专利名称：一种草鱼呼肠孤病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，还涉及一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法。
背景技术：
草鱼出血病是传染性、致病性都很强的一种严重病毒性疾病，主要危害草鱼鱼种。1972年首次在湖北滠口发现，并命名为草鱼出血病。1978年首次通过电镜观察证实该病原为病毒。1983年首次分离出爆发性草鱼出血病病原，并根据其形态学、理化特性等研究鉴定该病毒为呼肠孤病毒。1991年国际病毒分类委员会第五次会议将该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV),并纳入呼肠孤病毒科(Reoviridae)水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)。草鱼呼肠孤病毒是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒,现在已有资 料证实该病毒是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株，目前国内已报道了 20多个分离株。对草鱼呼肠孤病毒的检测的方法很多，电镜观察是最直接的方法，细胞培养分离病毒、空斑试验、病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等经典方法较为复杂，目前国内外检测草鱼呼肠孤病毒最常用的还是免疫学检测方法及RT-PCR方法等。免疫学方法在敏感性和特异性上有待提高，并且存在空窗期、交叉反应、血清型差异等问题。在现有的关于RT-PCR检测GCRV的公开文献中，都是采用传统的两步法RT-PCR技术，即将反转录和PCR反应分管分步进行。RT-PCR检测病原在近年来越来越趋向于采用一步法进行反应。与两步法相比，简化了操作程序、降低了样品交叉污染的可能性，对反应的干扰因素少，能获得良好的重现性，又降低了成本，为开发同时检测多种病原的多重RT-PCR创造了有利条件。
发明内容
本发明的一个目的是在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，通过分析比对GenBank中已有的草鱼呼肠孤病毒基因序列(AF260512、AF284502、GQ896335、HQ231199、JN967630)，针对病毒核酸第2片段序列设计并筛选了一对兼并引物，从而实现一步法检测GCRV病毒的目的，所用的试剂均为国产试剂，大大降低了实验成本，从分子水平对草鱼呼肠孤病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。本发明的另一个目的是在于提供了一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，本方法可在3小时内准确检测出样品中的GCRV，能检测GCRV感染的草鱼组织，也能检测GCRV感染的细胞(例如CIK细胞)，非常适用于GCRV的快速检测。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分该试剂盒包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 GCRVF 和 GCRVR，AMV 酶，Taq 酶。GCRVF: 5，-GGBTCCACDGYMACVTCCAC-3，；
GCRVR: 5 ’ -ffDRTCRCCKKGRGGCATGTA-3 ’。一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其步骤是I、病毒RNA的获取采用TRWix或TRW : LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA。2、RT-PCR 扩增采用25 μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5 μ L, 5 X AMVbufferl μ L, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) O. 5-3 μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，补力口
灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。3、检测结果判定取扩增产物，用I. 5% (w/v,以下相同)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在650bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法(最佳条件)，其步骤是I、病毒RNA的获取采用TRi/υΙκ或TRIzrf LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA，模板RNA在950C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。2、RT-PCR 扩增采用25 μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5 μ L，5 X AMV bufferl μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，补力口灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。3、检测结果判定取扩增产物，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在650bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。与现有技术相比，本发明具有以下优点I、本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，能够检测出目前分离的所有的GCRV病毒株。2、特异性好，能有效检测出GCRV病毒；3、全部采用国产试剂，大大降低了检测成本；4、一步法提高了检测效率，缩短了检测时间。
图I为一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的特异性的示意图
从左至右的泳道依次为水的空白对照、GCRV-873、GCRV-HZ08株和104株感染CIK细胞的总RNA、SVCV感染EPC细胞的总RNA、CRV感染CCO细胞的总RNA、DLl, OOOMarker0图2为一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测草鱼组织的结果示意图从左至右的泳道依次为DL5，OOOMarker,8个疑似草鱼组织的总RNA、GCRV-104株感染CIK细胞的总RNA、水的空白对照。
