专利名称：引物介导环化的恒温核酸滚环扩增方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸序列的恒温扩增方法及试剂盒，更具体地说，涉及引物介导环化的恒温核酸滚环扩增方法，即一种制备单链DNA链的两个引物相关序列末端连接成环并且能至少以该两个引物启动恒温滚环扩增的方法及试剂盒(Primer mediated RollingCircle Amplification, PRCA)。
背景技术：
1985 年美国 Cetus 公司用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术第一次实现了核酸的体外扩增，这对现代分子生物学的发展起到非常重要的作用，可以说PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。但是PCR方法仍然有不足之处如:扩增过程中需要对双链DNA进行变性，需要特制的可快速升降温的PCR仪，非特异性扩增而产生假阳性结果等。因此，近十几年来发展起来了一些新的核酸扩增技术以弥补PCR技术的不足，甚至有取代PCR技术的趋势。因此，基因片段的扩增方法现在丰富多样，成为了现代分子生物学的基本技术。近些年，陆续出现了多种恒温扩增技术，它们能分别在某一个或多个特定的温度条件下(如64°C、42°C等)实现核酸(DNA或RNA)的扩增。国际上已有的恒温扩增技术如下:链置换扩增技术(SDA)依赖核酸序列 的扩增技术(NASBA)转录介导扩增技术(TMA)滚环扩增技术(RCA)连接酶链式反应(LCR)依赖解旋酶的扩增技术(HDA)环介导恒温扩增(LAMP)。其中，NASBA通过一系列转录和反转录的循环过程来以避免高温变性作用，SDA则使用限制性内切酶和修饰过的模板来循环扩增。虽然它们的敏感性都很高，可以扩增低于10个拷贝数量的核酸样本，但是它们还有各自需要克服的缺点。技术要求、材料仪器要求、技术本身特异性缺陷等方面严重束缚了这些技术的推广应用。Walker等于1991年首次提出了 DNA链置换扩增(SDA)方法。该方法通过某种技术手段(如限制性内切酶)在DNA的一条链上产生碱基缺口，DNA聚合酶则从碱基缺口处3’端开始延伸反应，同时将下游的旧链剥离，因链延伸而被封闭了的碱基缺口可以重复产生，使得切割延伸链置换的过程重复进行。1992年，Walker等人简化了 SDA设计，使用4条引物(B1、B2、S1、S2)与加热变性后的靶DNA退火，其中引物SI和S2是真正进行SDA扩增的引物；B1、B2分别位于S1、S2的上游和下游，作用是将S1、S2第一和第二轮延伸后的产物剥离。2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了环介导等温扩增反应LAMP技术，它克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性。但LAMP的核酸靶序列长度一般建议在120-180bp，最好在300bp以内，大于500bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。此外，LAMP技术在核酸扩增产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。滚环扩增技术(RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法，凭借其高特异性、高灵敏度和易操作性的特点在近几年中逐渐引起人们的注意，并越来越多地用于基础研究和实际检测中。人们已经开发了各种利用RCA的扩增方法，相关文献可参考美国专利N0.60/506, 218、5871921A、5648377A、5854033A、6287824B1、6323009B1。滚环扩增是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方式而建立的一种核酸扩增技术。人们的研究集中在如何将核酸片段进行环化，并且如何设计引物引发滚环扩增。现有大部分文献介绍的RCA反应分为锁式探针(Padlock probe)的连接和连接后扩增两部分。锁式探针的5端和3端特异性序列通过同靶序列上的互补区域结合，在连接酶的作用下连接成环。成环后的锁式探针在一个弓I物和合适DNA聚合酶存在的恒温下进行滚环扩增。1998年Lizardi等在线性滚环扩增技术的基础，发明了超分支滚环扩增技术(HRCA/CRCA/RAM)。HRCA是在RCA的基础上增加了一个序列同锁式探针中部分序列相同的引物，不但具有RCA的高序列特异性和简单易操作性，而且在两个引物存在下产物以超分支形式高效扩增，灵敏度极高。美国专利N0.60/506，218中介绍了多种以RNA或DNA模板进行滚环扩增的多种技术，它们利用了核酸接头片段来连接目标核酸序列成环。李岩等发表的文章《一种高效扩增小片段DNA方法的建立》(首都医科大学学报2011年01期)介绍了代替合成小片段DNA的新方法，通过单链DNA连接酶直接将其连接成环，然后加入特异的正反向引物用滚环方法扩增复制，最后通过酶切得到大量同样序列的小片段。现有的RCA和HRCA常需要双链`变性、酶连接与滚环扩增等多步反应，分别需要不同的温度，也需要多次添加反应试剂，需要添加特殊设计的引物启动滚环扩增，不适合基层单位使用。2012年王晓亮发表的硕士学位论文《常温SC-RCA DNA扩增技术研究》(中国海洋大学)介绍了一种改进的滚环扩增技术一自环化滚环扩增技术(Self circularization-RCA,SC-RCA)，该技术利用一种具有特异酶切位点的限制性内切酶将目标DNA酶切，再通过连接酶将酶切片段和经过特异设计的接头连接成环后实现目标DNA的滚环复制。省去了长锁式探针的高成本合成，又能够保证连接成环的特异性。SC-RCA技术避免了 LAMP技术难以辨别非特异性扩增的不足，又较Padlock-RCA成环简便。SC-RCA技术中，具有限制性内切酶位点的靶核苷酸序列经特异性酶切后，通过DNA连接酶将被酶切得到的片段与经过特异设计的核酸接头连接成圆环。该文章虽然可以通过通过酶切方式将靶核酸部分序列代替合成序列与特异设计的接头直接成环，省去了长锁式探针的高成本合成，但要求扩增的靶核酸序列位置有酶切位点，环化时要加入特异设计接头，滚环扩增时要加入特殊设计的引物，文章的实验需要分别进行酶切，连接，滚环扩增，无法在一个溶液体系中一次完成这些操作。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种引物介导环化的恒温核酸滚环扩增方法及试剂盒，即一种制备单链DNA链的两个引物相关序列末端连接成环且能至少以该两个引物直接启动恒温滚环扩增的方法及试剂盒。本发明的方法能在一种溶液体系中一次添加完全部试剂后恒温保持一定时间就能完成核酸扩增，本发明还将UNG酶运用到恒温的滚环扩增方法中，在开始扩增前对样品进行可能的扩增产物污染做彻底消除。另外，本发明的扩增产物还能通过免疫层析试纸对产物进行检测。因此本发明能将基因的扩增和检测变成简单操作，能开启基因诊断技术走向基层单位应用的时代。本发明按照靶核酸3’-5’序列方向依次设有四段引物:F3，FIP，BIP，B3。其中FIP为前端内引物，BIP为后端内引物，F3、B3是一对外引物，分别位于FIP、BIP的上游和下游，在带有链置换功能的DNA聚合酶、必要时可增加的逆转录酶、合适的扩增促进剂作用下，四个引物以靶核酸为模板扩增并剥离出一条单链目标模板。DNA目标模板首尾两端在恒温中被合适的DNA连接酶连接形成闭合的环化目标模板。能与环化目标模板互补的起始引物沿环化目标模板从3’端启动DNA滚环扩增，周而复始地进行环化目标模板的复制，扩增产物是以起始引物为起点的数千倍于目标模版单环长度的串联重复拷贝，每个单环序列中都有与其他引物互补的序列，这些引物杂交并启动反向的DNA链合成，可复制出终止于串联重复拷贝的扩增产物末端即起始引物5’尾端的互补链。