专利名称：：Hplc法同时测定蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量的方法
技术领域：
：本发明涉及中药质量检测领域，特别是一种HPLC法同时测定蒲公英制剂中绿原酸v咖啡酸含量的方法。二、
背景技术：
蒲公英为常用中药，对其质量控制还没有统一的标准。中国药典对蒲公英的质量控制仅局限于咖啡酸单种成分的薄层鉴别及含量测定，仍釆用了对西药质量控制的模式，不能全面地反映蒲公英的内在质量。现虽有人对不同地区蒲公英中咖啡酸的含量进行测定时，采用乙腈一0.2%磷酸为流动相、常温梯度洗脱，建立了快速、稳定的HPLC定量分析蒲公英中咖啡酸含量的方法。但是蒲公英药材品种比较混乱，质量不易控制，且常以浸膏作为制剂(蒲公英片剂、浸膏统称制剂，)入药，疗效好，价格便宜，而蒲公英浸膏作为蒲公英制剂的中间产品，是影响成品质量的关键因素之一。目前对蒲公英制剂的质量控制还没有统一的标准。咖啡酸、绿原酸为蒲公英中清热解毒主要成分，因蒲公英所含成分比较复杂，难以把咖啡酸、绿原酸与其它成分很好的分离，达到液相定量测定的要求，中国药典(2005年版)中蒲公英的含量测定项下，仅用HPLC法(高效液相色谱法)测定其中一个咖啡酸的含量。而绿原酸也为蒲公英中主要的抗菌成分，仅测出咖啡酸含量，并不能全面反映出蒲公英制剂的质量情况，故建立一种能同时测定蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量的方法具有重要的意义。三、
发明内容针对上述情况，为克服现有蒲公英制剂的质量控制缺陷，本发明的目的在于提供一种HPLC法同时测定蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量的方法，可有效解决以绿原酸和咖啡酸作为指标性成分，同时进行含量测定，对蒲公英制剂的质量标准奠定基础解决的问题，实现本发明的具体技术方案是分别制备供试品溶液和对照品溶液，用RP-HPLC法(反相高效液相色谱法)测定绿原酸、咖啡酸含量，其特征是对照品为绿原酸、咖啡酸；色谱条件为色谱柱为AichromBond-AQ柱(250咖X4.6mm，5ura)，流动相为甲醇一0.015%磷酸水，其中流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度0.015%的磷酸水，采用梯度洗脱，0.01—20min时，流动相A:流动相B的体积比为20%:80%(即O.Olmin时，流动相A与流动相B的体积比为20%:80%,保持到20min)，在20—40min，流动相A:流动相B的体积比为30%:70%(即在20—40min时，流动相A与B的体积比由初始时的2096:80%逐渐改变到30%:70%)，梯度洗脱程序见表l，流速为1.Oml/min，检测波长为323nm，柱温30。C4(TC。柱温最优为35i:。表1梯度洗脱程序时间(min)甲醇(A)(%)0.015%磷酸水溶液(B)(%)0,012080202080403070在测定绿原酸、咖啡酸含量前，利用流动相先对色谱柱进行平衡，流动相A与流动相B初始体积比为309&:7(m，在0—2min，流动相A与流动相B的体积比改变为2(m:8(m，保持到22min，流速为1.Oml/min，平衡色谱柱程序见表2。表2平衡色谱柱程序时间(min)流动相A(%)流动相B(%)0307022080222080本发明测定方法中，供试品溶液和对照品溶液的制备方法为:取蒲公英浸膏粉末O.16g左右(相当于1克药材)，加入体积浓度为5%甲酸的甲酸甲醇溶液(5%甲酸的甲酸甲醇溶液或称为5%甲酸的甲醇溶液，是指以体积计甲酸5%、甲醇95%构成的溶液，以下同)20ml，称定重量，超声提取30min，取出，放至18—25'C，加体积浓度为5%甲酸的甲酸甲醇溶液补足减失重量，过滤，取续滤液，再过滤，即得蒲公英浸膏供试品溶液；取蒲公英片剂粉末0.27g左右，加入体积浓度为5%甲酸的甲酸甲醇溶液10ml，称定重量，超声提取30min，取出，放至18—25。C，加体积浓度为5%甲酸的甲酸甲醇溶液补足减失重量，过滤，取续滤液，再过滤，即得蒲公英片剂供试品溶液；取咖啡酸对照品，加甲醇配成咖啡酸质量浓度为0.066mg/ml的咖啡酸溶液，过滤，即得咖啡酸对照品溶液。