非巯基核酸-纳米金偶联物的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种非巯基核酸-纳米金偶联物的制备方法及其应用。该方法包括：（1）将末端含有多聚腺嘌呤PolyAx的寡核苷酸加入金纳米粒子的分散液，并加入柠檬酸钠缓冲液混合均匀、孵育，而后离心去除游离的所述寡核苷酸，而保留所述寡核苷酸与金纳米粒子的复合物；（2）将步骤（1）最终所获复合物以中性磷酸盐缓冲液重悬，再次加入所述寡核苷酸、封闭试剂以及氯化钠溶液，再次孵育，并离心除去游离的所述寡核苷酸及封闭试剂，获得所述非巯基核酸-纳米金偶联物。该方法可应用于DNA的可视化检测及制备DNA检测试剂盒。本发明制备的核酸-纳米金稳定性高，应用于核酸检测时具有快速、灵敏、动态范围宽、低成本、操作简便等优点，适于推广应用。
【专利说明】非巯基核酸-纳米金偶联物的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于纳米金粒子与末端连接多聚腺嘌呤的寡核苷酸形成复合物 的制备方法及其应用，特别是在检测DNA中的应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] DNA是遗传信息的承担者，是生物遗传的主要物质基础。由于对每一种生物体来 说，核酸的序列都是独一无二的。因此，在诊断和识别各种疾病时，这些细菌、病毒、病原体 的核酸序列就成为了研究对象。目前，很多疾病的序列信息已被人们掌握，为了能够有效抗 击这些疾病，及早和准确地探测DNA序列显得尤为重要。基于纳米材料的DNA检测手段则 在定位、可视化、多重检测等方面具有很大优势，其中核酸-纳米金偶联物在核酸检测中获 得了广泛的应用。因此，非常有必要开发一种简便、灵敏、成本低廉的检测DNA的方法。
[0003] 传统的核酸-纳米偶联物制备基于Au-S共价键实现巯基化寡核苷酸在金纳米粒 子表面的自组装。虽然这种方法已经得到广泛应用，但也存在如下问题需要克服：（一）该 方法制备过程中需要利用高浓度的NaCl驱使巯基末端修饰的核酸靠近纳米金表面，而这 一过程操作非常繁琐、纳米金在高浓度盐的作用下容易团聚，制备过程重复性差；（二）采用 巯基化的核酸-纳米金偶联物作为探针与目标核酸杂交，由于所得产物常常聚集程度大， 容易沉淀，检测的动态响应范围比较窄(仅1-2数量级浓度);(三)巯基化的核酸序列成本较 高；。最近，有研究报道了采用多聚腺嘌呤末端核酸（PolyA-DNA)偶联纳米金的方法，能够 提高核酸-纳米金探针应用于的核酸检测的灵敏度，缩短检测时间，（Langmuir 2012，28， 17053 - 17060)。但是，现有PolyA-DNA偶联纳米金的制备方法，稳定性和重复性较差，且 在应用于核酸检测时还具有动态检测范围较窄的缺点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种非巯基核酸-纳米金偶联物的制备方法，以克服 现有技术的不足。
[0005] 本发明的目的之二在于提供所述非巯基核酸-纳米金偶联物的制备方法在检测 DNA中的应用。
[0006] 本发明的目的之三在于提供一种可视化DNA检测方法。
[0007] 本发明的目的之四在于提供一种DNA检测试剂盒。
[0008] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括： 一种非巯基核酸-纳米金偶联物的制备方法，包括： (1) 将末端含有多聚腺嘌呤PolyAx的寡核苷酸加入金纳米粒子的分散液，并加入柠檬 酸钠缓冲液混合均匀、孵育，而后离心去除游离的所述寡核苷酸，而保留所述寡核苷酸与金 纳米粒子的复合物； (2) 将步骤（1)最终所获寡核苷酸与金纳米粒子的复合物以中性磷酸盐缓冲液重悬，再 次加入所述寡核苷酸、封闭试剂以及氯化钠溶液，再次孵育，并离心除去游离的所述寡核苷 酸及封闭试剂，获得所述非巯基核酸-纳米金偶联物。
[0009] 进一步的，所述封闭试剂可选自dATP或巯基十一烷酸，且不限于此。
[0010] 进一步的，所述金纳米粒子的粒径优选为15_50nm。
[0011] 前述任一种方法在检测DNA或制备DNA检测试剂盒中的应用。