该终止于起始引物5’尾端的互补链中包含单个或多个长度的目标模板，起始引物将与每个目标模板中的互补序列杂交而启动新的复制。包含了多个长度目标模板的互补链将在内引物的交替复制与剥离后产生单个长度的目标模板；该新复制的单个长度目标模板将不断由连接酶环化并启动新一轮的滚环扩增。如此周而复始，将扩增复制出巨量的核酸产物(如图2)。本发明内容之一在于当单链目标模板的长度合适时，可直接通过单链DNA连接酶将其两端对接闭合成环；此后用来扩增复制单链目标模板的两个内引物启动了依次交替置换的滚环扩增；而滚环扩增中，将不断复制出新的目标模板，它将不断由连接酶环化并启动新一轮的滚环扩增。本发明内容之二在于设计了两条尾端与靶核酸序列互补的内引物，使得复制出的目标模板两端都形成发夹结构，它们之间没有碱基缺口而相邻着与靶核酸的部分序列杂交；在合适DNA连接酶的作用·下目标模板两端被连接闭合成环；用来扩增复制单链目标模板的两个内引物启动了依次交替置换的滚环扩增。而滚环扩增中将不断复制出新的目标模板，它将不断由连接酶环化并启动新一轮的滚环扩增。本发明内容之三在于设计了至少一条尾端不与靶核酸序列互补的内引物和一条桥式引物。复制剥离的目标模板3’端尾部序列不与靶核酸序列杂交而全部或部分与桥式引物杂交；目标模板的5’端末尾部序列全部或部分与桥式引物杂交；目标模板的两端之间没有碱基缺口而相邻着与桥式引物杂交；在合适DNA连接酶的作用下目标模板两端被连接闭合成环；用来扩增复制单链目标模板的两个内引物启动了依次交替置换的滚环扩增；而滚环扩增中，将不断复制出新的单链目标模板，它将不断由连接酶环化并启动新一轮的滚环扩增。以上说明请参考图1。更具体的说，本发明的一种制备单链DNA链的两个引物相关序列末端连接成环且能至少以该两个引物启动恒温滚环扩增的方法，包括步骤:I)寡核苷酸序列设计寡核苷酸序列至少有四段按靶核酸3’ 一 5’方向设计的引物:F3、FIP、BIP、B3 ；
其中，FIP为前端内引物；BIP为后端内引物；F3、B3是一对外引物，分别位于FIP的上游和BIP的下游； 2 )从靶核酸中扩增出单链DNA目标模板靶核酸为DNA链或在至少含有逆转录酶的反应溶液中将RNA链靶核酸逆转录为DNA链时，在至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的核酸扩增反应溶液中，利用引物F3、FIP、BIP、B3，根据靶核酸序列扩增合成出单链DNA目标模板；3 ) DNA连接酶环化DNA目标模板在至少含有DNA连接酶的反应溶液中，DNA目标模板的首尾两端被连接形成闭合的环化DNA链；4 )环化DNA目标模板滚环扩增
在至少含有DNA连接酶和带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液中，至少以步骤I)中的两个内引物启动环化DNA链的滚环扩增，得到扩增的核酸产物。所述步骤I)的寡核苷酸序列还包括:桥式引物BP、杂交探针、辅助引物；所述桥式引物BP，其全部或部分序列与一个内弓I物尾部序列互补，并且其全部或部分与另一内弓I物互补序列的尾部序列互补，使之像桥一样将这两个内引物的两端序列相邻无碱基缺口地杂交在一起；所述杂交探针，其与靶核酸在两个内引物相关序列位置之中的序列杂交；所述辅助弓I物来源于BIP或FIP引物中不影响其与靶核酸或桥式引物稳定结合的部分序列，或该辅助引物还来源于BIP引物与B3引物之间的序列或该FIP引物与F3引物之间的序列。所述步骤I)的寡核苷酸序列还能分别进行不同或相同的修饰标记，该修饰标记包括:地高辛、荧光染料FAM、异硫氰酸荧光素、生物素、荧光淬灭基团或纳米颗粒。所述步骤I)中，FIP只包含F2序列，F2与靶核酸序列F2c互补；所述BIP只包含B2序列，B2与靶核酸部分序列相同；步骤2)中，利用引物F3、FIP、BIP、B3从靶核酸扩增出单链DNA目标模板后，其两端分别是两个内引物的相关序列F2c、B2，其互补链两端分别是F2、B2c ;其中，B2c是B2的互补序列；步骤3)中，DNA目标模板及其互补链能被DNA连接酶连接形成一个闭合的环化DNA链；步骤4)中，在至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液中，至少以FIP和BIP这两个引物启动环化DNA链的滚环扩增。所述步骤I)中，寡核苷酸序列还设计有辅助引物；所述辅助引物为若干个:该辅助引物来源于BIP引物中不影响B2与靶核酸序列稳定结合的5’端序列或BIP引物与B3引物之间的序列，或该辅助引物还同时来源于FIP引物中不影响F2与靶核酸序列稳定结合的3’端序列或FIP引物与F3引物之间的序列。所述步骤I)中，前端内引物FIP按5’ 一 3’序列方向至少包含2段序列Flc、F2，其中，F2与F2c互补，F2c是靶核酸序列F3c在靶核酸5’方向的部分序列；FIP引物中的Flc是Fl的互补序列，Flc与处在靶核酸序列F2c的5’方向的部分序列相同，F3c是F3的互补序列；所述后端内引物BIP按3’ 一5’序列方向至少包含2段序列B2、Blc，其中，BIP引物中的B2与靶核酸部分序列相同，Blc是与处在靶核酸B2序列的3’方向的部分序列BI互补；所述Flc与BI在靶核酸序列上是相邻无碱基间隔的前后两段序列；步骤2)中，利用引物F3、FIP、BIP、B3从靶核酸扩增出单链DNA目标模板后，DNA目标模板及其互补链两端分别形成发夹结构；其中，Fl、Blc之间或Flc、Bl之间形成了没有碱基缺口的杂交缝隙；步骤3)中，DNA目标模板及其互补链两端之间的间隙能被DNA连接酶连接闭合，形成环化DNA链；步骤4)中，在至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液中，至少以FIP和BIP两个内引物启动环化DNA链的滚环扩增。所述步骤I)中，寡核苷酸序列还设计有辅助引物；所述辅助引物为若干个；该辅助引物来源于BIP引物中不影响B2及Blc与靶核酸序列稳定结合的中间序列或BIP引物与B3引物之间的序列，或该辅助引物还同时来源于FIP引物中不影响F2及Flc与靶核酸序列稳定结合的中间序列或FIP引物与F3引物之间的序列。所述步骤I)中，前端内引物FIP按5’ 一 3’序列方向至少包含2段序列F4、F2，其中，F2与靶核酸序列F2c互补杂交；F4序列是与单链DNA目标模板不相同且不互补的DNA序列；所述后端内引物BIP按3’ 一5’序列方向至少包含2段序列B2、B4，其中，B2与靶核酸部分序列相同；B4序列是与单链DNA目标模板不相同且不互补的DNA序列；步骤I)中，还设有桥式引物BP，它按5’ 一 3’序列方向分别与FIP中F4的互补序列F4c和BIP中B4的两个序列全部或部分碱基杂交互补，或者按5’ 一 3’序列方向分别与BIP中B4的互补序列B4c和FIP中F4的两个序列全部或部分碱基杂交互补；FIP和BIP中最多有一条内引物中有部分序列不 与桥式引物互补，而与靶核酸部分序列相同或互补，其位置在内引物F2或B2与靶核酸相同或互补位置的3’端方向；步骤2)中，利用引物F3、FIP、BIP、B3从靶核酸扩增出单链DNA目标模板后，DNA目标模板或其互补链的两端以桥式引物为互补链形成了没有碱基缺口的杂交缝隙；步骤3)中，DNA目标模板或其互补链的两端能被DNA连接酶连接为环化DNA链；步骤4)中，在至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液中，至少以FIP和BIP两个内引物启动环化DNA链的滚环扩增。所述桥式引物BP，能通过另外设计的四个引物序列从靶核酸序列中与单链DNA目标模板序列完全无关的序列中扩增剥离出来；其中，所述四个引物序列，为:重新设计的不同于F3、FIP、BIP、B3的内引物和外引物的各2条序列。所述步骤I)中寡核苷酸序列还设计有辅助引物；所述辅助引物来源于BIP引物中不影响B2与靶核酸序列稳定结合、B4与桥式引物稳定结合的中间序列或BIP引物与B3引物之间的序列，或该辅助引物还同时来源于FIP引物中不影响F2与靶核酸序列稳定结合、F4c与桥式引物稳定结合的中间序列或FIP弓丨物与F3引物之间的序列。