专利名称：H7n9禽流感病毒三重rt-pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于RT-PCR检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种H7N9禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，以及鉴定H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒、通用检测所有亚型禽流感病毒的引物对或引物对组及其试剂盒。
背景技术：
禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科A型流感病毒属，为单股负链RNA，多形态的有囊膜病毒。禽流感病毒的基因组分为8个节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白，病毒囊膜上的纤突，分别具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的活性。这两个基因 是病毒的特异性抗原，根据HA和NA蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。由于禽流感病毒其基因组呈节段复制，通过依赖RNA聚合酶完成复制，而RNA聚合酶缺乏校正功能，所以禽流感病毒发生基因突变的频率极高。自2013年2月以来，华东地区上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例，于3月31日将其确诊为人感染H7N9禽流感病毒。这是首次发现H7N9禽流感病毒感染人的病例，目前，急需建立H7N9禽流感病毒的快速检测方法和研发相应试剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、快速方便的H7N9禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，以及鉴定H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒、通用检测所有亚型禽流感病毒的弓I物对或弓I物对组及其试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:H7N9禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，包括由三对特异性引物构成的引物对组；三对特异性引物分别是鉴定H7亚型禽流感病毒HA基因的引物对AIV H7-1和AIV H7_2(简称引物对I )，鉴定N9亚型禽流感病毒NA基因的引物对AIV N9-1和AIV N9-2 (简称引物对2)，鉴定所有亚型禽流感病毒M基因的引物对AIV M-1和AIV M-2 (简称引物对3);引物对AIV H7-1和AIV H7-2、引物对AIVN9-1和AIV N9-2、引物对AIV M-1和AIV M-2的特异性引物分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.6的碱基序列ο上述H7N9禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，包括反转录RT反应液、PCR反应液、DEPC水、超纯水；反转录RT反应液每管16 μ L,含有5 X Reverse Transcriptase Buffer10 μ L、50pmol9mer Random Primer2μ L、IOmM dNTP Mixture2μ L、40U RibonucleaseInhibitorl μ L 和 5U/ μ L AMV Reverse Transcriptasel μ L ；PCR 反应液每管 28.2 μ L，含有 2XEasyTaq PCR SuperMix25 μ L、25 μ M AIV Η7-1 和 AIV Η7-2 引物各 0.8 μ L、25 μ MAIV N9-1 和 AIV ■-2引物各0.4 4 1^、25“]\1 AIV Μ-1 和 AIV Μ-2 引物各 0.4 μ L ;DEPC 水和超纯水各ImL。在实际应用中，引物对组中的引物对I至3在PCR反应体系中的摩尔比为2:1:1，各引物对中的两条引物均等摩尔。PCR反应体系中，引物对I中两条引物的终浓度均为0.4 μ M，引物对2中两条引物的终浓度均为0.2 μ M，引物对3中两条引物的终浓度均为0.2 μ Μ。待测样品来自健康的动物或死亡的动物(可为RNA);对待测样品进行PCR扩增的退火温度为50-60°C，51°C较佳。鉴定H7N9禽流感病毒的引物对组，由两对特异性引物构成；两对特异性引物分别是鉴定H7亚型禽流感病毒HA基因的引物对AIV H7-1和AIV H7-2，鉴定N9亚型禽流感病毒NA基因的引物对AIV N9-1和AIV N9-2 ;引物对AIV H7-1和AIV H7-2、引物对AIV N9-1和AIV N9-2的特异性引物分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的碱基序列。鉴定禽流感病毒的引物对，包括特异性引物AIV M-1和AIV M_2，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.5至SEQ.1D.N0.6的碱基序列，可通用检测所有亚型禽流感病毒。鉴定H7亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物AIV H7-1和AIV H7_2，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.2的喊基序列。鉴定N9亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物AIV N9-1和AIV N9-2，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.3至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。包含上述任一引物对或引物对组的PCR检测试剂盒。发明人专门针对H7亚型禽流感病毒HA基因、N9亚型禽流感病毒NA基因和所有禽流感病毒M基因的保守序列，设计了三对特异性引物，组合成H7N9禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，一管检测即可确定是否为H7N9禽流感病毒感染。利用本发明的引物对、引物对组或试剂盒，可以检测待测样品中是否含有H7N9禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒和其他亚型禽流感病毒感`染。