专利名称：：一种采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法
技术领域：
：本发明属于中药材提取
技术领域：
，涉及从具有清热解毒和抗菌消炎的金银花中提取药用有效成分绿原酸的新工艺。更具体的说是通过单因素试验和正交试验，优化出复合酶法提取金银花中绿原酸的最佳工艺。
背景技术：
：金银花为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)的干燥花蕾或带初开的花，为常用清热解毒和抗菌消炎的中药材之一(芦绪芳.金银花的研究现状[J].时珍国医国药，2006，17(5):843-844)。其化学成分为绿原酸、异绿原酸、挥发油、咖啡酸、黄酮类化合物、三萜皂苷、木犀草素等(吴晓春，杨苏亚.金银花的成分及药理作用分析[J].青海医药杂志，2007，37(5):88-89)。其中绿原酸是金银花的主要药效活性成分，用来评价金银花的质量。绿原酸是胞内物质，其细胞壁主要由纤维素组成，纤维素酶是可将纤维素水解成水溶性糖的复合酶类。(刘翔，何国庆.纤维素酶及相关酶在食品生物技术中的应用[J].粮油加工与食品机械，2006，06:61-63；向智男，宁正祥.金银花中绿原酸的提取及纯化方法比较[J].林产化学与工业，2006，26(1):116-120)。绿原酸的药理作用绿原酸的主要药理作用为抗菌消炎和抗病毒，此外还具有保护心血管的活性。金银花用纤维素酶处理后，细胞壁中的纤维素被水解成水溶性的糖类物质，而细胞壁的水解破裂有利于胞内物质的溶出，因而酶法提取能提高绿原酸的提取率。目前文献报道的金银花中绿原酸的提取工艺有主要有水煎法、酸碱浸提法，乙醇回流法等，利用简单的物理方法提取金银花中的有效成分绿原酸，但上述方法存在着提取率较低、成本较高且造成环境污染等问题；而近来利用超声波法、超临界CO2萃取等新型物理仪器提取绿原酸的方法，因提取效率较高而受到广泛关注，但由于在生产中存在投资过大，操作繁琐等问题而限制了上述方法在工业生产中的普及使用。
发明内容本发明针对目前金银花中提取绿原酸工艺中存在的缺点与不足，提出采用纤维素酶与果胶酶的复合酶法新工艺提取绿原酸，考察了酶的用量、酶解时间、酶解温度及纤维素酶与果胶酶复合比等影响因素，优化出了纤维素酶与果胶酶复合酶法提取最佳工艺条件。采用《中国药典》2005版HPLC法测定绿原酸含量，计算绿原酸提取率。纤维素酶与果胶酶复合酶新工艺提取金银花中绿原酸，比传统水提工艺提高了16.93%的提取率。为达到上述目的，本发明提供如下的技术方案一种采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法，其特征在于按如下的步骤进行(1)按照200_400U/g药材加入复合酶，控制酶解温度在40°C-45°C，pH值4.5-5.0，酶解时间1-2小时，处理金银花；其中所述的复合酶为纤维素酶与果胶酶混合物；(2)酶解完成后，按药材重量10倍量加入70-90°C水，浸提2_3次，每次l_3h小时，合并浸出液，减压浓缩；(3)将浓缩液溶于50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法测定绿原酸含量，计算绿原酸提取率；其中纤维素酶与果胶酶复合比为1.00.1-0.3。本发明所述的采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法，其中纤维素酶的最适合酶活力为pH值4.5，最适温度为40°C，添加量为200U/g药材；果胶酶的最适合酶活力为pH值5.0，最适温度为45°C，添加量为400U/g药材；纤维素酶与果胶酶复合比为1.00.3。本发明的具体试验方法如下2.方法与结果1.仪器与试剂高效液相色谱仪ShimadzuLC-2010A，包括四元输液泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱，紫外检测器LCsolution色谱工作站电子天平SartoriusBP211D，精密度万分之一旋转蒸发仪无锡市星海王生化设备有限公司，规格R20升恒温水浴锅河南豫华仪器有限公司，型号97冊绿原酸标准品中国药品生物制品检定所，批号110753_200413酶纤维素酶(40000U)、果胶酶(30000U)天津利华酶制品厂批号20091016金银花药材天津中新药业集团中新制药厂提供2.1标准曲线的绘制根据《中国药典》2005版金银花项下绿原酸含量测定方法，色谱条件为，检测波长327nm；柱温35°C；流动相乙腈-0.4%磷酸溶液(1387)。