所述步骤2)中，逆转录酶包括:AMV或M-MLV ;带有链置换功能的DNA聚合酶包括:Bst DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶；步骤2)中，至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的核酸扩增反应溶液，其组分还至少包括:扩增促进剂和核酸染料；其中，扩增促进剂包括以下的一个或多个成分的组合:甜菜碱，海藻糖、脯氨酸，二甲基亚砜、三甲胺-N-氧化物、氯化四甲基铵、甲酸胺、BSA、单链结合蛋白、T4Gene32Protein、homoectoine、Zn2+_cyclen(cyclen为 1，4, 7, 10-tetraazacyclododecane);所述核酸染料包括:SYBR Green 1、|丐黄绿素、GELGREEN 和 GELRED。所述步骤2)中，在根据靶核酸扩增出单链DNA目标模板前，还能进行样品的靶核酸扩增产物污染消除处理:样品完成核酸提取后，加入尿嘧啶-N-糖基化酶，将可能对样品造成了污染的靶核酸扩增产物中的尿嘧啶进行糖苷键水解，此后，将溶液温度升高到55-98°C并保持最多10分钟，溶液中的尿嘧啶-N-糖基化酶将被灭活。所述污染消除处理、扩增单链目标模板、DNA连接酶环化目标模板、环化目标模板滚环扩增四个步骤中，各步骤能设置不同的温度条件，或将其中的若干步骤设置同一个温度；这四个步骤中的相关试剂成分能分别多次添加或一次添加完成。所述步骤3)、4)中，所述 DNA 连接酶包括:T4DNA ligase、Taq DNA Ligase、Ampligase 和 ssDNAligase。所述步骤4)中，带有链置换功能的DNA聚合酶包括:Bst DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶；所述含有DNA连接酶和带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液，其组分还至少包括:扩增促进剂或核酸染料；其中，扩增促进剂包括以下的一个或多个成分的组合:甜菜碱，海藻糖、脯氨酸，二甲基亚砜、三甲胺-N-氧化物、氯化四甲基铵、甲酰胺、BSA、单链结合蛋白、T4Gene32Protein、homoectoine、Zn2+_cyclen ;所述核酸染料包括:SYBR Green 1、隹丐黄绿素、GELGREEN 和 GELRED。所述步骤2)的扩增的单链DNA目标模板、步骤3)的环化DNA链和步骤4)中的核酸产物，能通过免疫层析试纸或荧光信号进行检测。如步骤2)的扩增的单链DNA目标模板、步骤3)的环化DNA链和步骤4)中的核酸产物可带有或结合了修饰标记分子的寡核苷酸序列；其中，该修饰标记分子能够被相应的配体识别，并能通过免疫层析试纸对产物进行检测；步骤2)的扩增的单链DNA目标模板、步骤3)的环化DNA链和步骤4)中的核酸产物还能够导致荧光信号的上升或下降，并能通过荧光信号对产物进行检测。另外，根据上述方法，本发明还公开了一种应用于所述方法的试剂盒，至少包括上述的寡核苷酸序列。所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种:( I)上述的带有链置换功能DNA聚合酶；(2)上述的DNA连接 酶；(3)上述的扩增促进剂；(4)上述的核酸染料；( 5)尿嘧啶-N-糖基化酶；(6)上述的逆转录酶。本发明，通过内外各2条引物从靶核酸恒温扩增并剥离出的DNA单链目标模板两端可被合适的DNA连接酶在合适条件下连接形成一个闭合的环化目标模板。带有链置换功能的DNA聚合酶在恒温条件下，以闭合环状DNA为模板启动滚环扩增。滚环扩增产物中不断出现新的DNA单链目标模板，它将不断由DNA连接酶环化并启动新一轮滚环扩增。本发明能在一种溶液体系中一次添加完全部试剂后恒温保持一定时间后完成扩增。与现有技术相比，本发明的有益效果在于:I)相比现有的锁式探针滚环扩增技术，本发明不用再合成高成本的长锁式探针，靶核酸的序列的长度能允许更大；2)相比现有的酶切式滚环扩增技术，本发明通过引物的设计，能对靶核酸任意序列进行滚环扩增；3)相比现有的滚环扩增技术及其他的恒温扩增技术(LAMP除外)都需要分步在不同溶液体系中不同温度操作，本发明能在一种溶液体系中一次添加完全部试剂后恒温保持一定时间就能完成扩增，这为扩增产物的封闭扩增，并对防止样品被扩增产物污染提供了解决方法；
4)相比目前能在一种溶液体系中一次添加全部试剂并恒温扩增的LAMP技术，本发明能提供数量更少更简单的引物设计，有的方法中只要与靶核酸相关的四个引物，有的方法中需要5个与靶核酸相关的引物。鉴于RNA病毒很容易基因变异，即使在保守序列上也存在点突变，数量少的引物就能更便于进行种属范围的特异性设计；5)相比现有的恒温扩增技术，本发明将UNG酶运用到恒温的滚环扩增方法中，在开始扩增前将样品可能的扩增产物污染进行彻底消除。这就从技术上解决了基层单位无法做到检测分区操作而无法使用现有核酸试剂的问题，真正开启了基因检测步入基层单位应用的新时代。
图1是本发明的恒温滚环扩增示意图；图1中，按照靶核酸3’ -5’序列方向依次设有四段引物:F3，FIP, BIP, B3。其中FIP为前端内引物，BIP为后端内引物，F3、B3是一对外引物，分别位于FIP、BIP的上游和下游，在带有链置换功能的DNA聚合酶、 必要时可增加的逆转录酶、合适的扩增促进剂作用下，四个引物以靶核酸为模板扩增并剥离出一条单链目标模板。根据两条内引物设计的不同，分别衍生出三种扩增方式:第一种方式是自接引物滚环扩增(SP-RCA):FIP前端内引物FIP只包含F2序列；后端内引物BIP内只有B2序列；单链DNA目标模板被复制合成后，其两端分别是F2c、B2，可被DNA连接酶连接形成一个闭合的环化DNA链；所述环化DNA链将在FIP引物的启动下进行滚环扩增。第二种方式是发夹引物滚环扩增(HP-RCA):前端内引物FIP按5’ 一 3’序列方向包含Flc、F2 ;后端内引物BIP按3’ 一5’序列方向包含B2、Blc。同时Flc与BI在靶核酸序列上是相邻无碱基间隔的前后两段序列；目标模板被复制合成后，其两端分别是两个内引物的相关序列Fl、Blc，而Fl与Flc互补，BI与Blc互补，目标模板两端分别形成发夹结构，其中Fl、Blc之间形成了没有碱基缺口的缝隙；目标模板两端之间的间隙被DNA连接酶连接闭合，及其互补链变成了环化DNA链。与环化DNA链互补的FIP内引物启动了滚环扩增第三种方式是桥式发夹引物滚环扩增(BH-RCA):前端内引物FIP按5’一 3’序列方向包含F4、F2。后端内引物BIP按3’ 一 5’序列方向包含B2、B4。桥式引物BP按5’一 3’序列方向分别与F4的互补序列F4c和B4两个序列全部杂交互补。目标模板被复制合成后，其两端分别是F4c、B4 ;桥式引物的5’端部分序列与B4全部杂交，它3’端部分序列与F4c全部杂交；目标模板的两端F4c与B4都以桥式引物为互补链形成了没有碱基缺口的杂交缝隙，被合适的DNA连接酶连接为环化目标模板；FIP内引物的中部序列不与桥式引物互补，而与靶核酸部分序列相同。复制的目标模板中FIP内引物的这个中部序列的互补序列能与靶核酸杂交，因此环化后的目标模板呈哑铃状结构。与环化目标模板互补的内引物与BP同时作为起始引物启动滚环扩增。图2是本发明的扩增方法示意图。图2中，对自接引物滚环扩增(SP-RCA)的一个图示说明:按照靶核酸3’ _5’序列方向依次设有四段引物:F3，FIP，BIP，B3。其中FIP为前端内引物，BIP为后端内引物，F3、B3是一对外引物，分别位于FIP、BIP的上游和下游，在带有链置换功能的DNA聚合酶、必要时可增加的逆转录酶、合适的扩增促进剂作用下，四个引物以靶核酸为模板扩增并剥离出一条单链目标模板。DNA目标模板首尾两端在恒温中被合适的DNA连接酶连接形成闭合的环化目标模板。能与环化目标模板互补的起始引物FIP沿环化目标模板从3’端启动DNA滚环扩增，周而复始地进行环化目标模板的复制，扩增产物是以起始引物为起点的数千倍于目标模版单环长度的串联重复拷贝，每个单环序列中都有与BIP引物互补的序列，BIP引物杂交并启动反向的DNA链合成，可复制出终止于串联重复拷贝的扩增产物末端即FIP引物5’尾端的互补链。该终止于FIP引物5’尾端的互补链中包含单个或多个长度的目标模板，FIP引物将与每个目标模板中的互补序列杂交而启动新的复制。包含了多个长度目标模板的互补链将在FIP和BIP内引物的交替复制与剥离后产生单个长度的目标模板；该新复制的单个长度目标模板将不断由连接酶环化并启动新一轮的滚环扩增。如此周而复始，将扩增复制出巨量的核酸产物
