提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法

专利名称：提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法
技术领域：
本发明属于天然产物的生物资源化利用领域，涉及修复植物一海州香薷中抗菌抗肿瘤活性成分咖啡酸的分离纯化方法。
背景技术：
海州香薷(Elsholtzia splendens)，又称铜草，为唇形科香薷属植物，在我国长期被定为药材香薷的基原植物，但1995版药典对此进行了修改。民间对海州香需的应用较为广泛，功效似香薷。早在1953年，著名勘探地球化学家谢学锦院士和徐邦梁先生发现并报道了海州香薷是铜矿的指示植物，是我国寻找铜矿和铜矿开采的有效指示植物。近年来，我国学者对海州香薷忍耐和积累铜进行了大量的调查和研究。海州香薷被广泛用于废旧铜矿及铜污染土壤的生态恢复。创立和集成海州香薷对污染土壤植物修复及其产后资源化的技术体系，如何合理资源化利用修复植物海州香薷是一个亟待解决的瓶颈问题。咖啡酸(Caffeic acid)又名水解咖啡鞣酸、3，4_ 二羟基肉桂酸、3_(3，4_ 二羟基苯基)-2_丙烯酸，为桂皮酸类化合物，分子式C9H8O4,分子量180. 15 ；为黄色结晶，分解点 223 225°C (在194°C软化)。微溶于冷水，易溶于热水及冷乙醇。普遍存在于当归、川芎等常用植物药中，通常存在于菊科、蔷薇科、无患子科、毛茛科、水龙骨科、芸香科、蓼科、败酱科、唇形科以及杜仲科植物的花、叶或果实当中。具有抗菌、抗病毒、抗蛇毒、抗腹泻、抗生育及抗肿瘤等多种药理活性，还具有凉血止血功能。有文献报道咖啡酸可竞争性地抑制内皮素-KEndothdin-l，ET-1)与受体的结合，常用于治疗高血压、冠心病、心律失常等疾病。 作为羟基肉桂酸的代表化合物，咖啡酸具有很强的抗氧化活性。咖啡酸具有多种药理活性，因而咖啡酸及其衍生物的制备已经得到越来越多的关注。采用传统化学合成方法制备咖啡酸，存在反应时间长、纯度不理想、产品中有害物质残留高，造成咖啡酸产品不理想等。卞建刚等人的专利“一种咖啡酸原料药的制备方法”(专利号ZL 200910015552. 9)中公开的方法在反应釜中加入DMF和无水吡啶的混合溶剂，再加入3，4- 二羟基苯甲醛和丙二酸，溶解制得反应溶液，加入催化剂三苯甲基钠和三甲基哌啶，开启搅拌升温至70-100°C反应生成咖啡酸，然后经干燥得咖啡酸产品。然而此方法须在高温高压无水条件下进行，反应条件苛刻、危险性高、原料复杂、成本高，且有害性原料仍有少量残余，难以保证药品安全。海州香薷具有忍耐高铜环境的能力。修复高铜环境的海州香薷中咖啡酸含量高。 咖啡酸是海州香薷植物的主要活性成分之一。海州香薷植物中的咖啡酸与其体内的铜离子代谢紧密关联。据报道，咖啡酸本身不与Cu(II)螯合，而是咖啡酸酚氧负离子(ArCT)作为双齿配体与Cu(II)进行螯合，形成的酚氧负离子-Cu(II)络合物(ArO--Cu)通过分子内电子转移生成咖啡酸邻醌结构和Cu(I)。海州香薷具有忍耐高铜的特性或许与其体内含有大量的咖啡酸有关，这不仅为深入研究海州香薷忍耐及积累铜的机理提供理论依据，而且为开发植物源咖啡酸提供技术基础。目前国内尚无报道从植物中提取高得率(> 0. 09% )高纯度(> 98% )咖啡酸的工艺技术专利，也没有报道关于从修复植物海州香薷中分离纯化活性成分咖啡酸的方法。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法， 采用本发明的方法能高得率的获取高纯度的咖啡酸。为了解决上述技术问题，本发明提供一种提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法，依次包括以下步骤1)、粗提将盛花期收获的海州香薷花枝和叶片风干后磨成干粉末，用体积浓度彡95%的乙醇浸泡至少2天，干粉末与乙醇的重量/体积为1kg干粉末/8 15L乙醇；再超声波处理0. 5 1. 