应用本发明建立一次PCR反应就能同时检测和鉴别H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒、H7N9禽流感病毒，确定是否存在其他亚型禽流感病毒的三重PCR技术，通过扩增条件优化、特异性和敏感性试验，建立H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒和通用检测禽流感病毒的三重RT-PCR方法，该法具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点，可用于临床检测H7N9禽流感病毒，并能确定是否存在其他亚型禽流感病毒的感染。由于本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该法在结果判定时更简便、直观和实用。实验证明，该法对同一样品中的H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒和禽流感病毒模板进行扩增，结果均得到与试验设计相符的330bp (H7亚型禽流感病毒)、207bp (N9亚型禽流感病毒)、632bp (禽流感病毒)的特异性扩增条带，对其他亚型的禽流感病毒，只出现632bp禽流感通用检测的条带，对新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎常见禽病的检测全为阴性。敏感性试验结果表明，该法最低能检测到IO3Copies/ μ L的Η7、Ν9亚型禽流感病毒，IO5Copies/ μ L的禽流感病毒。本发明可为Η7亚型、Ν9亚型、Η7Ν9禽流感病毒和禽流感病毒的发病早期提供准确的诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，可及时隔离与处理，对Η7Ν9的有效防控具有重要意义，应用前景广阔，对养禽业可持续发展也有重要现实意义。
图1是应用本发明的三重RT-PCR的特异性试验结果图，图中:Μ:1OObp Maker ；1-17 -M 性对照、H7N2、Hl 1N9、H7N9、H1N2、H1N7、H2N3、H3N2、H4N5、H5N3、H6N1、H8N4、H9N2、H10N3、NDV、IBV、ILTV0图2是应用本发明的三重RT-PCR的敏感性试验结果图，图中:M:100bp Maker ；1-9:IO8Copies/ μ L-1O0Copies/ μ L ； 10:空白对照。
具体实施例方式禽流感病毒(!12吧、!14阳、册吧、!17吧、!18财和Η10Ν3) RNA由香港大学惠赠；禽流感病毒(Η1Ν7和Η11Ν9)由美国宾夕法尼亚大学惠赠；Η7Ν9禽流感病毒的阳性RNA由广西壮族自治区疫病控制中心惠赠。禽流感病毒(Η1Ν2、Η3Ν2、Η6Ν1、Η9Ν2 )、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)由广西壮族自治区兽医研究所分离保存。实施例1引物的设计及试剂盒的制备1、引物的设计根据GenBank中现有公开的Η7亚型禽流感病毒HA基因、Ν9亚型禽流感病毒NA基因、所有亚型禽流感病毒M基因共3个基因的保守序列，通过Blast验证，设计并合成了三对特异性引物(表I)。表I引物信息
权利要求
1.一种H7N9禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括由三对特异性引物构成的引物对组；三对特异性引物分别是鉴定H7亚型禽流感病毒HA基因的引物对AIVH7-1和AIV H7-2，鉴定N9亚型禽流感病毒NA基因的引物对AIV N9-1和AIV N9-2，鉴定所有亚型禽流感病毒M基因的引物对AIV M-1和AIV M-2;所述引物对AIV H7-1和AIV H7-2、引物对AIV N9-1和AIV N9-2、引物对AIV M-1和AIV M-2的特异性引物分别具有序列表SEQ.1D.N0.1 至 SEQ.1D.N0.6 的碱基序列。
2.根据权利要求1所述H7N9禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括反转录RT反应液、PCR反应液、DEPC水、超纯水； 所述反转录 RT 反应液每管 16 μ L,含有 5XReverse Transcriptase BufferlO μ L>50pmol9mer Random Primer2μ L、IOmM dNTP Mixture2μ L、40U RibonucleaseInhibitorl μ L 和 5U/ μ L AMV Reverse Transcriptasel μ L ;所述 PCR 反应液每管28.2 μ L，含有 2 XEasyTaqTM PCR SuperMix25 μ L、25 μ M AIV H7-1 和 AIV Η7-2 引物各0.8 μ L,25 μ M AIV Ν9-1 和 AIV Ν9-2 引物`各 0.4 μ L、25 μ M AIV Μ_1 和 AIV M-2 引物各0.4 μ L ;所述DEPC水和超纯水各ImL。
3.鉴定Η7Ν9禽流感病毒的引物对组，其特征在于由两对特异性引物构成；两对特异性引物分别是鉴定Η7亚型禽流感病毒HA基因的引物对AIV Η7-1和AIV Η7-2，鉴定Ν9亚型禽流感病毒NA基因的引物对AIV Ν9-1和AIV Ν9-2 ;所述引物对AIV Η7-1和AIV Η7-2、引物对AIV Ν9-1和AIV Ν9-2的特异性引物分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的碱基序列。
全文摘要
本发明公开了一种H7N9禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，以及鉴定H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒、通用检测所有亚型禽流感病毒的引物对或引物对组及其试剂盒。发明人专门针对H7亚型禽流感病毒HA基因、N9亚型禽流感病毒NA基因和所有禽流感病毒M基因的保守序列，设计了三对特异性引物，组合成H7N9禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，一管检测即可确定是否为H7N9禽流感病毒感染。利用本发明的引物对、引物对组或试剂盒，可以检测待测样品中是否含有H7N9禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒和其他亚型禽流感病毒感染，对有效防控禽流感和切断其传播途径有重要意义，应用前景广阔。
文档编号C12Q1/68GK103255237SQ20131021595
公开日2013年8月21日 申请日期2013年6月3日 优先权日2013年6月3日
发明者谢芝勋, 罗思思, 刘加波, 庞耀珊, 邓显文, 谢志勤, 谢丽基, 范晴 申请人:广西壮族自治区兽医研究所