具体实施例方式下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。本发明 全部试剂均为上海生工公司产品。实施例I :一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分该试剂盒它包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 GCRVF 和 GCRVR，AMV 酶，Taq 酶。实施例2 草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒所用缓冲液的优化一、取待检样品提取病毒RNA:培养草鱼肾脏细胞(CIK细胞)至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为O. I的剂量，接种ImL经4000r/min离心5min除去细胞碎片的草鱼呼肠孤病毒细胞毒材料GCRV-104(CCTCC N0:V201217)，添加 10 μ L 的 Polybrene (终浓度 10μ g/ml)，置于 28°C 培养箱中吸附lh，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附Ih后，吸弃病毒液，加入5mL2%胎牛血清(V/V)的培养液，置28°C培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，于_80°C至室温(20-25°C)反复冻融3次，5000r/min离心30min,取上清250 μ I,用TRIzol LS (Invitrogen)试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50 μ I灭菌水，-80°C保存备用。二、RT-PCR扩增的反应体系采用25 μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板(预处理方法将获得的模板RNA在95°C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度，以下同)5 μ L，5 X AMV buffer，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free), MgCl2 (25mM) 2 μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L,引物(20 μ M)各0· 5 μ L，AMV酶O. 5 μ L，Taq酶O. 5 μ L，补加灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行 RT-PCR 反应，先 45°C 30min,95°C 3min，再按 95°C 20s_52°C 20s_72°C 40s 作 35 个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置空白对照。其中5XAMV buffer 和 Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free)米用不同的组合I) 5 X AMV buffer O μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2. 5 μ L2) 5 X AMV buffer I μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L3) 5 X AMV buffer 2 μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) I. 5μ L4) 5 X AMV buffer 3 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) I μ L5) 5 X AMV buffer 4 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 0. 5 μ L6) 5 X AMV buffer 5 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) OyL三、检测结果判定
取8 μ I扩增产物，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示 5XAMV bufferl μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L 时结果最好。实施例3 草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒不同浓度的Mg2+的优化一、取待检样品提取病毒RNA:待GCRV-104感染的CIK细胞出现90%病变后收获(制备方法同实施例2)，于_80°C至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250 μ 1，用TRb.ol LS试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50 μ I灭菌水，-80°C保存备用。二、RT-PCR扩增的反应体系采用25 μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5 μ L, 5 X AMVbufferl μ L, Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM)，dNTPs (25mM) 0· 5 μ L，引物(20 μ Μ)各O. 5 μ L，AMV酶O. 5 μ L，Taq酶0· 5 μ L，补加灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行 RT-PCR 反应，先 45°C 30min, 95°C 3min,再按 95°C 20s_52°C 20s_72°C 40s 作 35 个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置空白对照。其中MgCl2 (25mM)添加量分别为 O μ L、0. 5 μ L、I μ L、I. 5 μ L 和 2 μ L。三、检测结果判定取8μ I扩增产物，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示MgCl2 (25mM)添加量为I μ L时结果最好。