[0012] 一种可视化DNA检测方法，包括： 提供5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸及金纳米粒子，并采用权利要求1-2 中任一项所述方法制成作为第一探针的非巯基核酸-纳米金偶联物； 提供3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第二寡核苷酸及金纳米粒子，并采用权利要求1-2 中任一项所述方法制成作为第二探针的非巯基核酸-纳米金偶联物，X > 10 ; 以及，将所述第一探针和第二探针混合，并加入可能含有能够与所述第一寡核苷酸和 第二寡核苷酸互补杂交的核酸序列的目标DNA的样品，在适于进行核酸杂交反应的环境中 进行互补杂交反应，通过测定杂交反应体系的可见光吸收强度变化，实现对样品的检测。
[0013] 进一步的，所述可视化DNA检测方法具体可以包括： 取所述第一探针和第二探针按照1 :1的摩尔比均匀混合，并加入杂交缓冲液和一系列 具有不同浓度的目标DNA标准样品，形成一系列不同混合体系进行核酸杂交反应，反应结 束后，检测一系列不同混合体系可见光光吸收值，由此确定光吸收强度随目标DNA浓度变 化的标准曲线； 以及，取所述第一探针和第二探针按照1 :1的摩尔比均匀混合，并加入杂交缓冲液和 待检测样品进行核酸杂交反应，反应结束后检测所获混合反应物的可见光光吸收值，并依 据所述标准曲线而计算出待检测样品所含目标DNA的浓度。
[0014] 进一步的，所述可见光的波长优选为520 nm、650 nm。
[0015] 进一步的，所述杂交缓冲液优选采用pH=7. 4,且含有150-300mM NaCl的、浓度为 0. 01M的磷酸盐缓冲液。
[0016] 一种DNA检测试剂盒，包括： 第一探针，主要由5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸与金纳米粒子经前述 任一种方法所制成的非巯基核酸-纳米金偶联物组成； 第二探针，主要由3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第二寡核苷酸与金纳米粒子经前述 任一种方法所制成的非巯基核酸-纳米金偶联物组成； 以及，用以构成适于进行核酸杂交反应的液相环境的辅助试剂， 其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别能够与目标DNA中的不同核酸序列互补 杂交，X彡10。
[0017] 进一步的，所述辅助试剂包括含有浓度为150-300mM的NaCl的磷酸盐缓冲液。
[0018] 与现有技术相比，本发明的优点包括： a) 通过采用非巯基末端的核酸探针制备核酸-金纳米偶联物，可显著降低核酸试剂 成本，从而显著降低检测成本，并且，采用这种PolyA末端探针的核酸-纳米金偶联物检测 核酸，由于能控制核酸杂交后AuNPs的聚集程度，从而提高了该DNA-AuNPs探针检测的灵 敏度和线性范围，特别是，通过采用两步法吸附核酸，可有效解决高盐浓度下，AuNPs吸附 PolyA-DNA容易产生沉淀、制备重复性差的问题； b) 进一步的，通过采用dATP,巯基^--烧酸等进一步修饰AuNPs,可提高 PolyA-DNA-AuNPs探针杂交的稳定性； c)与现有PolyA-DNA-AuNPs探针的制备方法相比，本发明具有探针制备的重复性、稳 定性更高、用于光度法检测核酸时动态检测范围宽，灵敏度高等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是本发明一典型实施方案之中一种PolyA-DNA-AuNP探针的制备工艺流程 图； 图2是本发明一典型实施方案之中一种DNA检测方法的原理图； 图3a-3c是本发明一典型实施例中DNA-AuNP探针与目标DNA杂交前（a)以及与浓度 为1. OnM(b)、100nM(c)的目标DNA杂交后的透射电镜照片； 图4是本发明一典型实施案例中向AuNP-DNAi和AuNP-DNA2的混合溶液中加入不同浓 度的目标DNA而导致的不同强度的紫外吸收光谱图； 图5是本发明一典型实施例中的目标DNA浓度与紫外吸收强度的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0020] 鉴于现有基于非巯基化寡核苷酸与纳米金复合物制备及应用缺陷，本案发明人提 出了一种改进的技术方案，该技术方案克服了现有非巯基化寡核苷酸-纳米金复合物制备 过程中易沉淀、重复性低以及应用于核酸检测动态范围窄的缺点。
[0021] 本发明的技术方案是基于一种两步法将核酸探针吸附到纳米金表面的技术方法， 核酸探针由末端连接多个、特别是10个以上的连续碱基A的寡核苷酸构成，所制备的复合 物与目标DNA的互补杂交而实现目标DNA的检测。