精密称取绿原酸标准品11.76mg，用50%的甲醇溶液溶解，定容至50mL。精密量取2mL置于IOmL棕色容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，配制成浓度为0.04704mg/mL的溶液，即得(2_8°C下保存)。分别精密吸取标准品溶液2μL，4μL，6μL，8μL，10μL，12μL，14μL，16μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积Y为纵坐标，以进样量X为横坐标进行回归分析，得到回归方程y=146357x+9663，R2=0.9998。表明绿原酸含量在0.0941-0.7526μg范围内线性关系良好。2.2金银花药材中绿原酸含量测定取金银花药材，粉碎，精密称取过四号筛粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定重量，超声处理(功率250w，频率35kHZ)30min,放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇勻滤过，精密量取续滤液5mL，置25mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇勻，即得。精密吸取5-10μL注入液相色谱仪并测定绿原酸含量为2.34%。2.3水提取金银花中绿原酸工艺试验精密称取金银花药材5g，加入10倍量的水，70°C回流提取2小时，滤过；再加入8倍量的水，70°C回流提取2小时，滤过，合并两次水提取液，减压浓缩，再将浓缩液溶于50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至lOOmL，HPLC法测定绿原酸含量为2.34%，计算水提工艺绿原酸提取率为66.13%。2.4复合酶法提取金银花中绿原酸工艺试验2.4.1复合酶法提取工艺条件的单因素考察2.4.1.1酶解温度对绿原酸提取率的影响精密称取过四号筛金银花药材粉末5g，按照200U/g药材，加入纤维素酶，将酶溶于10倍量药材粉末的水溶液中，调节PH5.0的，不同温度条件下酶解lh，酶解温度分别为30、35、40、45、50、551，再加水701浸提两次，111/次，加水量为药材的10倍，合并浸出液于旋转蒸发仪减压浓缩，再将浓缩液溶于50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法测定绿原酸含量为2.34%，计算绿原酸提取率，结果见图Io试验结果显示，酶解温度为40°C时，绿原酸提取率最高。分析试验结果随着酶解温度从30-35°C的增加，酶的活力逐渐增加，绿原酸的提取率也逐渐增加；40°C是纤维素酶的最适温度，酶的活力最大，所以40°C绿原酸提取率最高；但是再增加酶解温度，绿原酸提取率不再增加，反而下降，分析原因是再增加酶解温度，纤维素酶活力逐渐下降所致。2.4.1.2酶解pH对绿原酸提取率的影响精密称取过四号筛金银花药材粉末5g，按照200U/g药材，加入纤维素酶，将酶溶于10倍量药材粉末的水溶液中，40°C条件下，PH分别为4.O、4.5、5.O、5.5、6.O，酶解Ih，再加水70°C浸提两次，以下操作同2.4.1.1项下，结果见图2。试验结果显示，酶解时pH为5.O时，绿原酸提取率最高，这可能是pH5.O时纤维素酶活力达到最大，PH大于和小于5.0，绿原酸提取率都不高，可能与纤维素酶活力不是最大有关。2.4.1.3酶解时间对绿原酸提取率的影响精密称取过四号筛金银花药材粉末5g，按照200U/g药材，加入纤维素酶，将酶溶于10倍量药材粉末的水溶液中，40°C条件下进行酶解，酶解时间分别为0、0.5,1.0,1.5、2.O、2.5、3.Oh，再加水70°C浸提两次，以下操作同2.4.1.1项下，结果见图3。试验结果显示，酶解时间l_2h绿原酸提取率较高。分析试验结果酶解少于1小时，可能酶作用不够充分，对金银花药材中绿原酸的释放效果不明显；酶解时间达到1-2小时，酶对金银花药材粉末的细胞壁中的纤维素进行分解破坏，促进金银花药材中绿原酸的释放，增加绿原酸的传质速率，绿原酸提取率增加；但是酶解时间2.5-3小时，绿原酸提取率不再增加，反而下降，分析原因，可能是2.5-3小时纤维素酶活力下降所致。