专利名称：一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法，特别涉及一种利用集胞藻Synechocystis sp.PCC6803生产咖啡酸的方法,属于基因工程技术领域。
背景技术：
咖啡酸是植物遭受外界刺激(如病原菌的侵染、植物体出现伤口、紫外照射、强光逆境、营养不足及低温等条件)而产生的一种苯丙烷类次生代谢物。咖啡酸及其衍生物咖啡酸苯乙基酯等具有强抗氧化、抗癌、抗炎和免疫调节活性(Gulcin, 2006; Rajendra etal., 2011; Chao et al., 2009;Park et al., 2004),是一种在医学上具有较广泛作用的医药中间体和原料药。咖啡酸具有抗菌抗病毒作用，还具有较广泛的抑菌作用，但在体内能被蛋白质灭活。实验表明体外对牛痘和腺病毒抑制作用较强，对腺病毒和副流感都有抑制作用，其次为脊髓灰质炎I型和副流感II型病毒。在抗蛇毒等方面作用显著，实验数据显示3 Ug咖啡酸剂量即能完全抑制20 ii g响尾蛇毒磷酸二酯酶，可用来生产抗蛇毒药物。另外，咖啡酸具有收缩增固微血管、提高凝血因子的功能、升高白细胞和血小板的作用，可以用来生产治疗血小板减少性紫癜和其他原因引起的白细胞减少症、血小板减少症的药物。除此之外，咖啡酸具有抗早孕作用，可以用来生产副作用更小，成本更低的避孕药；咖啡酸也常用于合成降血糖、降血压药物。目前咖啡酸的生产主要是从菊科植物一枝黄花中提取或是化学合成。自然提取方法的生产面临着植物资源、土地资源限制、提取成本高及得率低的限制。而化学合成则面临着能源消耗，成本高，环境污染严重的境地。蓝藻(Synechocystis sp.),又名蓝细菌,是一类光合自养的原核生物。它结构简单、生长迅速、适应性强、易于进行遗传操作，并且多数不含毒蛋白，可作为很好的基因工程受体系统。作为基因工程受体，与大肠杆菌相比其表达产物不形成包涵体，容易纯化；不含毒素，比较安全；培养基为无机盐，廉价不易污染等优势。但由于蓝藻表达目的基因具有不确定性，因此，目前并未有利用蓝藻制备咖啡酸的相关报道。
发明内容
本发明针对现有生产技术的不足，提供了一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法。一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法，步骤如下:(I)将核苷酸序列如SEQ ID N0.13所示的上臂基因插入质粒pBluescript IISK+的Kpn1-XhoI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示的下臂基因插入质粒pBluescript II SK+的Spe1-SacII内切酶酶切位点之间,将核苷酸序列如SEQ IDN0.15所示的卡纳抗性片段插入质粒pBluescript II SK+的BamH1-PstI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如S EQ ID N0.16所示的PsbA2启动子插入质粒pBluescript II SK+的Sal1-EcoRI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID N0.17所示的5ST1T2PCR转录终止子插入质粒pBluescript II SK+的Pst1-SmaI内切酶酶切位点之间，制得重组空白质粒;(2)将核苷酸序列如SEQ ID N0.1所述的基因片段插入步骤(I)制得的重组空白质粒的EcoR1-PstI内切酶酶切位点之间，制得重组质粒；(3)将步骤(2)制得的重组质粒转化集胞藻Synechocystis sp.PCC6803,制得转基因集胞操；(4)将步骤(3)制得的转基因集胞藻扩大培养后，经提取，制得咖啡酸。根据本发明优选的，所述步骤(4)的扩大培养，步骤如下:将转基因集胞藻接种于BG-1l液体培养基中，制得原藻液，在28 32°C的条件下培养至OD73tl值为0.6 0.8时，经3000rpm离心lOmin，收集藻细胞，然后用原藻液1/10体积的新鲜BG-1l液体培养基悬浮藻细胞，并添加对香豆酸至终浓度为0.5 u M/L，置于28 32°C的条件下培养3天，收集培养液。在藻细胞对数生长期时以1/10体积浓缩藻细胞后，添加对香豆酸，能够起到细胞富集、减少对香豆酸的耗费以及减少后期咖啡酸萃取过程的有机溶剂的使用量。根据本发明进一步优选的，所述的BG-1l液体培养基，每升组分如下:BG-1l母液IOml,浓度为6mg/ml的朽1檬酸铁铵溶液Iml,浓度为20mg/ml的Na2CO3溶液Iml,浓度为30.5mg/ml的K2HPO4溶液lml，水定容至IL ；上述BG-1l母液，每升组分如下:NaN03149.6g, MgSO4 7H207.5g, CaCl2 2H203.6g，柠檬酸 0.6g, pH8.0、浓度 0.25M的NaEDTA溶液1.12ml，微量元素溶液100ml，水定容至IL ；