[0022] 更为具体的讲，本发明的一个方面所涉及的是一种基于核酸-纳米金复合物与目 标DNA杂交的DNA光度检测方法，该方法包括 ： 将末端含有多聚腺嘌呤的第一寡核苷酸(可标记为DNAJ、末端含有多聚腺嘌呤的第二 寡核苷酸(可标记为DNA2)与金纳米粒子（AuNP)分别偶联，分别形成第一探针（AuNP-DNAj 和第二探针（AuNP-DNA2)， 将第一探针和第二探针混合，并加入可能含有能够与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸互 补杂交的核酸序列的目标DNA的样品，在适于进行核酸杂交反应的环境中进行互补杂交反 应(其原理可参阅图2)，通过测定杂交反应体系的可见光吸收强度变化，实现对样品的检 测。
[0023] 作为较为优选的实施方案之一，参阅图1，所述第一探针或第二探针的制备方法可 以包括如下步骤： (1) 将5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸或3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx 的第二寡核苷酸加入金纳米粒子的分散液中，并加入柠檬酸钠缓冲液混合均匀、孵育，而后 离心去除游离的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸，而保留第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与金 纳米粒子的复合物； (2) 将步骤（1)最终所获第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与金纳米粒子的复合物以中性 磷酸缓冲液重悬，再次加入第一寡核苷酸或第二寡核苷酸、封闭试剂以及NaCl溶液，再次 孵育，并离心除去游离的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸及封闭试剂，获得所述第一探针和 第二探针， 其中，所述封闭试剂包括dATP或巯基十一烷酸。
[0024] 本发明的另一个方面所涉及的是一种DNA检测试剂盒，该试剂盒包括： 第一探针，包含金纳米粒子与第一寡核苷酸的偶联物，其中，所述第一寡核苷酸以末端 包含的多聚腺噪呤PolyAx与所述金纳米粒子偶联， 第二探针，包含金纳米粒子与第二寡核苷酸的偶联物，其中，所述第二寡核苷酸以末端 包含的多聚腺噪呤PolyAx与所述金纳米粒子偶联， 以及，用以构成适于进行核酸杂交反应的液相环境的辅助试剂， 其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别能够与目标DNA中的不同核酸序列互 补，X > 10。
[0025] 例如，在本发明的一典型实施案例中，该基于纳米金形成的可视化DNA检测方法 可以包括如下步骤： (1) AuNP 和 DNA 偶联 将柠檬酸钠还原法制备的金纳米粒子（AuNP，直径15-50nm)和3'末端含有多聚腺嘌呤 (PolyAx，x彡10)的DNA，'端含有PolyAx(x彡10)的DNA2分别进行偶联形成AuNP-DNAp AuNP-DNA 2复合物。例如，取AuNP的分散液分别加入100uM的DNAp DNA2，然后加入500mM pH值为3的柠檬酸钠缓冲液，震荡混匀，孵育3分钟以上离心，去除游离的DNApDNA 2分子， 用中性磷酸缓冲液（〇. 01M)重悬至原体积，再加入浓度100uM的DNAi、DNA2溶液，浓度100uM 的dATP(或浓度10 uM的巯基i^一烷酸)，然后分批，例如每两小时加一次浓度0. 1M的NaCl 溶液，直至形成的混合体系中含有浓度为〇. 01M的PB (磷酸盐)、浓度为100mM的NaCl，继 续孵育30h后，加入封闭试剂封闭AuNP-DNAi、AuNP-DNA2的偶联物，孵育10h，离心，去除游 离的 DNAp DNA2、dATP 分子，得到 AuNP-DNAi 和 AuNP-DNA2。 (2) AuNP-DNAl和AuNP-DNA2的混合溶液与目标DNA杂交，分别取步骤（1)制备出的 AuNP-DNAdPAuNP-DNA2以1 :1的比例混匀，然后向该混合溶液中加入不同浓度的目标DNA 标准样品进行互补杂交(杂交缓冲液可选用含有浓度为150-300mM NaCl溶液的磷酸盐缓冲 液)。所得混合溶液反应15分钟及以上后，采用分光光度计检测520 nm和650 nm波长的 光吸收值。
[0026] 本发明通过两步法实现了制备PolyA末端DNA与纳米金复合物稳定和重复性高， 通过将这种核酸纳米金探针与目标核酸杂交，使得纳米金一定程度上聚集，吸收光谱发生 变化，与已报道的核酸-纳米金偶联物的光度法检测核酸相比，本发明的基于核酸-纳米金 偶联物的光度法具有快速(时间在10分钟以内）、灵敏(检测灵敏度可达〇. 1 nM)、检测动态 范围可达到3个数量级等优点。