5h，过滤后得到提取液，提取液经真空浓缩，得稀浸膏；2)、萃取按照每kg稀浸膏配用5 8L超纯水的用量比，将上述稀浸膏用超纯水溶解，然后再用与超纯水相同体积的石油醚反复萃取，直至所得的石油醚层无色；得石油醚层和水层；将上述水层用与超纯水相同体积的乙酸乙酯反复萃取，直至所得的萃取液(即乙酸乙酯萃取层)在254nm和365nm紫外下均无荧光；合并所得的乙酸乙酯萃取层然后进行减压浓缩，得棕黑色的乙酸乙酯层浸膏；3)、大孔树脂粗分离将步骤2)所得的棕黑色的乙酸乙酯层浸膏制成水液，上样于DlOl大孔树脂并充分吸附，并分别以1 2BV(BV指树脂床体积)的水、2 4BV的体积浓度为10% (V/V)乙醇、5 8BV的体积浓度为20% (V/V)乙醇进行梯度洗脱；收集含有咖啡酸成份的体积浓度为20%乙醇流出液，浓缩后得到黄棕色浸膏；在发明过程中，上述收集步骤具体如下收集流出液并分别对每管中的流出液进行TLC点板(薄层层析，展开剂CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1)，通过与咖啡酸标准品对照，观察到20%乙醇洗脱后的流出液中有咖啡酸成份的存在，在紫外灯(254nm)下显蓝色荧光，且遇FeCl3I灰黑色；继续用20%乙醇洗脱至流出液通过TLC点板后无咖啡酸成份；合并上述含有咖啡酸成份的20%乙醇流出液；浓缩后得到黄棕色浸膏；4)、薄层硅胶纯化精制将薄层层析硅胶H用二氯甲烷溶解后加压装柱，薄层层析硅胶H与二氯甲烷的质量体积比为lg/4 8ml ；此步骤中，薄层层析硅胶H与黄棕色浸膏的重量比为15 20 1 ；将步骤3)所得的黄棕色浸膏用甲醇溶解后加入薄层层析硅胶H进行拌样，旋干后将所得的拌样装在柱顶端；此步骤中，薄层层析硅胶H与黄棕色浸膏的重量比为2 4:1;以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1的体积比为洗脱体系，收集各管流出液， 并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、FeCl3显灰黑色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准(不能同时满足这3项标准的流出液就作废弃处理)，将Rf = 0. 5 (斑点在硅胶板上的比移值)且为单一斑点的各管合并，45 50°C旋蒸至干，得到淡黄色物质，该淡黄色物质为咖啡酸。作为本发明的提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法的改进步骤3)的大孔树脂粗分离中进行梯度洗脱时，洗脱液(即水、10% V/V乙醇和20% V/V乙醇)的流速控制在 0. 5-1. 2BV/h。作为本发明的提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法的进一步改进步骤1) 的浸泡时间为2 4天，然后再在30 50KHz的超声强度下处理0. 5 1. 5小时。本发明中，精制纯化所采用的填充材料薄层层析硅胶H与原料(大孔树脂粗分离得到的黄棕色浸膏)的比例为15 1 20 1(W/W)，将薄层层析硅胶H用二氯甲烷溶解后加压装柱，其中薄层硅胶H于二氯甲烷的比例为1 4 1 8(W/V)。同时将所得的黄棕色浸膏用甲醇溶解后加入薄层层析硅胶H进行拌样，以薄层层析硅胶H与黄棕色浸膏的比例为2 1 4 1(W/W)，旋干后将其装在柱顶端。本发明中，通过薄层硅胶柱精制纯化的洗脱液中加入了适量的甲酸屏蔽掉杂质的干扰，所采用的洗脱体系是CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1，对薄层硅胶柱上样中的咖啡酸具有最好分离效果；以TLC点板跟踪时紫外灯下显蓝色荧光且斑点在硅胶板上的比移值Rf = 0. 5为收集洗脱液的标准(没有其他杂质的干扰)。本发明所得的淡黄色物质进行如下化学结构鉴定将薄层硅胶纯化精制得到的淡黄色物质用超纯水溶解，于-40°C -80°C冰冻2 4小时，真空冷冻干燥得到淡黄色结晶状的产品，所述产品的纯度高于98%。再用核磁共振氢谱、碳谱和质谱表征该产品的化学结构，确证为咖啡酸。该咖啡酸提取工艺效率高，提取到咖啡酸的得率高于0. 09%。液相色谱检测纯度高于98%。本发明的显著优点和效果(1)本发明的海州香薷植物中提取到抗肿瘤成份咖啡酸的方法，为室温提取，节省能源并可避免提取过程中有效成分的破坏。通过浸提与超声提取相结合的方法得到高产量的乙醇提取物，再通过石油醚、乙酸乙酯深度萃取使提取过程中咖啡酸的损失降到最低，产率高。