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上述微量元素溶液，每升组分如下:H3B032.86g, MnCl2 4H201.81g, ZnSO4 7H200.22g, Na2MoO4 2H200.39g,CuSO4 5H200.079g, Co (NO3) 2 6H200.049g，水定容至 1L。根据本发明优选的，所述步骤(4)的提取可采用现有提取咖啡酸的方法，也可按如下步骤进行:取4ml浓缩培养后的培养液，经离心，取上清液，调pH至5.0, -20°C保存过夜，经等体积乙酸乙酯萃取，浓缩后的残留物用80%的甲醇溶解，制得咖啡酸。根据本发明进一步优选的，所述离心条件为:13000rpm离心2min。有益效果本发明通过将拟南芥(Arabidopsis thaliana) ref8基因进行集胞藻PCC6803密码子偏好性优化后，插入经过改造的质粒，通过同源重组转化集胞藻，制得转基因藻株。经试验发现，该转基因藻株可以高效合成咖啡酸，为生产咖啡酸开辟了新途径。
图1、拟南芥ref8基因及依据集胞藻(Synechocystis sp.) PCC6803密码子偏好性优化合成的srefS基因偏好性图谱；图2、重组载体构建图谱；图3、检测突变体中sref8基因插入情况示意图；其中:A、Sref8基因插入集胞藻野生型基因组检测简图；图中，a、b、c和d分别为检测插入片段所用引物，已用箭头标出其位置；B、利用不同引物组合PCR检测插入片段获得的电泳图；图4、RT-PCR分析sref8转基因藻的电泳图；图5、sref8基因在集胞藻PCC6803中表达分析的电泳图；其中:A、多克隆抗体C3H对野生型(WT)和sref8转基因藻(M)类囊体膜免疫杂交后的电泳图；B、Flag标签单克隆抗体对对野生型(WT)和sref8转基因藻(M)类囊体膜免疫杂交后的电泳图；C、野生型(WT)和sref8转基因藻(M)类囊体膜的SDS-PAGE胶蛋白分离后的电泳图；图6、野生型、sref8和ref8转基因藻类囊体膜SDS-PAGE分离后与C3H多克隆抗体杂交电泳结果图；图7、LC/MS方法检测蓝藻藻株生产咖啡酸的检测结果图；其中:A、添加对香豆酸的sref8转基因藻培养液提取物HPLC检测结果；B、添加对香豆酸的野生型培养液提取物HPLC检测结果；C、对香豆酸标品HPLC检测峰图；D、咖啡酸标品H PLC检测峰图；E、野生型标准BG-1l培养基提取物HPLC检测结果；F、图A中19.6min出峰(咖啡酸)的质谱图；图8、sref8转基因藻与ref8转基因藻咖啡酸产量柱状比较图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。生物材料来源集胞藻(Synechocystis sp.) PCC6803购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库；质粒pBluescript II SK+购自美国 Stratagene 公司；质粒PUC4K购自购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；PGEM-T easy 购自 Promega 公司；pKK233_2 购自 Clontech 公司。实施例1密码子优化的sref8基因合成根据集胞藻(Synechocystis sp.)密码子偏好性,对拟南芥ref8基因进行密码子优化，合成sref8基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。sref8基因表达的C3H蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。密码子优化情况见图1，ref8基因中23%的编码序列进行了优化，优化合成中在sref8基因5’端加上了 EcoRI酶切位点，3’端加了 PstI酶切位点。