西洋参dna检测试剂盒及鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药材鉴定技术，具体地说是一种西洋参DNA检测试剂盒及鉴定方法。
【背景技术】
[0002]西洋参(Panaxquinque folius L.)为五加科人参属(Panax ginseng C.A.Mey.)多年生宿根草本植物，别名花旗参、洋参、西洋人参，原产于北美洲的加拿大南部和美国北部。西洋参原是野生品种，后家种驯化，世界各国都在引种栽培。1975年以后，我国陆续从美国引进几批种子，并引种成功，其中东北三省为主要种植地区。西洋参为名贵的滋补药材，虽与人参同科属，但药效与功能存在很大差异，二者虽均有补气生津的功效，但西洋参性凉味甘，补气偏于养阴；人参性温偏苦，补气偏于助阳。二者的形态特征有许多相似之处，不仔细区别极易混淆，尤其是国内栽培的西洋参与栽培人参很难根据形态特征准确鉴别，在实际工作中我们也遇到将西洋参与人参相混淆而不能区别的情况。由于西洋参与人参价格差异较大，性状和显微特征相似，故市场上用人参冒充西洋参的情况比较多见。特别是近年由于资源严重减少，价格一直呈现持续上升趋势，使得一些伪品和混淆品大量出现，严重搅乱了正常的市场秩序，二者混淆，将对疗效产生巨大影响。
[0003]常用的西洋参鉴别方法有药材性状鉴别、显微鉴别和化学鉴别法。性状鉴别主要是指从西洋参的外形、大小、颜色、表皮特征、质地、断面特征、气味等宏观特征来判断品种。方法虽然简单，但经验在这种方法中的影响很大，主观性较强。即使进行了很详细的性状描述，再由其他人来判断也比较难。而且作为药材形态通常是不完整的，因此鉴定难度较大。目前已有学者对西洋参组织及粉末进行鉴别，为西洋参的显微鉴别提供了一定依据，但西洋参的粉末没有太大的区别，只是木栓细胞的形状、韧皮之间是否有裂隙、木质部导管排列的稀疏、树脂道断环的数量、草酸钙簇晶的多少等，只具有相对的鉴别意义，无法准确鉴定真伪。化学鉴别主要是西洋参皂苷Rb、Rg、Ro的定性检验，但是大部分西洋参的品种都含有西洋参皂苷，特征性不强，因而仅对西洋参皂苷Rb、Rg、Ro进行定性检验，难以达到药材质量控制的目的。而在中药检测方法上普遍采用化学、红外、紫外、液相色谱等分析方法，上述方法对同科同属不同种的易混药材鉴别的专属性差，而且红外、紫外、液相等方法又存在着对化学结构相似的物质特异性不强、操作繁琐、费用高等弊端，难以满足对中药材，尤其对中药易混品种的鉴定。因此应用形态学、组织学和化学成分来鉴定存在诸多不便，尚不能对西洋参进行快速、有效的鉴别。
[0004]近阶段新兴的分子标记技术为药用植物鉴定和品质研究提供了一条新的途径。该技术迅速发展并与中药领域渗透、融合，其中AFLP (扩增片段长度多态性)在中药材(除矿物药外)的鉴定方面具有专属性强，准确性高，重复性好等优点，从分子水平解决了以前中药鉴定中宏观鉴定水平上的不完善。现代分子生物学在中药的质量控制领域逐步扩大，方法逐渐完善，大大加快了中药现代化的进程。
[0005]中国药典三个品种(川贝母、蕲蛇、乌梢蛇)应用分子生物学鉴定的方法。我们团队依托吉林市科技局创新发展计划项目和吉林省教育厅资助课题:《人参及其制剂DNA检测技术的开发与应用》、《基因生物信息学山参与栽培参叶绿体基因组DNA条形码鉴定方法》，开发出DNA鉴定试剂盒。课题组利用山参cpDNA独特的优势，应用DNA扩增技术及测序技术研究山参叶绿体DNA的基因组部分序列，设计的寡核苷酸片段可特异鉴定山参与栽培参，成功发明了一种简便、快速、特异的鉴定山参专利技术(野山参与栽培参多重PCR检测试剂盒及鉴定方法，发明专利:ZL 201010118823.6 ;2014.6授权)。相关成果发表在中国药学杂志《林下参与栽培参扩增片段长度多态性指纹图谱鉴定》[2013，48(9):677-679]。
[0006]在此基础上，课题组应用分子生物学与中药鉴定相融合的理论对川贝母的鉴定技术进行研究，主要应用植物DNA的高保守性及特异性对川贝母进行鉴定。采用十六烷基三甲基溴化铵方法从川贝母中提取基因组DNA，利用Genbank中的相关信息，根据川贝母与其他相关植物的基因组DNA序列的差异，选取特异性基因序列，应用primer premier 5.0引物设计软件设计川贝母一对引物，进行PCR (聚合酶链式反应)扩增，并根据此扩增片段中特异性限制性核酸内切酶酶切位点不同，进行酶切反应。并以此方法可从分子水平对川贝母鉴定提供依据。相关成果发表在中国药学杂志《川贝母DNA检测试剂盒的研制与评价》[2014，49 (6):501-504]。