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例中涉及的化学试剂如未特别说明，则是采用市售的商业化产品。实施例1:桥式发夹引物BHP-RCA检测双链DNA该实施例采用单增李斯特(Listeria monocytogenes)菌细菌培养物作为样本。菌种购自ATCC (ATCC19116)，取I μ L原种菌液到3mlTSBYE培养基中，于35°C振荡培养24小时，取200 μ L细菌 悬浮液，5000rpm离心2分钟，收集菌体用做后续DNA抽提。根据NCBI公布的序列信息，以单增李斯特菌较保守的溶血素编码基因hlyA为靶序列，部分序列如下(GenBank N0.AB566375):CAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGT GGCATATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAA TCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTGACAAATATCAT (如 SEQID N0.1 所示)1、据上述序列，设计所需的五种引物，并经由引物合成公司完成，引物序列如下:外引物F3:CGGCAAAGCTGTTACTA (如 SEQ ID N0.2 所示)外引物B3:GTCAGTTCTACATCACC (如 SEQ ID N0.3 所示)内引物 FIP:TGAATCCGTTAGTTTTTATATGCAGGAGGGCAGTTGCAAGCGCTTGG (如 SEQ IDN0.4所示)内引物 BIP:AATAAGGAGGCGGCTGCTGG GACAGATTTCCCACTTACG (如 SEQ ID N0.5 所示)桥式引物BP:CTAACGGATTCAAATAAGGAGG (如 SEQ ID N0.6 所示)2、样品处理:采用商品化的细菌核酸提取试剂盒进行DNA抽提，得到单增李斯特菌的DNA模板，浓度为320ng/y L。3、恒温扩增反应及检测:
体系配制如下:10XBST Buffer (NEB 公司)IyLIOXTaqe ligase Buffer (Thermo 公司)IpLdNTP (25mM, Takara 公司)IpL外引物F3 (100 μ Μ)0.1 μ L外引物Β3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L内引物FIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L内引物BIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L桥式引物BP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ LDNA 模板I μ LBst 酶(ΝΕΒ 公司，稀释成 8υ/μ I)IyLTaqe ligase (Thermo 公司，40U/μ L)0.5 μ LddH2013.7μ L`将上述反应体系配制好后，混合均匀，3000rpm离心30秒，64°C恒温扩增I小时。扩增产物经2% (2g/100mL)的琼脂糖凝胶电泳,呈现明亮的Marker状的梯形条带。结果表明，用本发明所述方法，经过I小时恒温扩增反应可很好地检测出目标模板。另外，根据上述的恒温扩增反应体系的组分，也可制备成相应的检测试剂盒，以便广泛使用，即该检测试剂盒(不含有DNA模板)，其组分含有:外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、桥式引物BP ;另外，该检测试剂盒的组分还可含有10XBST Buffer、IOXTaqe ligase Buffer、dNTP、Bst 酶、Taqe ligase 和 ddH20。4、扩增反应时间对结果的影响:步骤3所述反应体系中，在其它条件不变的情况下，仅改变恒温扩增反应时间，分别在20min、30min、50min进行64O扩增反应,试验结果表明，用本发明所述方法，经过30分钟恒温扩增反应，即可很好地检测出目标模板。5、扩增反应温度对结果的影响:步骤3所述反应体系中，在其它条件不变的情况下，仅改变反应温度，在45°C、48 V、50°C、52 V、55°C、58 V、60 V、62 V、65°C、70 V温度条件下，恒温扩增I小时，试验结果表明:本发明最适反应温度为:62-64°C。实施例2:桥式发夹引物BHP-RCA检测单链DNA本实施案例采用猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)灭活疫苗作为样本。疫苗购自哈尔滨维科生物技术开发公司，该疫苗灭活前含毒量不低于105.5TCID50。PCV是单链闭合环状DNA病毒，基因组全长约1.76kb。PCV2具有较高的致病性，是仔猪断奶后多系统衰竭综合症的主要病原。根据NCBI公布的序列信息，以PCV2较保守复制相关基因Rep为革巴序列，部分序列如下(GenBank N0.AF207700):CTAGATCTCAAGGACAACGGAGTGACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGGCCGTTGCAGAGCAGC ACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACGAATGT ACACGTCATTGTGGGGCCACCTGGGTGTG(如 SEQ ID N0.7所示)1、据上述序列，设计所需的五种引物，并经由引物合成公司完成，引物序列如下:
外引物F3:AGATCTCAAGGACAACG (如 SEQ ID N0.8 所示)外引物B3:GTCATTGTGGGGCCACCT (如 SEQ ID N0.9 所示)内引物 FIP: TGAATCCGTTAGTTTTTCTCCCGCTCTCCGACCTGTCTACTGCTGTGAG (如 SEQID N0.10 所示)内引物BIP:AATAAGGAGGCGGCTGCTGG- CATTCGTCTTCCAATCACG (如 SEQ ID N0.11 所示)桥式引物BP:CTAACGGATTCAAATAAGGAGG (如 SEQ ID N0.12 所示)2、样品处理:采用商品化的病毒核酸提取试剂盒进行核酸抽提，得到PCV2的DNA模板，浓度为130ng/μ L。3、恒温扩增反应及检测:体系配制如下:10XBST Buffer (NEB 公司)IyLIOXTaqe ligase Buffer (Thermo 公司) IuLdNTP (25mM, Tak·ara 公司)IpL外引物F3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L外引物Β3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L内引物FIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L内引物BIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L桥式引物BP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ LDNA 模板I μ LBst 酶(ΝΕΒ 公司，稀释成 8U/μ I)IyLTaq ligase (Thermo 公司，40U/μ L)0.5 μ LddH2013.7μ L将上述反应体系配制好后混合均匀，3000rpm离心30秒，64°C恒温扩增I小时。