实施例2分离克隆用于构建转集胞藻PCC6803表达载体的集胞藻双同源重组上下游臂基因片段、psbA2启动子和大肠杆菌终止子TlT2cDNA片段。本实验PCR扩增片段所用DNA聚合酶为 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (购自 NEB 公司)。集胞藻PCC6803同源重组上下游臂基因片段克隆:同源重组双臂分别为集胞藻(Synechocystis sp.) PCC6803基因组slrl285附近的上下游序列，扩增片段大小分别为594bp和606bp(序列如SEQ ID NO:13 JPSEQ ID NO:14, Synchocystis sp.PCC6803所示)扩增引物设计如下:上臂正向引物:5’-ATCggtaccGGCAATGCAATTAATTAAAAATGGC-3’ (内含 KpnI 酶切位点)，(SEQ ID N0.3)上臂反向引物:5’-ATCctcgagTCTAITGTTGGAAGGTTGCTG-3’(内含XhoI 酶切位点)，(SEQ ID N0.4)下臂正向引物:5’ -ATCACTAGTGTGAAAAAATATTGACATTAAGAT-3 ’(内含 SpeI 酶切位点)，(SEQ ID N0.5)下臂反向引物:5’-ATCccgcggGGAACCAGAnTTTAGGATGGG-3’ (内含 SacII 酶切位点)，(SEQ ID N0.6)PCR 反应条件:98°C预变性 30s ;98°C变性 10s，50°C复性 20s，72°C延伸 40s，30 个循环后；72°C延伸10min，4°C保存。分别对上臂基因片段和下臂基因片段进行PCR反应，PCR反应结束后分别电泳切胶回收，然后分别连接到PGEM-T easy克隆载体(购自Promega)后转化大肠杆菌DH5 a，筛选阳性克隆。获得同源重组上游臂阳性克隆和同源重组下游臂阳性克隆。集胞藻PCC6803的psbA2启动子基因片段克隆:·
根据cyanobase数据库中psbA20RF所在基因组位置(7229-8311碱基位置)，选取psbA20RF 前 500bp 作为启动子序列(序列如 SEQ ID NO:16，Synchocystis sp.PCC6803 所示)，设计PCR引物:启动子正向引物:TCAgtcgacGGTATATGGATCATAATTGTATGC(内含 SalI 酶切位点)，(SEQ ID N0.7)启动子反向引物:TCAgaattcITGGTTATAATTCCTTATGTAITTG(内含 EcoRI 酶切位点)，(SEQ ID N0.8)扩增程序如下:98°C预变性30s ;98°C变性10s，60°C复性20s，72°C延伸30s，30个循环后；72°C延伸10min，4°C保存。PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到PGEM-T easy克隆载体后转化大肠杆菌DH5 a，筛选阳性克隆并测序，获得psbA2启动子基因阳性克隆。大肠杆菌T1T2终止子片段克隆:根据GenBank登陆的大肠杆菌T1T2(U02439.1)片段序列(序列如SEQ ID NO:17，)以质粒PKK233-2 (购自Clontech公司)为模板，设计引物:T1T2-F:5’ 一ATActgcagCCAAGCTTGGCTGTITTGGC— 3’ (内含 PstI 酶切位点)，(SEQ ID NO:18)；T1T2-R:5’ — TTAggatccCCCATTATTGAAGCATTTAT-3 (内含 BamHI 酶切位点)，(SEQ ID NO:19)；扩增程序如下:98°C预变性30s ;98°C变性10s，60°C复性20s，72°C延伸40s，30个循环后；72°C延伸10min，4°C保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到PGEM-T easy克隆载体后转化大肠杆菌DH5 a，筛选阳性克隆并测序，获得5ST1T2阳性克隆。实施例3同源重组载体构建将实施2中获得的5ST1T2阳性克隆(含T1T2片段)用pstl和BamHI进行双酶切，回收T1T2片段；pBluescript II SK( + )质粒同样用pstl和BamHI限制性内切酶进行处理，回收载体片段I。用回收的T1T2片段与载体片段I进行连接，获得pBluescript SK T1T2质粒。 