2.4.1.4酶用量对绿原酸提取率的影响精密称取过四号筛金银花药材粉末5g，按照80U/g药材，200U/g药材，400U/g药材，600U/g药材，800U/g药材，加入纤维素酶，将酶溶于10倍量药材粉末的水溶液中，溶于10倍量药材的pH5.O的水中，40°C条件下酶解lh，再加水70°C浸提两次，以下操作同2.4.1.1项下，结果见图4。试验结果显示，从每g生药材加入80活力单位(U)的酶开始，是随着酶用量的增加，绿原酸提取率也明显增加，酶用量达到每g生药材200-400活力单位(u)时，绿原酸提取率最高，确定酶的最佳酶用量为200-400U/g。当再增加酶用量时，绿原酸提取率也不再增加了，原因可能是已经把金银花生药大部分绿原酸都提取出来了，所以绿原酸含量不再增加。2.4.2正交试验设计优选工艺条件2.4.2.1正交试验设计为了考察酶解温度、酶解pH、纤维素酶与果胶酶复合比以及酶解时间四因素的协同作用，进行L9(34)设计正交实验，以金银花中绿原酸提取率为指标，优化复合酶法提取金银花中绿原酸的工艺条件。由于植物细胞壁之间存在果胶质，果胶酶可以辅助纤维素酶酶解，使绿原酸更易于溶出，所以试验设计时，除了考虑因素酶解温度、PH值、时间，还考虑了纤维素酶和果胶酶的比例。在设计复合酶比例时，固定纤维素酶用量为200U/g，正交实验因素水平安排如表1。表1.L9(34)正交实验因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>直观分析表明，在所选因素水平范围内，影响绿原酸提取效果各因素的主次关系为C>D>B>Α，即酶复合比对绿原酸提取效果影响大，其次是酶解时间，pH值，酶解温度影响最小。分析原因，酶解PH值和温度相对影响小，是由于本试验设计的各水平pH值和温度，距离纤维素酶和果胶酶的最适PH值和最适温度相差不大，所以在这个条件下，pH值和温度因素对绿原酸提取率相对影响较小，酶复合比与酶解时间成为主要影响因素。试验所优化出的复合酶提取金银花中绿原酸的最佳工艺条件是酶解温度45°C，pH值4.5，酶复合比1.00.3，酶解时间1.5小时。2.4.2.3重复验证实验为进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性，取3份药材按上述最佳提取工艺进行验证实验，操作方法同前述，测得实验结果见表4。表4重复酶法的最佳工艺试验结果(N=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>试验结果表明，该工艺重复性好，结果稳定。应用复合酶酶法新工艺提取金银花中绿原酸，绿原酸提取率可达82.27%。3.结论(1)本试验优化出复合酶解法新工艺提取金银花中绿原酸的最佳工艺条件酶解温度45°C，pH值为4.5，纤维素酶与果胶酶复合比为1.00.3，酶解时间1.5小时。(2)纤维素和果胶酶复合酶法新工艺提取金银花中绿原酸提取率可达83.06%，与传统水提法相比，提高了绿原酸的提取率16.93%。金银花为植物性药材，应用纤维素酶和果胶酶可有效地破坏金银花细胞壁，提高绿原酸的提取率。本发明利用复合酶从金银花药材中提取绿原酸的方法与现有的提取工艺相比所具有的积极效果在于(1)本发明的试验结果表明，该工艺重复性好，结果稳定。应用复合酶酶法新工艺提取金银花中绿原酸，绿原酸提取率可达83.06%。、(2)本发明的提取工艺能耗低，酶解温度只需45°C，比传统水提热回流工艺节能50%以上。(3)本发明的提取工艺生产效率高，比传统水提热回流工艺提高效率近一倍。图1为酶解温度对绿原酸提取率的影响；图2为酶解pH对绿原酸提取率的影响；图3酶解时间对绿原酸提取率的影响；图4酶用量对绿原酸得率的影响。具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中的金银花有市售；纤维素酶(40000U)、果胶酶(30000U)购买于天津利华酶制品厂。比较实施例1精密称取金银花药材5g，加入10倍量的水，70°C回流提取2小时，滤过；再加入8倍量的水，70°C回流提取2小时，滤过，合并两次水提取液，减压浓缩，再将浓缩液溶于50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至lOOmL，HPLC法测定绿原酸含量为2.34%，计算水提工艺绿原酸提取率为66.13%。