一种快速鉴别n6、n8亚流感病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速鉴别流感病毒不同亚型的方法，具体涉及一种利用多重荧光 定量PCR方法快速鉴别N6、N8亚流感病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 流感病毒（Influenza Virus)属正粘病毒科，为RNA病毒。根据病毒膜蛋白（M)和 核蛋白（NP)的差异，将流感病毒分为甲（A)、乙（B)、丙（C)三个大型。其中A型流感的流行 时间最长，危害最大，流行宿主范围也最广。根据病毒表面血凝素（HA)和神经氨酸酶（NA) 的结构及其基因特性的不同，又可分为不同亚型。目前A型流感病毒已发现的血凝素（HA) 有16个亚型，分别用H1、H2 -Hie来表示；神经氨酸酶有9个亚型，分别用NI、N2…N9来 表示。各亚型间的HA和NA交叉组成不同的亚型毒株，如H5N6、H5N8、H6N6、H10N8、H4N6等。 各亚型的基因序列有所不同，病毒特性和抗原性等亦有所不同。其中H5N6、H5N8亚型禽流 感病毒近年来在水禽中经常分离到，引起水禽群的高死亡率，而且在野禽群中也分离鉴定 该型病毒。联合国粮食和农业组织9月22日指出自中国2014年4月首次报告家禽中出 现H5N6流感病毒后，老挝和越南也相继在家禽中发现了这种病毒。由于H5N6禽流感病 毒给动物健康和民众生计构成新的威胁，因此该组织呼吁各国加强对疫情的监测。因此建 立起针对N6、N8亚型流感病毒的多重荧光定量RT-PCR方法，使我们能在极短的时间内判断 鸡群是由哪种亚型的病毒引起的感染，为临床预防治疗禽病提供理论基础。
[0003] 流感病毒容易变异，变异形式有抗原性变异、温度敏感性变异、宿主范围等方面的 变异，但最主要的是抗原性变异。抗原性变异主要是表面抗原HA和NA易变异。流感病毒 表面抗原变异幅度的大小，直接影响到病毒传播的能力。若变异幅度小，属于量变，称为抗 原漂移。如果抗原变异幅度大，属于质变，称为抗原性转变，形成新的亚型，危害一般较大， 往往引起较大的流行，甚至世界性流行。如甲型流感病毒的HA、NA基因容易发生抗原转变， 导致HA和NA的部分或大部分氨基酸发生改变，出现抗原性完全不同的新亚型。
[0004] 流感病毒的检测主要依靠实验室进行确切诊断，常规的诊断方法主要包括血清学 检测及病原的分离鉴定两方面。病毒的分离是诊断该病最常用的方法之一，通常采用鸡胚 接种分离流感病毒，经培养后的病毒经过血凝（HA)及血凝抑制（HI)实验，可初步鉴定出流 感病毒。但是病毒分离无论是鸡胚接种还是细胞分离都存在周期过长、不能准确区分病毒 亚型、准确性和敏感性差的问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决以上技术问题，本发明提供了一种快速检测N6、N8亚流感病毒的方法。
[0006] 本发明的具体的方法如下： 取以下浓度及体积的反应试剂放入反应管中混匀： 2Xone-stepRT-PCRBuffer 12. 5 u L ； 三种混合酶
启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中；RT-PCR反应条件：第一步20 min 42°C， 第二步94°C 1 min，第三步95°C 15s，60°C 30s，进行45个循环，4°C保存；60°C采集荧光， 检测扩增曲线； N6探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记的淬灭基团为MGB ;N8探针5'端 标记的荧光报告基团是VIC，3'端标记的淬灭基团为MGB ; 所述N6或N8 RNA模板的制备方法如下： 取含N6或N8亚型的流感病毒，按照Trizol试剂说明提取病毒RNA :在1. 5mL的无RNA 酶的EP管中加入200 y L尿囊液和lmL的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分 离核蛋白复合体。加入〇. 2 mL的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然 后离心12,000X g，15min，4° C。离心后管内分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个 中间层，一面是无色的水相。RNA沉淀小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中，加 入等量体积的预冷异丙醇，室温静置1〇111；[11，离心12,000 \8，151]1；[11，4°(]。离心后可以 在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀。RNA洗涤去上清，向沉淀中加入lmL 75%预冷的乙 醇洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心12, 000 X g，5min，4° C。RNA溶解去上清，超净台内风 干RNA沉淀，加入20 y L DEPC水充分溶解RNA。