将实施2中获得的同源重组上游臂阳性克隆用KpnI和XhoI双酶切，回收上游臂片段。pBluescript SK T1T2质粒同样用KpnI和XhoI双酶切，回收载体片段2。用回收的上游臂片段与载体片段2连接,获得pBluescript SK TlT2_ups质粒。将实施2中获得的同源重组下游臂阳性克隆用SpeI和SacII双酶切，回收下游臂片段。pBluescript SK TlT2_ups质粒同样用SpeI和SacII双酶切，回收载体片段3。用回收的上游臂片段与载体片段3连接,获得pBluescript SK TlT2-ups_ds质粒。将实施2中获得的psbA2启动子基因阳性克隆用SalI和EcoRI双酶切，回收psbA2启动子片段。pBluescript SK TlT2-ups_ds质粒同样用SalI和EcoRI双酶切,回收载体片段4。用回收的psbA2启动子片段与载体片段4连接,获得pBluescript SKTlT2-ups_ds-pro 质粒。将实施I中合成的sref8基因产物用EcoRI和PstI双酶切，回收sref8基因片段。pBluescript SK TlT2-ups_ds-pro质粒同样用EcoRI和PstI双酶切，回收载体片段5。用回收的sref8基因片段与载体片段5连接,获得pBluescript SK TlT2-ups-ds-pro-sref8质粒。将PUC4K质粒用BamHI单酶切，回收卡纳抗性片段(Km)。pBluescript SKTlT2-ups-ds-pro-sref8质粒同样用BamHI单酶切后回收载体片段6。连接卡纳抗性片段和载体片段 6,获得 pBluescript SK TlT2-ups-ds-pro-sref8_Km 质粒。构建载体期间，每连入一个片段，都要进行转化及质粒相应的酶切验证，最终获得具有上下游臂、启动子、终止子、卡纳抗性筛选片段及srefS基因的能够转化集胞藻Synechocystis sp.PCC6803的同源重组质粒(质粒图谱见图2)。实施例4转基因蓝藻转化子的获得挑取1-2接种环量的集胞藻6803野生型藻细胞接种于50ml BG-1l液体培养基中，置于30°C培养箱中，当OD730为0.5 0.7时，3000rpm离心IOmin收集藻体，用新鲜的BG-1l液体培养基重悬浮，调至OD73tl值为10。2 ii g的质粒DNA与400 藻细胞在玻璃管中充分混合，置于30°C培养箱中6h，然后涂布到铺在BG-1l平板培养基上灭菌后的微孔滤膜上，置于30°C培养箱中培养24h后，将膜转至含有5 u g/ml卡纳霉素的BG-1l固体平板培养基上，30°C培养箱中约2周后，会出现单克隆。挑取单克隆至含25 ii g/ml卡纳霉素的BG-1l固体平板培养基上进行分离纯化。所述BG-1I平板培养基每升组分如下:IM TES (三羟甲基甲胺基乙磺酸)/NaOH缓冲液(pH8.2) 10ml，硫代硫酸钠3g，琼脂粉15g，BG-1l液体培养基定容至1L。利用PCR检测插入的sref8基因及分离纯化，获得转sref8蓝藻转化子，PCR检测插入片段结果见图3，制得转基因集胞藻。实施例5反转录水平验证1、RNA提取利用热酚法提取转sref8蓝藻转化子的RNA，利用RNase-freeDNase (购自Qiagen公司)去除内含的DNA后，用Superscript III enzyme (购自Invitrogen公司)和随机引物进行反转录,获得cDNA。2、转录水平目的基因检测用于扩增检测sref8基因的引物:sref8 正向引物:TTGGACTTGACCGGATCT，(SEQ ID N0.9)sref8 反向引物:TCTTGACATC, (SEQ ID N0.10)用于扩增作为对照的16S rRNA基因的引物:16S rRNA 正向引物:AAGGTTTCCTCAGGCTGGTT，(SEQ ID N0.11)16S rRNA 反向引物:CGCGTCGATGTGAACTCT，(SEQ ID N0.12)验证表明，sref8基因在转录水平上成功表达，结果见图4。实施例6sref8蛋白表达检测1、全细胞 提取液或类囊体膜的制备:(I)转sref8蓝藻转化子菌株在30°C条件下,含有5mM葡萄糖和25mg/L卡纳霉素的BG-1l液体培养基中生长，当OD73tl达到0.6 0.8时，3，OOOrpm离心IOmin收集藻体。