专利名称：一种利用实时荧光定量pcr检测h7n9禽流感病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种用于检测H7N9禽流感病毒的试剂盒。
背景技术：
流感病毒属于正粘病毒科(orthomyxoviridae),有包膜、分节段基因组的单负链RNA病毒。根据核蛋白和包膜内侧面的Ml蛋白的抗原性将流感病毒分甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒再根据包膜表面血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)两种刺突的抗原性分若干亚型，目前包括Hl H16亚型，NA包括NI N9亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。H3为人犬共患，依据 流感病毒特征可分为HxNx共135种亚型，H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种。这个病毒的生物学特点、致病力、传播力，还没有依据进行分析判断。H7N9亚型禽流感病毒是甲型流感中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。但我国人感染H7N9禽流感于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型流感病毒，尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统，并且至2013年4月初尚未有疫苗推出。中国国家卫生和计划生育委员会2013年3月3日印发人感染H7N9禽流感诊疗方案、防控方案及医院感染预防与控制技术指南。根据人感染H7N9禽流感诊疗方案(2013年第I版)，人感染H7N9禽流感传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。传播途径为经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。现阶段高危人群主要是从事禽类养殖、销售、宰杀、加工业者，以及在发病前I周内接触过禽类者。诊疗方案指出，人感染H7N9禽流感潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39°C以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。根据流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可作出人感染H7N9禽流感的诊断。在流行病学史不详的情况下，根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果，特别是从患者呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性，可以诊断。
发明内容
鉴于核酸检测是直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，用于检测H7N9禽流感病毒核酸。一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
(1)RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂；
(2)用于扩增样本cDNA的引物及探针，包括:
检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针:
H7-F: GGGffTTCACMTACAGYGGAATAAGH7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC
H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGffTCTTC-TAMARA检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针:
N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAN9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA
N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。
进一步地,所述RNA提取试剂包括QIAamp Viral RNA mini Kit ;所述逆转录试剂包括 5 X RT-Buffer, IOOuM Primer Mix, 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶和 DEPC 水；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括qPCR Mix，50 X R0X，扩增引物及探针和灭菌水。更进一步地，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤:
(1)用RNA提取试剂提取呼吸道标本的RNA；
(2)用逆转录试剂将步骤(I)中得到的RNA进行反转录为cDNA;
(3)使用弓I物H7-F、H7-R和N9_F、N9_R及相应探针H7-probe、N9_probe在单管PCR反应体系中对步骤(2)得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测。其中，实时荧光定量PCR反应程序:95°C IOmin预变性；95°C 15sec，58°C35sec，39个循环。步骤(I)的具体抽取步骤如下:
I)吸取560ul准备好的buffer AVL (含有carrier RNA)到1.5ml离心管中。(根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA)。2)将140ul血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有bufferAVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒，混匀。(为保证裂解效率，一定要彻底混匀，形成均一溶液。只溶解过一次的样品也仍然可用)。3)室温放置lOmin。( 10分钟足够，延长时间不会增加产物质量。Buffer AVL可以使潜在的污染和Rnase失活)。4)瞬时离心,将盖子上的液滴甩回管底。5)样品中加入560ul无水乙醇(96% 100% ),斡旋15s充分混勻。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。(只可以用乙醇，因为其他酒精会降低产量和纯度。不能使用变性酒精，因为其中含有其他物质。如果样品量大于140ul，按比例增加乙醇的量。该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量)。6)吸取630ul上步中的溶液小心的加入column(已装入到2ml离心管中)中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000Xg (8000rpm)离心lmin。将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。(每一个column都要盖上，以防交叉污染。SOOOrpm的速度是为了限制噪音，全速离心也是可以的，不会影响产物。如果溶液没有完全透过膜，可以更高的速度再次离心，直到溶液完全透过)。7)小心的打开column的盖子，重复第6步。(如果样品量超过了 140ul，那么重复此步骤，直到所有的裂解液都上柱)。8)小心的打开column盖子，加入500ul buffer Affl0盖上盖子，8000rpm离心，lmin。