实施例4 草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的特异性—、取待检样品提取病毒RNA:接种SVCV (张朋，刘荭，陈孝煊，等.鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J]，中国预防兽医学报，2011,33 (4):305-308.)的EPC细胞、接种CRV (曾令兵、徐进、李艳秋，等.斑点叉尾鮰出血病病原呼肠孤病毒的分尚与鉴定[J]，病毒学报，2009, 25
(6):460-466.)的 CCO 细胞、接种 GCRV-HZ08 株、GCRV-873 株和 GCRV-104 株的 CIK 细胞出现90%病变后收获(上述病毒的制备方法同GCRV-104)，于-80°C至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250 μ 1，用TRIzof LS试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50 μ I灭菌水，-80°C保存备用。目前GCRV至少有30个分离株，分为3个基因型，GCRV-104、GCRV_HZ08、GCRV-873是各型的代表。二、RT-PCR扩增的反应体系采用25 μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5 μ L，5 X AMV bufferl μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，补力口灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置空白对照。三、检测结果判定取8 μ I扩增产物，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示能够检测出GCRV-104、GCRV-HZ08和GCRV-873，而SVCV、CRV和空白对照均无法检出(图1)，表明利用本发明的试剂盒，能够检测出目前分离的所有的GCRV病毒株，并具有特异性。实施例5 一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其步骤是一、取待检样品提取病毒RNA:取IOOmg疑似感染草鱼呼肠孤病毒的草鱼组织加入Iml TRIzof试剂用玻璃匀浆器于室温研磨，按照说明书提取RNA，最后溶于50 μ I灭菌水，-80°C保存备用。以下为本发明中判断疑似草鱼感染了呼肠孤病毒的依据
仔细检查草鱼有无异常表征，如发现其尾鳍末端变黑、不食、反应迟钝、独游、易失平衡的；口腔、上下颌、头顶部、眼眶周围、鳃盖及鳍条基部充血、鳃丝呈点状出血；病鱼出血严重时，鳃呈“白鳃”症状；或鱼体暗黑，小的鱼种在阳光或灯光透视下，皮下肌肉充血。可作疑似草鱼出血病对待，并进一步诊断。经初步判断为疑似草鱼出血病的患病鱼，抽样进行解剖检查，根据下述病变，可初步判断为草鱼出血病a)剥开皮肤，肌肉充血和点状出血，呈鲜红色；b)肠壁充血或出血，全肠或局部呈鲜红色，肠壁弹性较好，肠内无食物，粘液较少；c)肠系膜、周围脂肪、鳔、胆囊、肝、肾有出血点或血丝；d)个别情况下，鳔及胆囊呈紫红色；e)当肌肉出血严重时，肝、脾、肾的颜色变淡。二、RT-PCR扩增的反应体系采用25 μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5 μ L，
5X AMV bufferl μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，补力口灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。三、检测结果判定取8 μ I扩增产物，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示对照成立，8个鱼样均呈阳性(图2)，与细胞培养方法检测的结果一致。
权利要求
1.一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分 5 XAMV 缓冲液，无镁 Taq 酶 IOXPCR 缓冲液，MgCl2 , dNTPs，引物 GCRVF 和 GCRVR，AMV 酶，Taq 酶；GCRVF: 5’ -GGBTCCACDGYMACVTCCAC-3’ ；GCRVR: 5’ -WDRTCRCCKKGRGGCATGTA-3’。
2.利用权利要求I所述的一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其步骤是 1)、病毒RNA的获取 采用TRIzof或TRIzol LS试剂或柱吸附洗脱法提取样本总RNA ； 2)、RT-PCR扩增: 采用25 μ I反应体系在PCR管中加入步骤I)中提取的样本总RNA 5yL,5XAMV缓冲液 I μ L，无镁 Taq 酶 IOXPCR 缓冲液 2yL，25mM MgCl2 I μ L,25mM dNTPs O. 5 μ L, 20 μ M引物各0.5yL，AMV酶0.5 μ L，Taq酶O. 5 μ L，补加灭菌水至25 μ L，放入PCR仪进行RT-PCR 反应，先 45°C 30 min, 95V 3min,再按 95°C 20s_52°C 20s_72°C 40s 做 35 个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温，同时设置阳性对照和阴性空白对照； 3)、检测结果判定，采用下述方式 取扩增产物，用I. 5% w/v的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在650bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法，一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分5×AMV缓冲液，无镁Taq酶10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTPs，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，可在3小时内准确检测出样品中的GCRV，能检测GCRV感染的草鱼组织，也能检测GCRV感染的细胞，非常适用于GCRV的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102876809SQ20121039848
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月18日 优先权日2012年10月18日
发明者张辉, 曾令兵, 周勇, 范玉顶, 徐进 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所