扩增产物经2%(2g/100ml)的琼脂糖凝胶电泳，呈现明亮的Marker状的梯形条带。结果表明，用本发明所述方法，经过I小时恒温扩增反应可很好地检测出猪伪狂犬病毒DNA。实施例3:桥式发夹引物BHP-RCA检测RNA本实施例采用人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)为检测对象。病毒RNA样本由厦门万泰沧海生物科技有限公司徐飞海博士惠赠。HIV为单链RNA逆转录病毒，绝大多数艾滋病由HIV-1型引起。根据NCBI公布的序列信息，以HIV-1比较保守的结构蛋白gag基因为祀序列，部分序列如下(GenBank N0.:AF128998):TCGACGGAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAATTTTTTACTAGCGGAGGC TAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAAAATTAGATAAATGGGAGAAAATTCGGTTAAGGCCAGGAGGAAAG AAAACATATCAGTTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAA (如 SEQ ID N0.13 所示)1、据上面的序列，设计了所需的五种引物，引物序列如下:外引物F3:CGACGGAGGACTCGGCTTG (如 SEQ ID N0.14 所示)
外引物B3:GCTTGCCCATACTATATG (如 SEQ ID N0.15 所示)内引物 FIP:TGAATCCGTTAGTITTTCGTACTCACCAGAAGCGCGCACGGCAAG (如 SEQ IDN0.16所示)内引物BIP:AATAAGGAGGCGGCTGCTGGCTGATATGTTTTCTTTCCTCC (如 SEQ ID N0.17所示)桥式引物BP:CTAACGGATTCAAATAAGGAGG (如 SEQ ID N0.18 所示)2、样品处理:采用商品化的病毒核酸提取试剂盒进行核酸抽提得到HIV的RNA模板，浓度为210ng/μ L。3、恒温扩增反应及检测:体系配制如下:10XBST Buffer (NEB 公司)IyLIOXTaqe ligase Buffer (Thermo 公司)IuLdNTP (25mM, Takara 公司)IyL外引物F3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L外引物Β3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L内引物FIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L内引物BIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L桥式引物BP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ LRNA 模板I μ LBst 酶(ΝΕΒ，稀释成 8υ/μ I)I μ LAMV 酶(30υ/μ L，Takara)I μ LTaq ligase (40U/μ L, Thermo)0.5 μ LddH2012.7μ L将上述反应 体系配制好后混合均匀，3000rpm离心30秒，64°C恒温扩增I小时。扩增产物经2%(2g/100ml)的琼脂糖凝胶电泳，呈现明亮的Marker状的梯形条带。结果表明，用本发明所述方法，经过I小时恒温扩增反应可很好地检测出HIV-1。实施例4:桥式发夹引物BHP-RCA结合UNG酶防污染系统检测犬埃利希本发明方法灵敏度高，非常容易造成气溶胶污染而造成假阳性结果。本发明方法可结合UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)防污染系统，避免假阳性结果的发生。埃利希是专性细胞内寄生物，造成犬免疫力低下、极度消瘦，犬埃利希病也被称为犬的艾滋病。犬埃利希基因组大小约为lOOOkbp，根据NCBI公布的序列信息，以犬埃利希较保守16S rDNA基因为靶序列进行检测，部分序列如下(GenBank N0.:AF162860)GAGGGGGAAAGATTTATCGCTATTAGATGAGCCTACGTTAGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTTACCAAGGCTATGATCTATAGCTG GTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAA GCCTGATCCAGCTATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAACTC (如 SEQ ID N0.19 所示)1、据上面的序列，设计了所需的五种引物，引物序列如下:外引物F3:GAAAGATTTATCGCTAT (如 SEQ ID N0.20 所示)
外引物B3:CGAAGGCCTTCTTCACT (如 SEQ ID N0.21 所示)内引物 FIP:TGAATCCGTTAGTTTTTGCCTTGGTAAGCATGAGCCTACGTTAGAT (如 SEQ IDN0.22所示)内引物 BIP:AATAAGGAGGGCATAGCTGGATCAGGCT (如 SEQ ID N0.23 所示)桥式引物BP:CTAACGGATTCAAATAAGGAGG (如 SEQ ID N0.24 所示)2、样品处理:临床确诊为犬艾利希病的病犬，取全血样本，采用商品化的全血基因组提取试剂盒进行核酸抽提，得到DNA模板，浓度为600ng/ μ L。3、UNG酶处理、恒温扩增反应及检测:体系配制如下: 10XBST Buffer (NEB 公司)IyLIOXTaqe ligase Buffer (NEB 公司)IuLdUNTP (25mM，Takara 公司)IyL外引物F3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L外引物Β3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L内引物FIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L内引物BIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L桥式引物BP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ LDNA 模板I μ LBst 酶(ΝΕΒ，稀释成 8υ/μ I)I μ LTaq ligase (40U/ μ L, Thermo)0.5 μ LddH2012.7μ L将上述反应体系配制好后混合均匀，3000rpm离心30秒，64°C恒温扩增I小时。扩增产物经2% (2g/100ml)的琼脂糖凝胶电泳，呈现明亮的Marker状的梯形条带。取上述扩增反应液0.1 μ L作为模板，结合UNG酶体系，验证其去污染效果。