[0007] 随着分子生物学的飞速发展，分子生物学技术已广泛应用于流感病毒的测定。尤 其是近年来快速发展的荧光定量RT-PCR方法。荧光定量PCR通过对PCR扩增反应中每一 个循环产物荧光信号进行实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。反转录和PCR 扩增又在同一管内完成，有助于减少操作污染，时间更短、灵敏度更高。在实时荧光定量 PCR反应中引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信 号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光 强度的变化来监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。最常用的探针是Taq Man 探针，该探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。其序列与目标序列上 游引物和下游引物之间的序列高度配对。其中，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭基 团则在3'末端。常用的荧光基团有？41^￡1\￥1(：、册父等。当完整的探针与目标序列配对 时，荧光基团发射的荧光基因与3'端的淬灭基团接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚 合酶的5'外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭基团分离。这样随着扩增循环 数的不断增加，释放出来的荧光基团也在不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正 比关系。
[0008] MGB探针的淬灭基团采用非焚光淬灭基团（Non-Fluorescent Quencher)，本身 不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10° C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB 探针可以比普通Taq Man探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大 为提尚。
[0009]目前，荧光定量PCR检测被广泛应用于病原微生物检测、基因病诊断、传染病检测 和病变检测等。
[0010] N6和N8亚型的AIVs是感染水禽并能致病的常见NA亚型，特别是H5N6和H5N8 亚型。目前检测AIV的方法多是针对其HA亚型的检测，如113、114、115、117、119等亚型，针对 NA亚型的检测技术少有报道，尤其是针对多个NA亚型的鉴别诊断。因此，本发明建立了一 种快速、敏感、特异的多重荧光定量RT-PCR方法，可同时检测N6、N8亚型的流感病毒。
【附图说明】
[0011] 图1为N6基因单独扩增曲线； 图2为N8基因单独扩增曲线； 图3为N6、N8基因双重扩增曲线； 图4为N6基因灵敏度检测扩增曲线； 图5为N6基因灵敏度检测的标准曲线； 图6为N8基因灵敏度检测扩增曲线； 图7为N8基因灵敏度检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0013] 实施例1 材料与方法 一、材料 1、病毒模板：N6为H5N6和H4N6等量进行混合提取的总RNA，N8为H5N8提取的总RNA。
[0014] 2、主要试剂：小量质粒提取试剂盒和One-step Real-time RT-PCR kit均购自 TaKaRa公司。
[0015] 3、引物和探针的设计与合成：选取以上毒株N6和N8基因的高度保守区，用Primer Express进行引物和探针的设计。N6探针5'端标记的焚光报告基团是FAM，3'端标记的淬 灭基团为MGB ;N8探针5'端标记的荧光报告基团是VIC，3'端标记的淬灭基团为MGB，引物 和探针均由Life公司合成，其中引物为PAGE级纯化，探针为HPLC级纯化。引物和探针的 详细序列，见表1。
[0016] 4、主要仪器：焚光定量PCR仪为CFX 384 touch Real-time PCR detection systems，购自美国BI0-RAD公司。
[0017] 表1弓丨物及序列表探针
二、方法 1. RNA模板的制备方法 取含N6或N8的亚流感病毒，按照Trizol试剂说明提取病毒RNA :在1. 5mL的无RNA酶 的EP管中加入200 y L尿囊液和lmL的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分离 核蛋白复合体。加入〇. 2 mL的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后 离心12,000X g，15min，4° C。离心后管内分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中 间层，一面是无色的水相。RNA沉淀小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中，加入 等量体积的预冷异丙醇，室温静置1〇1^11，离心12,000 \8，151^11，4°(：。离心后可以在 管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀。RNA洗涤去上清，向沉淀中加入lmL 75%预冷的乙醇 洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心12, 000 X g，5min，4° C。RNA溶解去上清，超净台内风干 RNA沉淀，加入20 y L DEPC水充分溶解RNA。
[0018] 2. N6和N8引物进行单独扩增 一步法RT-PCR预混体系 2Xone-stepRT-PCRBu