取绿原酸对照品，加甲醇配成绿原酸质量浓度为0.0784mg/ml的绿原酸溶液，过滤，即得绿原酸对照品溶液。称取蒲公英制剂，分别加入O.0784mg/ml绿原酸对照品溶液lml，0.066mg/ml咖啡酸对照品溶液2.5ml，即加入绿原酸对照品0.0784mg，咖啡酸对照品0.165mg，得混合对照品溶液。上述制备的供试品溶液和对照品溶液用0.45um微孔滤膜过滤，进样量为5y1，记录时间40min。本发明中所称的蒲公英制剂是指蒲公英浸膏和蒲公英片剂。本发明采用RP-HPLC法(反相高效液相色谱法)，梯度洗脱，测得蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量。结果咖啡酸在0.0264iig0.528ug范围内有良好的线性关系，平均回收率为99.09%，RSD为1.52%;绿原酸在0.03136ug0.6272ug范围内有良好的线性关系，平均回收率为98.52%，RSD为1.64%。本发明方法简便、可靠、迅速，灵敏度高，重现性好,回收率高，以绿原酸和咖啡酸作为指标性成分，为蒲公英及其制剂质量标准的制定奠定了基础，提供了更科学的依据。四图1为咖啡酸对照品色谱图。图2为绿原酸对照品色谱图。图3为蒲公英浸膏供试品色谱图。图4为蒲公英片剂供试品色谱图。五具体实施方式以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。实施例1:1.仪器与试药LC-10AD(日本岛津)高效液相色谱仪，紫外检测器，HW-2000色谱工作站；METTLERAE240型十万分之一分析天平，HANGPINGJA2003型电子天平，KQ-500DV型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；色谱甲醇(天津四友精细化学6品有限公司)，水(娃哈哈纯净水)，其它试剂均为分析纯。咖啡酸、绿原酸对照品为中国药品生物制品检定所生产，咖啡酸批号110885-200102，绿原酸批号110753-200413。蒲公英药材购自郑州市东升医药商店(河南产蒲公英)。蒲公英浸膏及蒲公英片为自制。2.方法与结果2.1色谱条件与系统适用性试验色谱条件为色谱柱为AichromBond-AQ柱(250ramX4.6mm，5wm)，流动相为甲醇一0.015%磷酸水，其中流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度0.015%的磷酸水，梯度洗脱，梯度洗脱程序及平衡色谱柱程序见表1、2,流速为1.0ml/rriin，检测波长为323nm，柱温35'C，进样量为1。在上述色谱条件下，对照品和供试品的色谱图见图1-4:表1梯度洗脱程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2平衡色谱柱程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2对照品溶液的制备取咖啡酸对照品，加甲醇配成咖啡酸质量浓度为0.066mg/ml的咖啡酸溶液，过0.45um微孔滤膜，即得咖啡酸对照品溶液。取绿原酸对照品，加甲醇配成绿原酸质量浓度为0.0784mg/ml的绿原酸溶液，过0.45"m微孔滤膜，即得绿原酸对照品溶液。浸膏制备方法取蒲公英，加水煎煮1.5小时，滤过，70—80'C,滤液浓縮至相对比重为1.11.4，75。C时，溶縮至比重1.24，加2.5倍量的乙醇，静置使其沉淀，滤取上清液，浓縮，在8(TC以下干燥成干浸膏。称取蒲公英浸膏0.08g，分别加入0.0784mg/ml绿原酸对照品溶液lml，0.066mg/ml咖啡酸对照品溶液2.5ml，即加入绿原酸对照品0.0784mg，咖啡酸对照品O.165mg，得混合对照品溶液。2.3供试品溶液的制备称定蒲公英浸膏粉末0.16g左右(相当于1克药材)，加入体积浓度为5%甲酸的甲酸甲醇溶液20ml，称定重量，超声提取(功率250W，频率40kHz)30min，取出放至18—25"C，加体积浓度为5%甲酸的甲酸甲醇溶液补足减失重量，过滤，取续滤液，用0.45um微孔滤膜过滤，即得蒲公英浸膏供试品溶液。