(2)用类囊体膜缓冲液(终浓度分别为20mM Mes (2_吗啉乙磺酸)/NaOH、pH6.4，5mM MgCl2, 5mM CaCl2J:^积百分数为 20% 的丙三醇，ImM 新鲜配置的 phenylmethylsulfonylfluoride (苯甲基横酸氟)和5mM benzamidine (节脉))冲洗悬浮,3, OOOrpm离心lOmin,用类囊体膜缓冲液悬浮至终体积0.6ml。(3)加入等体积类囊体膜缓冲液预湿的玻璃珠(直径0.1mm,购自BioSpec公司)，用迷你组织研磨机(BioSpec Products)进行细胞破碎,每次破碎30S后冰浴2min,重复3个循环。(4) 3，OOOrpm离心IOmin去除玻璃珠和细胞碎片，上清即为全细胞提取物。(5)将上清转移到高速离心管中，50，OOOg离心15min，沉淀物为类囊体膜。用类囊体缓冲液冲洗沉淀，最后悬浮沉淀至150 yl。类囊体膜样品用于SDS-PAGE分析。2、SDS-PAGE和免疫印迹分析(I)利用Bio-Rad蛋白分析试剂盒测定类囊体膜的蛋白浓度。(2)配制含6M尿素的8%_16%的梯度分离胶，2M尿素的5.5%浓缩胶。(3)类囊体膜样品与上样缓冲液(60mM Tris-HCl, pH6.8，2%SDS, 5%巯基乙醇,25%glycerol, and0.1%溴酹蓝)混合,37°C孵育20min。每个点样孔上样20 u g总蛋白量。(4)电泳后SDS-PAGE胶用考马斯亮蓝R250染色或根据标准步骤，用伯乐电转移(购自Bio-Rad公司)将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，后用特异性蛋白一抗和二抗(购自sigma公司)进行杂交,用BCIP/NBT Kit(购自Invitrogen公司)显色。利用C3H特异性抗体和Flag抗体杂交结果显示，sref8基因成功表达(见图5)，并且与ref8转基因藻株相比，srefS基因表达量远远超过ref8基因表达量(见图6)。实施例7咖啡酸的提取
1、产咖啡酸藻株的培养:将转基因集胞藻接种于BG-1l液体培养基中，制得原藻液，在30°C的条件下培养至OD73tl值为0.7时，3，OOOrpm离心IOmin收集藻体，用BG-1l液体培养基悬浮细胞至原藻液体积的1/10，然后加入0.5 ii M的对香豆酸，继续培养，三天后收集培养液。2、咖啡酸的萃取取4ml培养液，13000rpm离心2min，弃细胞，上清转移至一新的离心管中，用IMHCl调节pH至5.0置于-20°C冰箱中保存过夜。然后经过等体积乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用N2持续吹，直至样品吹干。用80%甲醇溶解样品残留物，用于HPLC和LC/MS检测。实施例8咖啡酸产物HPLC和LC/MS检测(I) HPLC 分析所用仪器为HPLC UV6000系统(美国热电产品)。色谱条件:色谱柱GRACE PrevailC18柱(4.6mmX250mm, 5um)、流动相:0.5%磷酸-100%甲醇(若洗脱用A/B溶剂比为0_2min为 95/5，2-4min 为 60/40，4_20min 为 60/40 到 20/80 的梯度洗脱，20_22min 为 10/90，22-26min再次用95/5)，流速lml/min、进样量10 yl。通过对香豆酸和咖啡酸标品(购自sigma公司)保留时间 和UV/Vis光谱结果的比较，检测样品中对香豆酸和咖啡酸出峰。(2)LC/MS 检测相同的HPLC上样柱及流动相用于LC/MS检测，通过安捷伦1100质谱检测器对香豆酸和咖啡酸峰进行验证。该检测除了用0.1%甲酸代替磷酸外，流速也降低为0.8ml/min。检测标品分子量为:对香豆酸163.1，咖啡酸179.9。结果显示，srefS转基因藻株在添加前提物质对香豆酸的条件下，能够成功的获得咖啡酸产物，为咖啡酸的生产提供了新的途径(见图7)。同时sref8转基因藻株咖啡酸的产量约为ref8转基因藻株产量的1.5倍(见图8)。
权利要求