实施例1(1)精密称取过四号筛金银花药材粉末5g，然后将复合酶溶于10倍量药材粉末的水溶液中备用；(2)按照200U/g药材加入复合酶(U为活力单位)，控制酶解温度在40°C，pH值4.5，酶解时间1.5小时，处理金银花；其中纤维素酶与果胶酶复合比为1.00.3。(3)酶解完成后，按药材重量10倍量加入70°C水，浸提2次，每次2h小时，合并浸出液，减压浓缩；(4)将浓缩液溶于50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法测定绿原酸含量为2.34%，计算绿原酸提取率可达83%。实施例2(1)精密称取过四号筛金银花药材粉末5g，然后将复合酶溶于10倍量药材粉末的水溶液中备用；(2)按照400U/g药材加入复合酶(U为活力单位)，控制酶解温度在45°C，pH值5，酶解时间2小时，处理金银花；其中纤维素酶与果胶酶复合比为1.00.28。(3)酶解完成后，按药材重量10倍量加入75°C水，浸提3次，每次3h小时，合并浸出液，减压浓缩；(4)将浓缩液溶于50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法测定绿原酸含量为2.34%，计算绿原酸提取率可达82.6%。实施例3(1)精密称取过四号筛金银花药材粉末5g，然后将复合酶溶于10倍量药材粉末的水溶液中备用；(2)按照400U/g药材加入复合酶(U为活力单位)，控制酶解温度在40°C，pH值4.5，酶解时间2小时，处理金银花；其中纤维素酶与果胶酶复合比为1.03。(3)酶解完成后，按药材重量10倍量加入70°C水，浸提2次，每次3h小时，合并浸出液，减压浓缩；(4)将浓缩液溶于50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法测定绿原酸含量为2.34%，计算绿原酸提取率可达82.6%。在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。权利要求一种采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法，其特征在于按如下的步骤进行(1)按照200-400U/g药材加入复合酶，控制酶解温度在40℃-45℃，pH值4.5-5.0，酶解时间1-2小时，处理金银花；其中所述的复合酶为纤维素酶与果胶酶混合物；(2)酶解完成后，按药材重量10倍量加入70-90℃水，浸提2-3次，每次1-3h小时，合并浸出液，减压浓缩；(3)将浓缩液溶于50％甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取1mL用50％甲醇溶液定容至100mL，以HPLC法测定绿原酸含量，计算绿原酸提取率；其中纤维素酶与果胶酶复合比为1.0∶0.1-0.3。2.权利要求1所述采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法，其中纤维素酶的最适合酶活力为PH值4.5，最适温度为40°C，添加量为200U/g药材；果胶酶的最适合酶活力为pH值5.0，最适温度为45°C，添加量为400U/g药材；纤维素酶与果胶酶复合比为1.00.3。全文摘要本发明涉及一种采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法，本发明研究了纤维素酶与果胶酶复合酶法提取金银花中主要药用有效成分绿原酸的新工艺，通过单因素试验和正交试验，优化出复合酶法提取金银花中绿原酸的最佳工艺条件酶解温度45℃，pH4.5，纤维素酶与果胶酶复合比为1.0∶0.3，酶解时间1.5小时。本发明的试验结果表明，该工艺重复性好，结果稳定。应用复合酶酶法新工艺提取金银花中绿原酸，绿原酸提取率可达83.06％，比传统水提工艺绿原酸提取率提高16.93％。文档编号C07C69/732GK101830804SQ20101012449公开日2010年9月15日申请日期2010年3月16日优先权日2010年3月16日发明者凌宁生,王岩,郑丽娜申请人:天津中新药业集团股份有限公司中新制药厂