反应体系和方法如下:反应体系:10XBST Buffer (NEB 公司)IyLIOXTaqe ligase Buffer (Thermo 公司)IuLdUNTP (25mM，Takara 公司)IyL外引物F3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L外引物Β3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L内引物FIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L内引物BIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L桥式引物BP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ LUNG 酶(2U/yL)0.5 μ L上述扩增反应液0.1yLddH2014.1 μ L上述反应体系在25°C温育10分钟，95°C作用2分钟使UNG酶失活。在反应体系中补入 IyL Bst 酶(NEB，稀释成 8υ/μ 1)，0.5μ L Taq ligase (Thermo，40U/μ L)混合均匀，3000rpm离心30秒，64°C恒温扩增I小时。同时做一管不经UNG酶处理的对照。反应产物经2% (2g/100ml)的琼脂糖凝胶电泳，结果表明:未经UNG酶处理的反应体系，最终扩增产物呈现明亮的Marker状的梯形条带，经过UNG酶处理的反应体系，扩增产物不产生任何条带，有效地避免了假阳性结果的产生。用本发明所述方法结合UNG酶防污染体系能有效避免假阳性结果的产生。实施例5:自连引物SP-RCA检测双链DNA本发明方法可以不需要桥式引物，在单链DNA聚合酶的作用下使第一轮扩增产物直接成环，而得到RCA扩增的模板序列。以检测单增李斯特(Listeria monocytogenes)菌为例说明如下:采用单增李斯特菌细菌培养物作为样本。菌种购自ATCC(ATCC19116)，取I μ L原种菌液到3mlTSBYE培养基中，于35°C振荡培养24小时，取200 μ L细菌悬浮液，5000rpm离心2分钟，收集菌体用做后续DNA抽提。根据NCBI公布的序列信息，以单增李斯特菌较保守的溶血素编码基因hlyA为靶序列，部分序列如下(GenBank N0.AB566375):CAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCA TATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTG TCTCAGGTGATGTAGAACTGACAAATATCAT (如 SEQID N0.1 所示)1、据上述序列，设计所需的四种引物，并经由引物合成公司完成，引物序列如下:外引物F3:CGGCAAAGCTGTTACTA (如 SEQ ID N0.2 所示)外引物B3:GTCAGTTCTACATCACC (如 SEQ ID N0.3 所示)内引物 FIP:GCAGTTGCAAGCGCTTGG (如 SEQ ID N0.25 所示)内引物 BIP:GACAGATTTCCCACTTACG (如 SEQ ID N0.26 所示)2、样品处理:采用商品化的细菌核酸提取试剂盒进行DNA抽提，得到单增李斯特菌的DNA模板，浓度为320ng/y L。3、恒温扩增反应及检测:20 μ L体系配制如下:10XBST Buffer (NEB 公司)IyL10 X ssDNA Ligase Buffer (Epicentre 公司)IuLdNTP (25mM, Takara 公司)IpLATP (ImM, Epicentre 公司)IpLMnCl2(50mM)I μ L外引物F3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L外引物Β3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L内引物FIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L
内引物BIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ LDNA 模板I μ LBst 酶(ΝΕΒ 公司，稀释成 8U/μ I)IyL
ssDNA Ligase (IOOU/μ L, Epicentre 公司)IuLddH2011.4μ L将上述反应体系配好后混合均匀，3000rpm离心30秒，64°C恒温扩增I小时。扩增产物经2% (2g/100ml)的琼脂糖凝胶电泳，呈现明亮的Marker状的梯形条带。结果表明，自连引物HP-RCA扩增方法，结合单链DNA连接酶，在没有桥式引物的情况下，经过I小时恒温扩增反应可很好地检测出目标模板。实施例6:发夹引物HP-RCA检测双链DNA本发明方法可以不需要桥式引物，利用特殊设计的FIP和BIP，在扩增之后形成发夹结构，扩增产物的两端直接紧密相连，在连接酶的作用下形成一个闭合环状结构，以此为模板进行后续RCA扩增。据此方法，以检测单增李斯特(Listeria monocytogenes)菌为例说明如下:采用单增李斯特菌细菌培养物作为样本。菌种购自ATCC (ATCC 19116)，取IyL原种菌液到3mlTSBYE培养基中，于35°C振荡培养24小时，取200 μ L细菌悬浮液，5000rpm离心2分钟，收集菌体用做后续DNA抽提。根据NCBI公布的序列信息，以单增李斯特菌较保守的溶血素编码基因hlyA为靶序列，部分序列如下(GenBank N0.AB566375):CAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCA TATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTG TCTCAGGTGATGTAG (如 SEQ ID N0.27 所示)1、据上述序列，设计所需的四种引物，并经由引物合成公司完成，引物序列如下:外引物F3:CGGCAAAGCTGTTACTA (如 SEQ ID N0.2 所示)
外引物B3:CTTTTACTTTAGTACTATGG (如 SEQ ID N0.28 所示)内引物 FIP:ATATGCAGGAGG GCAGTTGCAAGCGCTTGG (如 SEQ ID N0.29 所示)内引物 BIP:ATCTCAAGTGTGGTTGATAATTTCAAATAAACTTG (如 SEQ ID N0.30 所示)2、样品处理:采用商品化的细菌核酸提取试剂盒进行DNA抽提，得到单增李斯特菌的DNA模板，浓度为320ng/y L。3、恒温扩增反应及检测:20 μ L体系配制如下:10 X BST Buffer (NEB 公司)IyL10XTaq DNA Ligase Buffer (Thermo 公司)IuLdNTP (25mM, Takara 公司)IyL外引物F3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L外引物Β3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L内引物FIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L内引物BIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ LDNA 模板I μ LBst 酶(ΝΕΒ 公司，稀释成 8U/μ I)IyLTaq DNA ligase (Thermo 公司，40U/μ L)0.5 μ LddH2013.9μ L
