用新型的表面活性剂取代原有的阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵作为加速剂，破坏游离胆红素总的氢键，然后将加速破坏之后的胆红素完全暴露出来，在PH=3附近，将钒酸盐作用于样本，样本中的总胆红素被氧化成胆绿素，胆红素所特有的黄色减少，在波长450nm处检测其被钒酸盐氧化前后吸光度之差，其变化程度与样本中的TBIL的含量成正比。

一种总胆红素检测试剂，包括试剂R1、R2，所述试剂R1、R2的组成如下：

试剂R1：

磷酸氢二钠-苯甲酸缓冲液(pH2.9) 0.1mol/L

脂肪醇聚氧乙烯醚 5g/L-10 g/L

烷基酚聚氧乙烯醚(OP) 4 g/L -8g/L

聚乙二醇8000 1%-5.0%

曲拉通-305 2.5 g/L - 5g/L

氟化钠 1.0g/L-2.0 g/L

乙二胺四乙酸四钠 1g/L-2 g/L

试剂R2:

磷酸盐缓冲液(pH7.0) 10mmol/L

乙二胺四乙酸二钠 5g/L-10g/L

乙二胺四乙酸四钠 1g/L-2g/L

偏钒酸钠 4mmol/L

所述试剂在使用时R1：R2= 4:1,R1用量为240μl。

本发明的有益效果是：

1、本发明有限选择了苯甲酸作为主要的缓冲液，既可以促进钒酸盐对胆红素的氧化作用，又可以对反应体系起到防腐的作用；

2、本发明中选用了脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚(OP)、聚乙二醇等非离子型表面活性作为胆红素的加速剂，从而避免了阳离子表面活性剂与大分子肝素物质的聚合，并且能够很好的起到充分加速的作用，三种表面活性剂具协同作用；

3、在试剂中在添加乙二胺四乙酸二钠的同时，添加了少量的乙二胺四乙酸四钠螯合剂，可以对不同的重金属离子起到作用，并且乙二胺四乙酸四钠能够抑制钒酸盐对其他物质的氧化，从而提高检测结果的特异性。

4、本法明在试剂1中添加了曲拉通-305表面活性剂，能够提高反应体系的澄清程度，提高产品的精密度。

5、本发明中优选了氟化钠作为离子平衡剂，调整反应过程中离子浓度大小对反应的影响。

附图说明

图1 为两种试剂的相关性曲线图；

图2 为本发明试剂开瓶稳定性;

图3 实施例1试剂检测操作方法

图4 实施例2试剂抗干扰性能比较；

图5 实施例1试剂与市场常见并得到认可的血清总胆红素测定试剂盒对比检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

磷酸氢二钠-苯甲酸缓冲液(pH2.9) 0.1mol/L

脂肪醇聚氧乙烯醚 5g/L-10 g/L

烷基酚聚氧乙烯醚(OP) 4 g/L -8g/L

聚乙二醇8000 1%-5.0%

曲拉通-305 2.5 g/L - 5g/L

氟化钠 1.0g/L-2.0 g/L

乙二胺四乙酸四钠 1g/L-2 g/L

试剂R2:

磷酸盐缓冲液(pH7.0) 10mmol/L

乙二胺四乙酸二钠 5g/L-10g/L

乙二胺四乙酸四钠 1g/L-2g/L

偏钒酸钠 4mmol/L

本实施例试剂的使用方法：

本实施例描述的血清总胆红素(钒酸盐氧化法)检测试剂，在使用时采用全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用两点终点法进行测定。将样本和试剂的比例设定为9：240：60，检测波长为450nm，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如图3。

实施例2

干扰性试验：取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到图4的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场常见并认可的血清总胆固醇试剂同时对比测定血清总胆固醇的含量,对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见图4。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

由图4可以看出，抗坏血酸≤20mmol/L、肝素≤0.5%、血红蛋白≤200mg/L、甘油三酯≤22.6mmol/L情况对实施例1试剂测试结果没有明显干扰。与对照结果相比，本发明试剂抗肝素能力明显，在其他干扰物质检测上与对照产品一致，说明实施例1的试剂在准确度和抗干扰能力上达标。

实施例3

相关性实验：利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的血清总胆红素(钒酸盐氧化法)试剂盒进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如图5所示。并获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.999，说明了两者有极大的相关性。

试验所用校准品和质控品分别为：

校准品：RANDOX926血清总胆红素的含量为32.2 μmol/L。

质控品：RANDOX1005血清总胆固醇的靶值为29.3μmol/L，靶值范围：23.2~35.4μmol/L。

实施例4

试剂开瓶稳定性验证试验：

将本发明实施例1~3中所得检测试剂作为试验组，取一种市售血清总胆红素(钒酸盐氧化法)检测试剂盒作为对照组，试验组与对照组试剂每组各自取相同的两份，一份做15天开瓶稳定性试验，将试剂开瓶放置在仪器的2-8℃冷藏箱中（15天不取出），作为15天开瓶稳定性检测；另一份做37℃热稳定性检测试验，封闭放置在37℃恒温水浴锅中（每天仅在检测的时候取出，检测完毕后，依然封口放回37℃水浴锅中，连续7天），作为7天37℃热稳定性验证。将试剂同时在日立7180全自动生化分析仪器上，按照如下图3方法进行检测，并在仪器上建立标准曲线。取冻干粉质控品，溶解均匀后，平均分成15份，-20℃储存，每天质控一个，并且跟踪检测结果，其开瓶跟踪监测趋势如图2。