将column放入新的2ml收集管(Kit提供)中，弃去旧的收集管。(即使样品量大于140ul，也无需增加buffer Affl的量)。9)小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW2。盖上盖子，全速离心(14000rpm), 3min0接着进行第11步，或者先进行第10步，以避免buffer AW2残留,然后再进行第11步。(buffer AW2残留会影响下游实验。有些离心机在减速时会发生振动，导致回流，使得buffer AW2接触到column。将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生，因此，最好先进行第10步)。10)推荐:将column放入新的2ml收集管(Kit中未提供)中，弃去旧的收集管，全速离心lmin。11)将column放在1.5ml离心管(kit中未提供)中。弃去旧的收集管。小心的打开column,加入60ul室温的buffer AVE。盖上盖子,室温放置lmin。8000rpm离心lmin。步骤(2)的逆转录具体步骤如下:向IOul RNA中加入Iul IOOuM Primer Mix,将混合液至于65°C，5min后，冰浴2min ；向上述混合液加入4ul 5 X RT-Buffer, 4ul DEPC水，Iul 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶，混匀，37°C 60min,95°C 5min，获得 cDNA -20°C备用。步骤(3)实时荧光定量PCR检测`方法中，通过不同荧光标记(FAM、HEX)的两条探针，完成一例样本在一管PCR反应体系中同时检测甲型禽流感病毒包膜表面血凝素(HA)基因及神经氨酸酶(NA)基因，既可以同时检测出H7N9禽流感病毒的H7亚型和N9亚型。根据实时荧光定量PCR检测结果，可以对检测样本是否感染H7N9禽流感病毒进行鉴定。具体方法为:在H7阳性质控和N9的阳性质控都有扩增曲线，且Ct值彡38的前提下，I)检测样本的一管PCR反应体系中，如果FAM标记的探针和HEX标记的探针都产生扩增曲线，且Ct值< 38，则判定样本是H7N9病毒阳性；2)如果检测样本的一管PCR反应体系中，FAM标记的探针和HEX标记的探针都无明显扩增曲线，或者只有其中一条探针有扩增曲线，则判定样本是H7N9阴性。有益效果:本发明的用于检测H7N9禽流感病毒核酸的试剂盒，通过对病毒RNA抽提，逆转录和实时荧光定量PCR，可以鉴定H7N9禽流感病毒。该试剂盒所得的结果具有高准确性，高敏感性，高特异性和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。
图1是样本A实时荧光定量PCR检测结果。由图可知，该样本H7和N9都产生扩增曲线，因此样本A为H7N9禽流感病毒阳性。图2是样本B实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有H7产生扩增曲线，因此样本B为H7N9禽流感病毒阴性。
图3是样本C实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有N9产生扩增曲线，因此样本C为H7N9禽流感病毒阴性。图4是样本D实时荧光定量PCR检测结果。该样本H7和N9都无扩增曲线，因此样本D为H7N9禽流感病毒阴性。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例1
用于检测H7N9禽流感病毒核酸的试剂盒，包括:
(i)RNA 提取试剂:QIAamp Viral RNA mini Kit ；
(ii)逆转录试剂:5XRT-Buffer,IOOuM Primer Mix, lOOU/ul ReverTra Ace 逆转录酶，DEPC水；
(iii)实时荧光定量PCR试剂:qPCR1^1，50父1 ( ，用于扩增样本00嫩的2对引物及相应的探针，灭菌水，其中:
检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针:
H7-F: GGGffTTCACMTACAGYGGAATAAGH7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC
H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGffTCTTC-TAMARA检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针:
N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAN9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA
N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA所述试剂盒的使用方法包括以下步骤:
(1)用QIAamp Viral RNA mini Kit 提取血清待检样本 RNA ；
(2)用逆转录试剂将步骤(I)中得到的RNA进行反转录为cDNA;
(3)使用2对引物及相应探针在单管PCR反应体系中对步骤⑵得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测；PCR检测体系为25ul，其中包括12.5ul qPCR Mix, 10 uM探针各0.4ul(探针分别为H7-probe、N9-probe);10uM正向引物各0.8ul (正向引物分别为H7-F、N9_F);IOuM 反向引物各 0.8ul (反向引物分别为 H7-R、N9-R) ;50XR0X 0.5ul, cDNA 2ul, ddH206ul ;实时荧光定量PCR反应程序:95°C IOmin预变性；95°C 15sec，58°C 35sec，39个循环。根据实时荧光定量PCR检测结果，可以对检测样本是否感染H7N9禽流感病毒进行鉴定。具体方法为:在H7阳性质控和N9的阳性质控都有扩增曲线，且Ct值彡38的前提下，
I)检测样本的一管PCR反应体系中， 如果FAM标记的探针和HEX标记的探针都产生扩增曲线，且Ct值< 38，则判定样本是H7N9病毒阳性；2)如果检测样本的一管PCR反应体系中，FAM标记的探针和HEX标记的探针都无明显扩增曲线，或者只有其中一条探针有扩增曲线，则判定样本是H7N9阴性。
实施例2:检测方法
1.待检测样本的RNA的抽取
I)吸取560ul准备好的buffer AVL (含有carrier RNA)到1.5ml离心管中。(根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA)。2)将140ul血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有bufferAVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒，混匀。(为保证裂解效率，一定要彻底混匀，形成均一溶液。只溶解过一次的样品也仍然可用)。3)室温放置lOmin。( 10分钟足够，延长时间不会增加产物质量。Buffer AVL可以使潜在的污染和Rnase失活)。4)瞬时尚心,将盖子上的液滴甩回管底。5)样品中加入560ul无水乙醇(96% 100%)，斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。(只可以用乙醇，因为其他酒精会降低产量和纯度。不要用变性酒精，因为其中含有其他物质。如果样品量大于140ul，按比例增加乙醇的量。该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量)。6)吸取630ul上步中的溶液小心的加入column(已装入到2ml离心管中)中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000Xg (8000rpm)离心lmin。