(2)通过大孔树脂粗分离和薄层硅胶精制，并在薄层硅胶洗脱液中加入一定量的甲酸，采用洗脱体系CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1，可以屏蔽掉大部分杂质的干扰，得到咖啡酸产物纯度高达98. 0%以上，得率高于0. 09%。(3)采用本发明的从海州香薷植物中提取到的活性成份咖啡酸的方法，具有提取工艺简单、安全、成本低、污染小的特点，适于工业化生产。综上所述，本发明提供的海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的提取方法，是一种生物修复植物海州香薷产后资源化利用的新途径。采用本发明的方法从修复植物海州香薷中提取抗肿瘤成份咖啡酸，该提取工艺的提取效率高，提取工艺简单安全。提取到的活性成份咖啡酸纯度高达98. 0 %，本发明的得率约为0. 09 %。


下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1为海州香薷中咖啡酸产品的提取分离纯化流程图；图2为本发明的海州香薷中提取的咖啡酸产品的核磁共振氢谱图；图3为本发明的海州香薷中提取的咖啡酸产品的核磁共振碳谱图；图4为本发明的海州香薷中提取的咖啡酸产品的负离子质谱图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。海州香薷中咖啡酸产品的提取分离流程如图1所示。实施例1 一种提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法，依次进行以下步骤1)、粗提将盛花期收获的海州香薷花枝和叶片风干后磨成干粉末(含水率低于0.5%，重量比)，过100目的筛，取上述500g干粉末，置于IOL的塑料桶中，加入95% (V/V)乙醇5L， 搅拌均勻浸泡3天至材料完全吸涨，40KHz的超声频率处理1小时，抽滤得滤液。将抽滤所得的残渣重复上述过程共3次(即以残渣替代干粉末，重复上述浸提)。合并4次浸提所得的滤液；再经45°C真空浓缩，得126. Ig的稀浸膏①。产率 25. 22%。2)、萃取将上述126. Ig的稀浸膏①用750ml超纯水溶解，用石油醚萃取15次(每次石油醚的用量为750ml)，至石油醚层基本无色(主要为无绿色)，且在254nm和365nm紫外下均
无荧光。合并上述15次的石油醚层，35°C旋转蒸发回收石油醚，得到20. 468g的石油醚层浸膏②，产率16. 23%。将水层继续用乙酸乙酯萃取25次(每次乙酸乙酯的用量是750ml)，至乙酸乙酯层无颜色且在254nm和365nm紫外下均无荧光。40°C旋转蒸发回收乙酸乙酯，得到19. 755g 的棕黑色浸膏③(即，棕黑色的乙酸乙酯层浸膏)，产率15. 67%。3)、大孔树脂粗分离准备DlOl型大孔吸附树脂，体积269ml，先用大量的蒸馏水冲洗，并除去漂浮的碎树脂颗粒，再在层析柱中用乙醇浸泡过夜，然后用乙醇淋洗至流出液与水按1 5(体积比) 混合无浑浊。再将上述DlOl型大孔吸附树脂中的乙醇用大量的蒸馏水冲干净，至无醇味。将上述19. 755g的棕黑色浸膏③加超纯水从而制成IOOml水溶液，加入在上述洗干净的DlOl型大孔树脂层析柱的上部；从而使上述水溶液被充分吸收。分别以IBV的水、2BV的10% (V/V)乙醇、5BV的20% (V/V)乙醇对DlOl型大孔树脂进行梯度洗脱，流速控制在0.5BV/h。收集各管洗脱液，每管大约50ml。直至用20% (V/V)乙醇洗脱至流出液通过TLC跟踪紫外灯下无咖啡酸成分存在(BV表示倍数于树脂床的体积，5BV的用量能达到该要求)。分别对每管中的洗脱液进行TLC点板，以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1 为展开剂，通过与咖啡酸标准品比对；将斑点比移值Rf相同(Rf = 0. 5)，紫外灯(254nm)下显蓝色荧光且遇(质量比)FeCl3I灰黑色特征的20%乙醇洗脱液(含有咖啡酸成份) 合并，并浓缩得到2. 430g的黄棕色浸膏④，产率12. 30%。置冰箱备用。不符合上述标准的其他洗脱液作废液处理。4)、薄层硅胶纯化精制将45g的薄层层析硅胶H用300ml的二氯甲烷溶解后，搅拌去气泡，加压装柱；将步骤3)所得的2. 430g的黄棕色浸膏④用IOml的甲醇溶解后加入5g的薄层层析硅胶H进行拌样，旋干后将其装在柱顶端。