称定蒲公英片剂粉末0.27g左右，加入体积浓度为5%甲酸的甲酸甲醇溶液10ml，称定重量，超声提取(功率250W，频率40kHz)30min，取出放至18—25°C，加体积浓度为5%甲酸的甲酸甲醇溶液补足减失重量，过滤，取续滤液，用0.45ym微孔滤膜过滤，即得蒲公英片剂供试品溶液。2.4样品含量的测定取待测10批浸膏，按照2.3项下供试品制备方法进行处理，制备浸膏溶液，注入液相色谱仪，每个样品进样两针，进样后根据峰面积用标准曲线法计算样品含量，取其平均值为平均百分含量，结果见表3。结果表明蒲公英浸膏中咖啡酸、绿原酸含量较稳定。表3十批浸膏含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>取待测10批片剂，按照2.3项下供试品制备方法进行处理，制备片剂溶液，注入液相色谱仪，每个样品进样两针，进样后根据峰面积用标准曲线法计算样品含量，.取其平均值为平均百分含量，结果见表4。结果表明蒲公英浸膏中咖啡酸、绿原酸含量较稳定。表4十批片剂含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2方法学考察1.线性关系考察称取咖啡酸对照品适量，加甲醇配成0.066mg/ml的对照品溶液，分别进样0.4、0.8、2、3、8ul，按照实施例1中色谱条件进样测定峰面积，以质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为Y二l.444e+006X，r=0.9999，在0.0264yg0.528ug范围内有良好的线性关系。称取绿原酸对照品适量，加甲醇配成0.0784mg/ml的对照品溶液，分别进样0.4、1、2、3、8ul，按照实施例1中色谱条件进样测定峰面积，以质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为Y二l.003e+006X，r=0.9999，在0.03136ug0.6272ug范围内有良好的线性关系。2.稳定性试验称定蒲公英浸膏J10号样品0.16g，按照实施例1中2.3项下蒲公英浸膏供试品制备方法进行处理，制备浸膏溶液，分别在0h、lh、2h、4h、8h、12h、24h进样，共进样7次，记录绿原酸、咖啡酸的峰面积，绿原酸峰面积变异系数为1.54%，咖啡酸峰面积变异系数为1.22%，表明蒲公英浸膏供试品溶液在24h内稳定。3.色谱系统的精密度试验称定蒲公英浸膏J10号样品0.16g，按照实施例1中2.3项下蒲公英浸膏供试品制备方法进行处理，制备浸膏溶液，连续进样5次，记录绿原酸、咖啡酸的峰面积，绿原酸峰面积变异系数为2.13%、咖啡酸峰面积变异系数为1.02%，表明色谱系统精密度良好。4.方法重复性试验称定蒲公英浸膏J10号样品0.16g，共取5份，按照实施例1中2.3项下蒲公英浸膏供试品制备方法进行处理，制备浸膏溶液，进样后记录咖啡酸、绿原酸的峰面积，5份样品中绿原酸含量变异系数为1.87%，咖啡酸峰含量变异系数为1.43%，表明方法重复性良好。5.回收率试验称取蒲公英浸膏J10号样品0.08g，共5份，分别加入0.0784mg/ml绿原酸标准溶液lml,0.066mg/ml咖啡酸标准溶液2.5ml，即加入绿原酸对照品0.0784mg，咖啡酸对照品0.165mg，得混合对照品溶液，按照实施例1中2.3项下蒲公英浸膏供试品制备方法进行处理，制备浸膏溶液，进样后根据峰面积用标准曲线法计算含量，求出回收率，绿原酸平均回收率为98.52%，RSD为1.64%，咖啡酸平均回收率为99.09%，RSD为1.52呢，结果见表5。表5加样回收试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>综上，本发明方法是在一个条件下同时对两个有效成分进行含量测定，方法简单、快速、准确，是蒲公英及其制剂有效成分含量测定的理想方法。发明人曾尝试用等度洗脱测定绿原酸、咖啡酸含量，但发现虽然出峰时间较快，但峰形及分离度都不佳，后采用梯度洗脱，30分钟内绿原酸和咖啡酸都出峰，且分离良好，峰形较佳，重复性较好。