[0007]国内崔光红等人通过对西洋参特定序列位点标记进行研究，该方法是根据已知序列采用单引物进行PCR扩增的APAPD(锚定引物扩增多态性DNA)法，虽然扩增的稳定性和特异性大大增加，但PCR产物需克隆测序、分析，成本较高，不适合快速检测【崔光红，黄璐琦，唐晓晶，等:获取人参、西洋参特定序列位点(STS)标记的新方法.中国中药杂志，2007，32
(11):1012-1015.】。宋沁鑫等人通过ALM-ASA鉴别人参和西洋参ITS基因上单核苷酸多态性位点，该方法针对SNP位点设计特异性引物，利用适配器连接介导的等位基因特异性扩增进行检测，特异性强、稳定性好，但需要设计DNA适配器，过程繁琐，很难作为一种常规方法进行推广应用【宋沁鑫，张心悦，卜莹，等=ALM-ASA法鉴别人参和西洋参ITS及5.8s基因上单核苷酸多态性位点.中国药科大学学报，2008，39 (3):274-278.】。陈子易等人利用微卫星标记鉴别人参和西洋参，该方法根据SSR(简单重复序列)分子标记作为微卫星DNA，需针对不同SSR位点设计多对引物进行扩增，通过聚丙酰胺凝胶电泳进行检测，虽然提高了准确性，但由于引物较多，PCR反应条件的摸索、聚丙酰胺凝胶电泳的检测相对来说比较费时，对于实验条件的掌握也需严格控制，因此在实际应用中较为不便【陈子易，吕旭楠，程舟，等:微卫星标记在人参和西洋参鉴别中的应用.复旦学报(自然科学版)，2011，50 (2):185-191.】。实验证明了西洋参一些基因位点可以通过特异性PCR和分子标记技术进行鉴别。
[0008]在此基础上，申报了吉林省教育厅资助课题《西洋参DNA定性与定量检测技术》，基于植物核糖体DNA建立中药材的DNA检测技术，成功开发出西洋参中药材DNA鉴定试剂合
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[0009]核糖体是存在于细胞内的一种细胞器，核糖体DNA (nuclear ribosome DNA,nrDNA) ITS序列分析已成为在分子水平上探讨科、亚科、族内关系十分有效的手段，在植物系统发育与分类的研究中起了重要作用。高等植物细胞核中nrDNA是高等植物中的rRNA基因(rDNA)，是高度重复的串联序列单位。18S，5.8S和26S rDNA联结在一起，作为一个转录单位。18S-26S rDNA基本结构由18S rDNA, 26S rD_NA，5.8 S rDNA和位于三者之间的基因内转录间隔区(ITS)组成，其中ITS区由5.8 S rDNA所分隔的ITSl和ITS2两个片段组成。18S-26S核rDNA ITS区在核基因组中高度重复，而且通过不等交换和基因转换这些重复单位间已经发生了位点内和位点间的同步进化，即不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致，且所受选择压力较小，碱基替换速率较快，进化速度快，加上片段长度变异很小，非常适合进行各种分子操作。由于nrDNA的ITS区域具有较多的碱基变异信息，在长度上具有较好的保守性，因而被广泛地用于中药的种间鉴别，鉴定结果更为准确、可靠。
[0010]本发明专利基于PCR-AFLP方法用于西洋参鉴别。PCR-AFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，且方法简便，分型时间短。本专利运用此方法通过特异的DNA条带图谱将西洋参与人参DNA序列的特异性显示出来，进而完成西洋参与人参的鉴别，建立了西洋参与人参DNA PCR-AFLP鉴定方法，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并为中药材的鉴定和分析提供了科学依据。
【发明内容】
[0011]本发明专利采用生物信息学技术对西洋参核糖体DNA基因组进行筛选，利用Genbank中的相关信息，根据西洋参与其他相关植物的核糖体DN