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以体积比为CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1的洗脱体系进行加压过柱洗脱， 共需洗脱液约3500ml，TLC点板时紫外灯下观察到淡荧光开始收集流出液，每管收集10ml， 并随时进行TLC点板跟踪，通过与咖啡酸标准品进行比对，以紫外灯下显蓝色荧光、(质量比)FeCl3显灰黑色、且碘熏硅胶板无杂质三项指标为准。将符合上述标准，且斑点在硅胶板上的比移值Rf = 0. 5的且为单一斑点的各管合并，50°C旋蒸至干，得到淡黄色的产物，约513mg。不符合标准的洗脱液作废液处理。5)、数据分析将上述513mg的淡黄色产物用20ml的超纯水溶解，_40°C冰冻2小时，真空冷冻(-80°C )干燥得到产品458mg，产品呈黄色结晶。得率计算(458mg/500g) X 100% = 0. 0916%。纯化的淡黄色结晶用氘代甲醇溶解送谱，核磁共振氢谱、碳谱鉴定结构。数据如下1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 7. 55 (1Η, d, J = 16. OHz)，7. 05 (1H，d, J = 1. 5Hz)， 6. 95 (1H, dd, J = 2Hz,8Hz)，6. 79 (1H, d, J = 8Hz)，6. 23 (1H, d, J = 16Hz)。13C NMR (500MHz, CD3OD) δ 169. 86，148. 27，145. 85，145. 63，126. 68，121. 66， 115. 35，114. 43，113. 97。结果表明(如图2-3)，与咖啡酸标准品的谱图相比照，淡黄色结晶的核磁共振氢谱中，其化学位移、偶合常数、峰型以及氢的数量几乎完全吻合；淡黄色结晶的核磁共振碳谱中，共含9个碳原子，且各碳原子的化学位移均基本保持一致。质谱数据(如图4)经过负离子质谱(ESI-MS)，淡黄色结晶中，有两个主峰 [Μ-1Γ = 179. 16，[2Μ-1Γ = 358. 77。[2Μ-1Γ = 358. 77是咖啡酸之间形成分子间氢键而成的双分子聚合体的负离子峰。还原后可得分子量约为180. 16。与咖啡酸标准品相符合。液相色谱数据称取海州香薷中提取的纯化的咖啡酸产品(淡黄色结晶)，配成浓度为lmg/ml的甲醇溶液，进行高效液相色谱分析(仪器条件Agilent Exlipse XDB C18色谱柱；流动相为乙腈0. 5%磷酸=15 85 ；进样量IOul ；流速lml/min ；波长323nm ；柱温 21°C )。结果表明从海州香薷中提取的咖啡酸产品(淡黄色结晶)纯度达到98. 266%。采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析表明，提取的咖啡酸产品中含有 0. 0015mg/kg Cu，低于国家卫生标准。实施例2 —种提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法，依次进行以下步骤1)、粗提将盛花期收获的海州香薷花枝和叶片风干后磨成干粉末，过100目的筛，取上述 5000g干粉末，置于100L的塑料桶中，加入95% (V/V)乙醇75L，搅拌均勻浸泡4天至材料完全吸涨，40KHz的超声频率处理1小时，抽滤得滤液。将抽滤所得的残渣重复上述过程共3次(即以残渣替代干粉末，重复上述浸提)。合并4次浸提所得的滤液；再经45°C真空浓缩，得1275. Ig的稀浸膏①。产率 25. 50%。2)、萃取将上述1275. Ig的稀浸膏①用8L超纯水溶解，用石油醚萃取15次(每次石油醚的用量为8L)，至石油醚层基本无色，且在254nm和365nm紫外下均无荧光。