将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。(每一个column都要盖上，以防交叉污染。SOOOrpm的速度是为了限制噪音，全速离心也是可以的，不会影响产物。如果溶液没有完全透过膜，可以更高的速度再次离心，直到溶液完全透过)。7)小心的打开column的盖子，重复第6步。(如果样品量超过了 140ul，那么重复此步骤，直到所有的裂 解液都上柱)。8)小心的打开column盖子，加入500ul buffer Affl0盖上盖子，8000rpm离心，lmin。将column放入新的2ml收集管(Kit提供)中，弃去旧的收集管。(即使样品量大于140ul，也无需增加buffer Affl的量)。9)小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW2。盖上盖子，全速离心(14000rpm), 3min0接着进行第11步，或者先进行第10步，以避免buffer AW2残留,然后再进行第11步。(buffer AW2残留会影响下游实验。有些离心机在减速时会发生振动，导致回流，使得buffer AW2接触到column。将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生，因此，最好先进行第10步)。10)推荐:将column放入新的2ml收集管(Kit中未提供)中，弃去旧的收集管，全速离心lmin。11)将column放在1.5ml离心管(kit中未提供)中。弃去旧的收集管。小心的打开column,加入60ul室温的buffer AVE。盖上盖子,室温放置lmin。8000rpm离心lmin。2.将步骤I中的所得RNA用随机弓I物逆转录为cDNA，再使用2对引物及探针对得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测。其中逆转录的具体方法:向IOul RNA中加入Iul IOOuM Primer Mix,将混合液至于 65°C，5min 后，冰浴 2min。向上述混合液加入 4ul 5*RT_Buffer，4ul DEPC 水，Iul 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶，混匀，37°C 60min,95°C 5min，获得 cDNA -20°C备用。其中实时荧光定量PCR检测的具体方法:使用2对引物及相应探针在单管PCR反应体系中对步骤(2)得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测(每批次检测中，需进行H7和N9阳性质控的检测);PCR检测体系为25ul，其中包括12.5ul qPCR Mix, 10 uM探针各0.4ul(探针分别为H7-probe、N9-probe);10uM正向引物各0.8ul (正向引物分别为H7-F、N9_F);IOuM 反向引物各 0.8ul (反向引物分别为 H7-R、N9-R) ;50XR0X 0.5ul, cDNA 2ul, ddH206ul。实时荧光定量PCR反应程序:95°C IOmin预变性；95°C 15sec，58°C 35sec，39个循环。3.结果分析，具体方法为:在H7阳性质控和N9的阳性质控都有扩增曲线，且Ct值< 38的前提下，I)检测样本的一管PCR反应体系中，如果FAM标记的探针和HEX标记的探针都产生扩增曲线，且Ct值< 38，则判定样本是H7N9病毒阳性；2)如果检测样本的一管PCR反应体系中，FAM标记的探针和HEX标记的探针都无明显扩增曲线，或者只有其中一条探针有扩增曲线，则判定样本是H7N9阴性
图1是样本A实时荧光定量PCR检测结果。由图可知，该样本H7和N9都产生扩增曲线，因此样本A为H7N9禽流感病毒阳性。图2是样本B实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有H7产生扩增曲线，因此样本B为H7N9禽流感病毒阴性。图3是样本C实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有N9产生扩增曲线，因此样本C为H7N9禽流感病毒阴性。图4是样本D实时荧光定量PCR检测结果。该样本H7和N9都无扩增曲线，因此样本D为H7N9禽流感病毒阴性 。
权利要求
1.一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (1)RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂； (2)用于扩增样本cDNA的引物及探针，包括: 检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针:H7-F: GGGffTTCACMTACAGYGGAATAAGH7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGCH7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGffTCTTC-TAMARA检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针:N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAN9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGAN9-Probe: HEX-CTCAAACGGA ACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA提取试剂包括QIAampViral RNAmini Kit ;所述逆转录试剂包括5 X RT-Buffer, IOOuM Primer Mix, 100U/ul ReverTra Ace逆转录酶和DEPC水；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括qPCR Mix，50 X R0X，扩增引物及探针和灭菌水。
3.用权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤: (1)用RNA提取试剂提取呼吸道标本的RNA； (2)用逆转录试剂将步骤(I)中得到的RNA进行反转录为cDNA; (3)使用引物H7-F、H7-R和N9_F、N9_R及相应探针H7-probe、N9_probe在单管PCR反应体系中对步骤(2)得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，实时荧光定量PCR反应程序:95°CIOmin预变性；95°C 15sec，58°C 35sec，39 个循环。
全文摘要
本发明公开了利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于包括(1)RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂；(2)用于扩增样本cDNA的两对引物H7-F、H7-R和N9-F、N9-R，及相应的探针H7-probe、N9-probe。本发明的用于检测H7N9禽流感病毒核酸的试剂盒，通过对病毒RNA抽提，逆转录和实时荧光定量PCR，可检测H7N9禽流感病毒，该试剂盒所得的结果具有高准确性，高敏感性，高特异性和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。
文档编号C12Q1/68GK103233082SQ20131012930
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月12日 优先权日2013年4月12日
发明者陈奕磊, 李文静, 王淑一, 黎飒, 徐建成 申请人:杭州艾迪康医学检验中心有限公司