将上述反应体系配好后混合均匀，3000rpm离心30秒，64°C恒温扩增I小时。扩增产物经2% (2g/100ml)的琼脂糖凝胶电泳，呈现明亮的Marker状的梯形条带。结果表明，利用HP-RCA扩增方法，经过I小时恒温扩增反应，可很好地检测出目标核酸模板。实施例7:桥式发夹引物BHP-RCA结合分子信标实时检测目标模板本发明方法可以通过分子信标，实现对扩增产物的实时监测。本实施例以人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)为例说明。HIV为单链RNA逆转录病毒，绝大多数艾滋病由HIV-1型引起。根据NCBI公布的序列信息，以HIV-1比较保守的结构蛋白gag基因为祀序列，部分序列如下(GenBank N0.:AF128998):TCGACGGAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAATTTTTTACTAGCGGAGGC TAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAAAATTAGATAAATGGGAGAAAATTCGGTTAAGGCCAGGAGGAAAG AAAACATATCAGTTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAA (如 SEQ ID N0.13 所示)1、据上面的序列，设计了所需的四种引物及一条检测用探针，引物序列如下:外引物F3:CGACGGAGGACTCGGCTTG (如 SEQ ID N0.14 所示)外引物B3:GCTTGCCCATACTATATG (如 SEQ ID N0.15 所示)内引物 FIP:TGAATCCGTTAGTITTTCGTACTCACCAGAAGCGCGCACGGCAAG (如 SEQ IDN0.16所示)内引物BIP:AATAAGGAGGCGGCTGCTGGCTGATATGTTTTCTTTCCTCC (如 SEQ ID N0.17所示)桥式引物BP:CTAACGGATTCAAATAAGGAGG (如 SEQ ID N0.18 所示)分子信标(检测用探针):FAM-cacctcGATGGGTGCGAGAGCGTCAGgaggtg-DABCYL(如SEQID N0.31所示)；其中，FAM、DABCYL中文名称分别是羧基荧光素、4- (4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸，它们分别是荧光基团和荧光淬灭基团，是分子信标最常用的一对组合。2、样品处理:HIV病毒 RNA样本由厦门万泰沧海生物科技有限公司徐飞海博士惠赠。采用商品化的病毒核酸提取试剂盒进行核酸抽提得到HIV的RNA模板，浓度为210ng/y L。3、恒温扩增反应及检测:20 μ L体系配制如下:10 X BST Buffer (NEB 公司)IyLIOXTaqe ligase Buffer (NEB 公司)IyLdNTP (25mM，Takara 公司)IyL外引物F3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L外引物Β3 (ΙΟΟμΜ)0.1 μ L内引物FIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L内引物BIP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L桥式引物BP (ΙΟΟμΜ)0.2 μ L上述的分子信标(10 μ Μ)0.2μ LROX Dye (150 μ Μ)0.2 μ LDNA 模板I μ L
Bst 酶(NEB，稀释成 8U/μ I)I μ LAMV 酶(30U/μ L，Takara 公司)IyLTaq ligase (40U/μ L, Thermo 公司)0.5 μ LddH2012.3μ L将上述反应体系配制好后，混合均匀，3000rpm离心30秒，64°C恒温扩增I小时，用ABI7500荧光定量PCR进行荧光收集，每30秒收集一次荧光信号。荧光曲线显示，在25分钟左右进入指数扩增期。结果表明，用本发明所述方法可以通过分子信标，实现对扩增产物的实时监测。
另外，根据实施例2-7的恒温扩增反应体系的组分，按照实施例1中的制备检测试剂盒方法，也可将实施例2-7的恒温扩增反应体系的组分(除去DNA模板外的组分)制备成相应的应用于制备单链DNA链的两个引物相关序列末端连接成环且能至少以该两个引物启动恒温滚环扩增的方法的检测试剂盒，并按照各实施例中的反应条件和检测方法进行检测。
权利要求
1.一种制备单链DNA链的两个引物相关序列末端连接成环且能至少以该两个引物启动恒温滚环扩增的方法，其特征在于，包括步骤 1)寡核苷酸序列设计 寡核苷酸序列至少有四段按靶核酸3’ 一 5’方向设计的引物F3、FIP、BIP、B3 ； 其中，FIP为前端内引物； BIP为后端内引物； F3、B3是一对外引物，分别位于FIP的上游和BIP的下游； 2)从靶核酸中扩增出单链DNA目标模板 靶核酸为DNA链或在至少含有逆转录酶的反应溶液中将RNA链靶核酸逆转录为DNA链时，在至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的核酸扩增反应溶液中，利用引物F3、FIP、BIP、B3，根据靶核酸序列扩增合成出单链DNA目标模板； 3)DNA连接酶环化DNA目标模板 在至少含有DNA连接酶的反应溶液中，DNA目标模板的首尾两端被连接形成闭合的环化DNA链； 4)环化DNA目标模板滚环扩增 在至少含有DNA连接酶和带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液中，至少以步骤I)中的两个内引物启动环化DNA链的滚环扩增，得到扩增的核酸产物。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤I)的寡核苷酸序列还包括桥式引物BP、杂交探针、辅助引物； 所述桥式引物BP，其全部或部分序列与一个内弓I物尾部序列互补，并且其全部或部分与另一内引物互补序列的尾部序列互补，使之像桥一样将这两个内引物的两端序列相邻无碱基缺口地杂交在一起； 所述杂交探针，其与靶核酸在两个内引物相关序列位置之中的序列杂交； 所述辅助引物来源于BIP或FIP引物中不影响其与靶核酸或桥式引物稳定结合的部分序列，或该辅助引物还来源于BIP引物与B3引物之间的序列或该FIP引物与F3引物之间的序列。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤I)的寡核苷酸序列还能分别进行不同或相同的修饰标记，该修饰标记包括地高辛、突光染料FAM、异硫氰酸突光素、生物素、荧光淬灭基团或纳米颗粒。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，FIP只包含F2序列，F2与靶核酸序列F2c互补；所述BIP只包含B2序列，B2与靶核酸部分序列相同； 步骤2)中，利用引物F3、FIP、BIP、B3从靶核酸扩增出单链DNA目标模板后，其两端分别是两个内引物的相关序列F2c、B2，其互补链两端分别是F2、B2c ;其中，B2c是B2的互补序列； 步骤3)中，DNA目标模板及其互补链能被DNA连接酶连接形成一个闭合的环化DNA链； 步骤4)中，在至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液中，至少以FIP和BIP这两个弓I物启动环化DNA链的滚环扩增。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，寡核苷酸序列还设计有辅助引物；所述辅助引物为若干个该辅助引物来源于BIP引物中不影响B2与靶核酸序列稳定结合的5’端序列或BIP引物与B3引物之间的序列，或该辅助引物还同时来源于FIP引物中不影响F2与靶核酸序列稳定结合的3’端序列或FIP引物与F3引物之间的序列。