合并上述15次的石油醚层，35°C旋转蒸发回收石油醚，得到202. Ig的石油醚层浸膏②，产率15. 85%。将水层继续用乙酸乙酯萃取25次(每次乙酸乙酯的用量是8L)，至乙酸乙酯层无颜色且在254nm和365nm紫外下均无荧光。40°C旋转蒸发回收乙酸乙酯，得到191. 6g的棕黑色浸膏③，产率15. 03%。3)、大孔树脂粗分离准备DlOl型大孔吸附树脂，体积2700ml，先用大量的蒸馏水冲洗，并除去漂浮的碎树脂颗粒，再在层析柱中用乙醇浸泡过夜，然后用乙醇淋洗至流出液与水按1 5混合无浑浊。再将上述DlOl型大孔吸附树脂中的乙醇用大量的蒸馏水冲干净，至无醇味。将上述191. 6g的棕黑色浸膏③加超纯水制成IOOOml水溶液，加入在上述洗干净的DlOl型大孔树脂层析柱的上部；从而使上述水溶液被充分吸收。分别以2BV的水、3BV的10% (V/V)乙醇、7BV的20% (V/V)乙醇对DlOl型大孔树脂进行梯度洗脱，流速控制在0.8BV/h。收集各管洗脱液，每管大约200ml。直至用20% (V/V)乙醇洗脱至流出液通过TLC跟踪紫外灯下无咖啡酸成分存在(7BV的用量能达到上述要求)。分别对每管中的洗脱液进行TLC点板，以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1 为展开剂，通过与标准品咖啡酸比对，将斑点比移值Rf相同(Rf = 0.5)，紫外灯(254nm) 下显蓝色荧光且遇FeCl3显灰黑色特征的含有咖啡酸成份的20%乙醇洗脱的流出液合并，并浓缩得到23. 581g的黄棕色浸膏④，产率12. 31%。置冰箱备用。不符合上述标准的其他洗脱液作废液处理。4)、薄层硅胶纯化精制将460g的薄层层析硅胶H用3200ml的二氯甲烷溶解后，搅拌去气泡，加压装柱；将步骤3)所得的23. 581g的黄棕色浸膏④用80ml的甲醇溶解后加入80. 5g的薄层层析硅胶H进行拌样，旋干后将其装在柱顶端。以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1的体积比为洗脱体系进行加压过柱洗脱， 共需洗脱液约40L。TLC点板时紫外灯下观察到淡荧光开始收集流出液，每管收集10ml，并随时进行TLC点板跟踪，通过与咖啡酸标准品进行比对，以紫外灯下显蓝色荧光、FeCl3 显灰黑色且碘熏硅胶板无杂质三项指标为准。将符合上述标准，且斑点在硅胶板上的比移值Rf = 0. 5的且为单一斑点的各管合并，50°C旋蒸至干，得到淡黄色的产物，约5. 097g。不符合标准的洗脱液作废液处理。5)、数据分析将上述5. 097g的淡黄色的产物用150ml的超纯水溶解，_40°C冰冻2小时，真空冷冻(-80°C)干燥得到产品4.607g，产品呈黄色结晶。总产率0.0921%。高效液相检测咖啡酸纯度为98. 18%。纯化的淡黄色结晶用氘代甲醇溶解送谱，核磁共振氢谱、碳谱鉴定结构。数据如下1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 7. 55 (1Η, d, J = 15. 5Hz), 7. 06 (1H, d, J = 2Hz)， 6. 95 (1H, dd, J = 2Hz,8Hz)，6. 79 (1H, d, J = 8Hz)，6. 24 (1H, d, J = 16Hz) ·13C NMR (500MHz, CD3OD) δ 169. 90，148. 24，145. 90，145. 56，126. 55，121. 77，115. 26，114. 25，113. 84.结果表明，淡黄色结晶的核磁共振氢谱、碳谱均符合咖啡酸标准品的谱图。经过负离子质谱(ESI-MS)，淡黄色结晶的质谱数据同实施例1，与咖啡酸标准品相符合。高效液相色谱方法如实施例1，结果表明从海州香薷中提取的咖啡酸产品(淡黄色结晶)纯度达到98. 18%。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析表明，咖啡酸产品中重金属含量含有 0. 0019mg/kg Cu，低于国家卫生标准。实施例1的方法与文献报道方法的先进性对比。如郑旭东等(2006年)在香薷化学成分的研究中报道取香薷全草1. 5kg (干重)剪碎后，以EtOH室温浸提(5L，7dX 3)，滤出液减压浓缩得浸膏58g，再以热水混悬，依次用石油醚、CHCl3和EtOAc萃取，并浓缩得到氯仿浸膏18g，乙酸乙酯浸膏25g。氯仿浸膏经硅胶柱层析，用石油醚氯仿(9 1-1 9) 进行梯度洗脱，经纯化最终得到咖啡酸12mg，得率仅为0. 0008%。