[0027] 以下结合若干实施例及附图对本发明的技术方案作更为具体的说明。
[0028] 以下实施例中所涉及的DNA。DNA2、目标DNA的序列如下表1所示，其均可通过本 领域技术人员熟知的方式，例如人工合成等方式获取。又及，需要说明的是，本案发明人利 用具有其它序列的DNAp DNA2、目标DNA按照前文所述的方式进行测试，亦可获得与如下实 施例相近之检测效果。
[0029] 表1实施例1-3中核酸-纳米金探针（AuNP-DNA)的设计举例
【权利要求】
1. 一种非巯基核酸-纳米金偶联物的制备方法，其特征在于包括： (1) 将末端含有多聚腺嘌呤PolyAx的寡核苷酸加入金纳米粒子的分散液，并加入柠檬 酸钠缓冲液混合均匀、孵育，而后离心去除游离的所述寡核苷酸，而保留所述寡核苷酸与金 纳米粒子的复合物； (2) 将步骤（1)最终所获寡核苷酸与金纳米粒子的复合物以中性磷酸盐缓冲液重悬，再 次加入所述寡核苷酸、封闭试剂以及氯化钠溶液，再次孵育，并离心除去游离的所述寡核苷 酸及封闭试剂，获得所述非巯基核酸-纳米金偶联物； 其中，所述封闭试剂包括dATP或巯基十一烷酸。
2. 根据权利要求1所述非巯基核酸-纳米金偶联物的制备方法，其特征在于所述金纳 米粒子的粒径为15_50nm。
3. 权利要求1-2中任一项所述方法在检测DNA或制备DNA检测试剂盒中的应用。
4. 一种可视化DNA检测方法，其特征在于包括： 提供5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸及金纳米粒子，并采用权利要求1-2 中任一项所述方法制成作为第一探针的非巯基核酸-纳米金偶联物； 提供3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第二寡核苷酸及金纳米粒子，并采用权利要求1-2 中任一项所述方法制成作为第二探针的非巯基核酸-纳米金偶联物，X > 10 ; 以及，将所述第一探针和第二探针混合，并加入可能含有能够与所述第一寡核苷酸和 第二寡核苷酸互补杂交的核酸序列的目标DNA的样品，在适于进行核酸杂交反应的环境中 进行互补杂交反应，通过测定杂交反应体系的可见光吸收强度变化，实现对样品的检测。
5. 根据权利要求4所述的可视化DNA检测方法，其特征在于具体包括： 取所述第一探针和第二探针按照1 :1的摩尔比均匀混合，并加入杂交缓冲液和一系列 具有不同浓度的目标DNA标准样品，形成一系列不同混合体系进行核酸杂交反应，反应结 束后，检测一系列不同混合体系可见光光吸收值，由此确定光吸收强度随目标DNA浓度变 化的标准曲线； 以及，取所述第一探针和第二探针按照1 :1的摩尔比均匀混合，并加入杂交缓冲液和 待检测样品进行核酸杂交反应，反应结束后检测所获混合反应物的可见光光吸收值，并依 据所述标准曲线而计算出待检测样品所含目标DNA的浓度。
6. 根据权利要求4或5所述的可视化DNA检测方法，其特征在于所述可见光的波长为 520 nm、 650 nm〇
7. 根据权利要求4或5所述的可视化DNA检测方法，其特征在于所述杂交缓冲液采用 pH=7. 4,且含有150-300mM NaCl的、浓度为0. 01M的磷酸盐缓冲液。
8. -种DNA检测试剂盒，其特征在于包括： 第一探针，主要由5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸与金纳米粒子经权利 要求1-2中任一项所述方法所制成的非巯基核酸-纳米金偶联物组成； 第二探针，主要由3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第二寡核苷酸与金纳米粒子经权利 要求1-2中任一项所述方法所制成的非巯基核酸-纳米金偶联物组成； 以及，用以构成适于进行核酸杂交反应的液相环境的辅助试剂， 其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别能够与目标DNA中的不同核酸序列互补 杂交，X彡10。
9. 根据权利要求8所述的DNA检测试剂盒，其特征在于所述金纳米粒子的粒径为 15_50nm〇
10. 根据权利要求8所述的DNA检测试剂盒，其特征在于所述辅助试剂包括含有浓度为 150-300mM的NaCl的磷酸盐缓冲液。
【文档编号】C12Q1/68GK104059976SQ201410288696
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】彭池方, 泮秋立, 刘春丽, 刘丽强 申请人:江南大学