流动相采用甲醇一磷酸水，且PH值适宜，同时测定绿原酸和咖啡酸两个有效成分，优于药典法。权利要求1、HPLC法同时测定蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量的方法，是分别制备供试品溶液和对照品溶液，用RP-HPLC法测定绿原酸、咖啡酸含量，其特征是对照品为绿原酸、咖啡酸；色谱条件为色谱柱为AichromBond-AQ柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为甲醇-0.015％磷酸水，其中流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度0.015％的磷酸水，采用梯度洗脱，0.01-20min时，流动相A∶流动相B的体积比为20％∶80％即0.01min时，流动相A与流动相B的体积比为20％∶80％，保持到20min，在20-40min，流动相A∶流动相B的体积比为30％∶70％，即在20-40min时，流动相A与B的体积比由初始时的20％∶80％逐渐改变到30％∶70％，流速为1.0ml/min，检测波长为323nm，柱温30℃～40℃；在测定绿原酸、咖啡酸含量前，利用流动相先对色谱柱进行平衡，流动相A与流动相B初始体积比为30％∶70％，在0-2min，流动相A与流动相B的体积比改变为20％∶80％，保持到22min，流速为1.0ml/min；供试品溶液和对照品溶液的制备方法为取蒲公英浸膏粉末0.16g左右，加入体积浓度为5％甲酸的甲酸甲醇溶液20ml，称定重量，超声提取30min，取出，放至18-25℃，加体积浓度为5％甲酸的甲酸甲醇溶液补足减失重量，过滤，取续滤液，再过滤，即得蒲公英浸膏供试品溶液；取蒲公英片剂粉末0.27g左右，加入体积浓度为5％甲酸的甲酸甲醇溶液10ml，称定重量，超声提取30min，取出，放至18-25℃，加体积浓度为5％甲酸的甲酸甲醇溶液补足减失重量，过滤，取续滤液，再过滤，即得蒲公英片剂供试品溶液；取咖啡酸对照品，加甲醇配成咖啡酸质量浓度为0.066mg/ml的咖啡酸溶液，过滤，即得咖啡酸对照品溶液；取绿原酸对照品，加甲醇配成绿原酸质量浓度为0.0784mg/ml的绿原酸溶液，过滤，即得绿原酸对照品溶液；称取蒲公英制剂，分别加入0.0784mg/ml绿原酸对照品溶液1ml，0.066mg/ml咖啡酸对照品溶液2.5ml，即加入绿原酸对照品0.0784mg，咖啡酸对照品0.165mg，得混合对照品溶液。2、根据权利要求1所述的HPLC法同时测定蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量的方法，其特征在于，所说的柱温为35'C。3、根据权利要求1所述的HPLC法同时测定蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量的方法，其特征在于，所说的制备的供试品溶液和对照品溶液用0.45ym微孔滤膜过滤，进样量为5ul，记录时间40min。4、根据权利要求1所述的HPLC法同时测定蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量的方法，其特征在于，所说的蒲公英制剂是指蒲公英浸膏和蒲公英片剂。全文摘要本发明涉及一种HPLC法同时测定蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量的方法，可有效解决以绿原酸和咖啡酸作为指标性成分，同时进行含量测定，对蒲公英制剂的质量标准奠定基础解决的问题，实现本发明的具体技术方案是分别制备供试品溶液和对照品溶液，用RP-HPLC法，梯度洗脱，流动相采用甲醇—磷酸水，测定绿原酸、咖啡酸含量，本发明方法简便、可靠、迅速，灵敏度高，重现性好，回收率高，以绿原酸和咖啡酸作为指标性成分，为蒲公英及其制剂质量标准的制定奠定了基础，提供了更科学的依据。文档编号G01N30/06GK101324546SQ200810140829公开日2008年12月17日申请日期2008年7月28日优先权日2008年7月28日发明者璐孟,师绘敏,朱艳琴,李喜凤,董诚明,闽许,陈随清申请人:河南中医学院