实施例1的海州香薷干样中咖啡酸含量测定将海州香薷花枝和叶片干粉，根据实施例1中的方法采用95% (V/V)乙醇提取、40KHz的超声频率处理1小时，抽滤得滤液， 配制成Ig干粉/120ml甲醇的溶液，高效液相色谱(仪器条件同上)分析测定后，计算出海州香薷干粉中咖啡酸含量为1100. 16mg/kg,即0. 1100%。采用本实施例1的方法提取到的咖啡酸产品得率为0. 0916%，提取过程中咖啡酸的损失率约0. 018%，提取工艺的提取效率高，而且提取工艺简单安全。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法，其特征是依次包括以下步骤1)、粗提将盛花期收获的海州香薷花枝和叶片风干后磨成干粉末，用体积浓度彡95%的乙醇浸泡至少2天，所述干粉末与乙醇的重量/体积为1kg干粉末/8 15L乙醇；再超声波处理0. 5 1. 5h，过滤后得到提取液，提取液经真空浓缩，得稀浸膏；2)、萃取按照每kg稀浸膏配用5 8L超纯水的用量比，将上述稀浸膏用超纯水溶解， 然后再用与超纯水相同体积的石油醚反复萃取，直至所得的石油醚层无色；得石油醚层和水层；将上述水层用与超纯水相同体积的乙酸乙酯反复萃取，直至所得的萃取液在254nm和 365nm紫外下均无荧光；合并所得的乙酸乙酯萃取层然后进行减压浓缩，得棕黑色的乙酸乙酯层浸膏；3)、大孔树脂粗分离将步骤2)所得的棕黑色的乙酸乙酯层浸膏制成水液，上样于DlOl大孔树脂并充分吸附，并分别以1 2BV的水、2 4BV的体积浓度为10%乙醇、5 8BV的体积浓度为20% 乙醇进行梯度洗脱；收集含有咖啡酸成份的体积浓度为20%乙醇流出液，浓缩后得到黄棕色浸膏；4)、薄层硅胶纯化精制将薄层层析硅胶H用二氯甲烷溶解后加压装柱，薄层层析硅胶H与二氯甲烷的质量体积比为lg/4 8ml ；此步骤中，薄层层析硅胶H与黄棕色浸膏的重量比为15 20 1 ；将步骤3)所得的黄棕色浸膏用甲醇溶解后加入薄层层析硅胶H进行拌样，旋干后将所得的拌样装在柱顶端；此步骤中，薄层层析硅胶H与黄棕色浸膏的重量比为2 4 1 ；以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1的体积比为洗脱体系，收集各管流出液，并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、FeCl3显灰黑色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf = 0. 5且为单一斑点的各管合并，45 50°C旋蒸至干，得到淡黄色物质， 所述淡黄色物质为咖啡酸。
2.根据权利要求1所述的提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法，其特征是所述步骤3)的大孔树脂粗分离中进行梯度洗脱时，洗脱液的流速控制在0. 5-1. 2BV/h。
3.根据权利要求1或2所述的提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法，其特征是 所述步骤1)的浸泡时间为2 4天，然后再在30 50KHz的超声强度下处理0. 5 1. 5 小时。
全文摘要
本发明公开了一种提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法，依次包括以下步骤1)粗提将海州香薷花枝和叶片用乙醇浸泡等处理后，得稀浸膏；2)萃取将稀浸膏水溶后，先石油醚萃取，所得水层用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯层浸膏；3)将乙酸乙酯层浸膏采用大孔树脂粗分离，得黄棕色浸膏；4)将黄棕色浸膏采用薄层硅胶纯化精制，以CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝30∶1∶1的体积比为洗脱体系，得咖啡酸。采用本发明的方法能高得率的获取高纯度的咖啡酸。
文档编号C07C51/42GK102249898SQ20111013627
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者张梦希, 张良, 彭红云, 邢严 申请人:浙江大学