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，前端内引物FIP按5’一 3’序列方向至少包含2段序列Flc、F2，其中，F2与F2c互补，F2c是靶核酸序列F3c在靶核酸5’方向的部分序列；FIP引物中的Flc是Fl的互补序列，Flc与处在靶核酸序列F2c的5’方向的部分序列相同，F3c是F3的互补序列； 所述后端内引物BIP按3’ 一 5’序列方向至少包含2段序列B2、Blc，其中，BIP引物中的B2与靶核酸部分序列相同，Blc是与处在靶核酸B2序列的3’方向的部分序列BI互补；所述Flc与BI在靶核酸序列上是相邻无碱基间隔的前后两段序列； 步骤2)中，利用引物F3、FIP、BIP、B3从靶核酸扩增出单链DNA目标模板后，DNA目标模板及其互补链两端分别形成发夹结构；其中，Fl、Blc之间或Flc、Bl之间形成了没有碱基缺口的杂交缝隙； 步骤3)中，DNA目标模板及其互补链两端之间的间隙能被DNA连接酶连接闭合，形成环化DNA链； 步骤4)中，在至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液中，至少以FIP和BIP两个内引物启动环化DNA链的滚环扩增。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，寡核苷酸序列还设计有辅助引物； 所述辅助引物为若干个；该辅助引物来源于BIP引物中不影响B2及Blc与靶核酸序列稳定结合的中间序列或BIP引物与B3引物之间的序列，或该辅助引物还同时来源于FIP引物中不影响F2及Flc与靶核酸序列稳定结合的中间序列或FIP引物与F3引物之间的序列。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，前端内引物FIP按5’一 3’序列方向至少包含2段序列F4、F2，其中，F2与靶核酸序列F2c互补杂交；F4序列是与单链DNA目标模板不相同且不互补的DNA序列； 所述后端内引物BIP按3’ 一 5’序列方向至少包含2段序列B2、B4，其中，B2与靶核酸部分序列相同；B4序列是与单链DNA目标模板不相同且不互补的DNA序列； 步骤I)中，还设有桥式引物BP，它按5’ 一 3’序列方向分别与FIP中F4的互补序列F4c和BIP中B4的两个序列全部或部分碱基杂交互补，或者按5’ 一 3’序列方向分别与BIP中B4的互补序列B4c和FIP中F4的两个序列全部或部分碱基杂交互补； FIP和BIP中最多有一条内引物中有部分序列不与桥式引物互补，而与靶核酸部分序列相同或互补，其位置在内引物F2或B2与靶核酸相同或互补位置的3’端方向； 步骤2)中，利用引物F3、FIP、BIP、B3从靶核酸扩增出单链DNA目标模板后，DNA目标模板或其互补链的两端以桥式引物为互补链形成了没有碱基缺口的杂交缝隙； 步骤3)中，DNA目标模板或其互补链的两端能被DNA连接酶连接为环化DNA链； 步骤4)中，在至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液中，至少以FIP和BIP两个内引物启动环化DNA链的滚环扩增。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述桥式引物BP，能通过另外设计的四个引物序列从靶核酸序列中与单链DNA目标模板序列完全无关的序列中扩增剥离出来；其中，所述四个引物序列，为重新设计的不同于F3、FIP、BIP、B3的内引物和外引物的各2条序列。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤I)中寡核苷酸序列还设计有辅助引物； 所述辅助引物来源于BIP引物中不影响B2与靶核酸序列稳定结合、B4与桥式引物稳定结合的中间序列或BIP引物与B3引物之间的序列，或该辅助引物还同时来源于FIP引物中不影响F2与靶核酸序列稳定结合、F4c与桥式引物稳定结合的中间序列或FIP引物与F3引物之间的序列。
11.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，逆转录酶包括:AMV或M-MLV ;带有链置换功能的DNA聚合酶包括Bst DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶； 步骤2)中，至少含有带有链置换功能的DNA聚合酶的核酸扩增反应溶液，其组分还至少包括扩增促进剂和核酸染料； 其中，扩增促进剂包括以下的一个或多个成分的组合甜菜碱，海藻糖、脯氨酸，二甲基亚砜、三甲胺-N-氧化物、氯化四甲基铵、甲酰胺、BSA、单链结合蛋白、T4Gene32Protein、homoectoine、Zn2+_cyclen ； 所述核酸染料包括SYBR Green I、钙黄绿素、GELGREEN和GELRED。
12.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，在根据靶核酸扩增出单链DNA目标模板前，还能进行样品的靶核酸扩增产物污染消除处理 样品完成核酸提取后，加入尿嘧啶-N-糖基化酶，将可能对样品造成了污染的靶核酸扩增产物中的尿嘧啶进行糖苷键水解，此后，将溶液温度升高到55-98°C并保持最多10分钟，溶液中的尿嘧啶-N-糖基化酶将被灭活。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述污染消除处理、扩增单链目标模板、DNA连接酶环化目标模板、环化目标模板滚环扩增四个步骤中，各步骤能设置不同的温度条件，或将其中的若干步骤设置同一个温度；这四个步骤中的相关试剂成分能分别多次添加或一次添加完成。
14.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤3)、4)中，所述DNA连接酶包括T4DNA ligase、Taq DNA Ligase、Ampligase 和 ssDNA Iigase0
15.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤4)中，带有链置换功能的DNA聚合酶包括Bst DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶； 所述含有DNA连接酶和带有链置换功能的DNA聚合酶的反应溶液，其组分还至少包括扩增促进剂或核酸染料； 其中，扩增促进剂包括以下的一个或多个成分的组合甜菜碱，海藻糖、脯氨酸，二甲基亚砜、三甲胺-N-氧化物、氯化四甲基铵、甲酰胺、BSA、单链结合蛋白、T4Gene32Protein、homoectoine、Zn2+_cyclen ； 所述核酸染料包括SYBR Green I、钙黄绿素、GELGREEN和GELRED。
16.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤2)的扩增的单链DNA目标模板、步骤3)的环化DNA链和步骤4)中的核酸产物，能通过免疫层析试纸或荧光信号进行检测。
17.一种应用于如权利要求I所述方法的试剂盒，其特征在于至少包括如权利要求I所述的寡核苷酸序列。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种 (1)如权利要求11所述的带有链置换功能DNA聚合酶； (2)如权利要求14所述的DNA连接酶； (3)如权利要求11所述的扩增促进剂； (4)如权利要求11所述的核酸染料； (5)尿嘧啶-N-糖基化酶； (6)如权利要求11所述的逆转录酶。
全文摘要
本发明公开了一种引物介导环化的恒温核酸滚环扩增方法及试剂盒，包括1)寡核苷酸序列设计；2)从靶核酸中扩增出单链DNA目标模板；3)DNA连接酶环化DNA目标模板；4)环化DNA目标模板滚环扩增。本发明不用合成高成本的长锁式探针，靶核酸的序列的长度能允许更大，能对靶核酸任意序列进行滚环扩增，并对防止样品被扩增产物污染提供了解决方法，开启了基因检测步入基层单位应用的新时代。
文档编号C12Q1/68GK103255227SQ20131021144
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月30日 优先权日2013年5月30日
发明者周中人, 周正峰, 林忠旺, 蒋庭, 刘秀贵, 黄知音 申请人:上海快灵生物科技有限公司