1.一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法，其特征在于，步骤如下: (1)将核苷酸序列如SEQID N0.13所示的上臂基因插入质粒pBluescript II SK+的Kpn1-XhoI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示的下臂基因插入质粒pBluescript II SK+的Spe1-SacII内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ IDN0.15所示的卡纳抗性片段插入质粒pBluescript II SK+的BamH1-PstI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID N0.16所示的PsbA2启动子插入质粒pBluescript II SK+的Sal1-EcoRI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID N0.17所示的5ST1T2PCR转录终止子插入质粒pBluescript II SK+的Pst1-SmaI内切酶酶切位点之间，制得重组空白质粒; (2)将核苷酸序列如SEQID N0.1所述的基因片段插入步骤(I)制得的重组空白质粒的EcoR1-PstI内切酶酶切位点之间，制得重组质粒； (3)将步骤(2)制得的重组质粒转化集胞藻Synechocystissp.PCC6803，制得转基因集胞藻； (4)将步骤(3)制得的转基因集胞藻扩大培养后，经提取，制得咖啡酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的扩大培养，步骤如下: 将转基因集胞藻接种于BG-1l液体培养基中，制得原藻液，在28 32°C的条件下培养至OD73tl值为0.6 0.8时,经3000rpm离心IOmin,收集藻细胞,然后用原藻液1/10体积的新鲜BG-1l液体培养基悬浮藻细胞，并添加对香豆酸至终浓度为0.5 ii M/L，置于28 32°C的条件下培养3天，收集培养液。
3.如权利要求2所述的方 法，其特征在于，所述的BG-1l液体培养基，每升组分如下: BG-1l母液10ml，浓度为6mg/ml的柠檬酸铁铵溶液1ml，浓度为20mg/ml的Na2CO3溶液Iml,浓度为30.5mg/ml的K2HPO4溶液Iml,水定容至IL ； 上述BG-1l母液，每升组分如下:NaN03149.6g, MgSO4 7H207.5g, CaCl2 2H203.6g,柠檬酸 0.6g, pH8.0、浓度 0.25M 的NaEDTA溶液1.12ml，微量元素溶液100ml，水定容至IL ； 上述微量元素溶液，每升组分如下:H3B032.86g, MnCl2 4H201.81g, ZnSO4 7H200.22g, Na2MoO4 2H200.39g,CuSO4 5H200.079g, Co (NO3) 2 6H200.049g，水定容至 1L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的提取，步骤如下: 取4ml浓缩培养后的培养液，经离心，取上清液，调pH至5.0, -20°C保存过夜，经等体积乙酸乙酯萃取，浓缩后的残留物用80%的甲醇溶解，制得咖啡酸。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述离心条件为:13000rpm离心2min。
全文摘要
本发明涉及一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法，步骤如下(1)将相关基因片段插入质粒pBluescript II SK+内，制得重组空白质粒；(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述的基因片段插入步骤(1)制得的重组空白质粒的EcoRI-PstI内切酶酶切位点之间，制得重组质粒；(3)将重组质粒转化集胞藻Synechocystis sp.PCC6803，制得转基因集胞藻；(4)将步骤(3)制得的转基因集胞藻扩大培养后，经提取，制得咖啡酸。本发明通过构建转集胞藻PCC6803同源重组载体，转化集胞藻获得了在添加前体物质对香豆酸的条件下能够生产咖啡酸的藻株，为咖啡酸的生产提供了新的途径。
文档编号C12P7/42GK103243124SQ201310213780
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月31日 优先权日2013年5月31日
发明者何庆芳, 张燕, 薛勇, 毕玉平, 陈高, 葛海涛, 杨连群, 范仲学, 王俊燕, 于金慧, 董学卫, 彭振英, 边斐 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心