专利名称：位点突变的高活热稳定性纳豆激酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
:本发明涉及一种新型纳豆激酶编码基因及多肽，特别是一种因位点突变引起的活性和热稳定性均提高的纳豆激酶基因。本发明还涉及此基因在制备纳豆激酶方面的应用。
背景技术：
:当前高活、廉价、安全的溶栓药物发现是解决血栓疾病的关键。纳豆激酶(nattokinase，NK)是迄今为止发现的最好的具有溶栓作用的生物酶之一，在溶解血栓方面具有高效、安全、价格低廉、无毒副作用等优点，一直备受食品、生物及医药界研究人士的关注和重视。纳豆激酶是由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus natto)分泌表达的碱性丝氨酸蛋白酶，具有高效的纤维蛋白溶解活性。纳豆激酶由aprN基因编码，含有由29个亚基组成的信号肽，77个亚基组成的前导肽和275个亚基组成的成熟多肽，成熟肽分子量27.7KDa。NK活性中心包括催化三联体(Asp32、His64和Ser221)，氧离子洞(Asnl55)和底物结合位点(Serl25、Leul26和Glyl27)0获得高活、热稳定性纳豆激酶基因是研究溶栓纳豆激酶类保健食品及药品的关键；发现纳豆激酶中的相关活性区域或者位点，对于研究该酶的相关分子机制，及定向改造出更好的纳豆激酶类保健食品及新药具有重要的意义
发明内容
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本发明的目的是提供一种能够提高纳豆激酶活性和热稳定性的基因以及蛋白。本发明的第一方面，提供高活热稳定性纳豆激酶多肽，它包含:具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组:(a)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列不稳定区169-178、203-216、223-230、234-243、260-274和345-363经过一个或多个氨基酸残基的替换而形成的，且具有更高纳豆激酶活性和/或热稳定性的由(a)衍生的多肽。本发明的第二方面，提供编码这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组:(a)编码上述纳豆激酶的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。本发明人经过广泛而深入的研究，首先通过分子克隆方法从高活热稳定性纳豆激酶生产菌 Bacillus subitilis BSNK-T160 (CGMCC N0.6714)获得纳豆激酶全基因(SEQ IDNO:1所示序列，编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:2)，构建该基因的大肠杆菌重组表达体系，重组酶活性和热稳定性分析证实位于不稳定区段169-178和223-230的175和225位氨基酸残基替换导致纳豆激酶活性和热稳定性提高。在此基础上完成了本发明。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明还提供纳豆激酶的类似物，这些类似物与纳豆激酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然的、突变的或者合成的遗传变异体。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。编码多肽的编码区序列可以与SEQ IDNO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID N0:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括 单点或多点取代变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明的纳豆激酶核苷酸全长序列通常可以用PCR扩增法、人工合成、或重组法的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可用重组法大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的纳豆激酶多肽。一般来说有以下步骤:(I).用本发明的编码纳豆激酶多肽的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞，如何进行细胞培养、蛋白表达及分离纯化。
图1为BSNK-T160纳豆激酶全基因aprN’的PCR扩增电泳图。图中，从左到右分别为核酸marker和aprN’ ；目标片段长度1164bp,核酸marker分子量分别为 5000、3000、2000、1500、1000、800、500 和 300bp ；图2为BSNK-T160纳豆激酶全基因aprN’与T载体链接的酶切验证图。图中，EcoRI和 SacI 双酶切 pEASY-Tl 与 aprN’ 连接载体；pEASY_Tl 为 3928bp，aprN，为 1164bp,核酸 marker 同图1。图3为NK与NK ’序列比较图。NK’是aprN’编码的氨基酸序列，即SEQ ID NO:2所示序列，NK’中突变氨基酸用矩形方框标记，共计两个位点，175位Thr变为Ala，位于成熟肽的第66位；225位Ser变为Pro，位于成熟肽的116位。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。实施例1BSNK-T160纳豆激酶全基因(核苷酸序列SEQ ID NO:1)的克隆根据aprN核苷酸序列，设计一对PCR特异性引物，上下游引物分别含有EcoRI和SacI双酶切位点。从BSNK-T160基因组DNA中扩增出完整的核苷酸序列SEQ ID NO:1。其中，BSNK-T160是发明人通过6tlCo-Y辐照实验室分离保存的纳豆激酶生产菌BSNK-5后筛选获得的一株高活热稳定性菌株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC N0.6714。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如附图1所示。切取目标片段，连接到pEASY-Tl载体上。利用氯化钙转化法，将重组质粒转化TransI感受态细胞中，涂布于含卡那霉素(50μ g/ml)的LB固体培养基上，37°C培养12小时。挑取白色菌落，接种于3ml LB+Km液体培养基，37°C培养，碱裂解法提取重组质粒，EcoRI和SacI双酶切验证(图2)。测序获得基 因序列。实施例2序列比对分析测序结果分析可知BSNK-T160编码的纳豆激酶全基因aprN’ (SEQ ID NO:1)全长1164bp。翻译的蛋白序列NK’ (SEQ ID NO:2)含有387个氨基酸；信号肽序列从4到32，共计29个氨基酸；前导肽从33到109，共计77个氨基酸；成熟肽从110到384，共计275个
氨基酸。与aprN相比，aprN’共有4个核苷酸位点发生突变，106位核苷酸由A变为G，密码子由AAA到AAG，481位核苷酸由T变为C，密码子由GTT变为GTC，只是第三位密码子变化，未发生氨基酸变化，为同义突变；524位核苷酸由A变为G，密码子由ACG变为GCG，氨基酸由T175变为A175，位于成熟肽的第66位；674位核苷酸由T变为C，密码子由TCC变为CCC，氨基酸由S225变为P225，位于成熟肽的116位。具体比对结果如附图3所示，NK’是aprN’编码的氨基酸序列，即SEQ ID N0:2所示序列，NK’中突变氨基酸用矩形方框标记，共计两个位点，即175位由Thr变为Ala，位于不稳定区段169-178之间；225位由Ser变为Pro，位于不稳定区段223-230之间。实施例3构建大肠杆菌表达体系及分子验证EcoRI和SacI双酶切pEASY-Tl上连接的aprN’基因，与经过相同酶切的E.coll表达载体pET28a连接，构建表达此基因的大肠杆菌表达载体。利用氯化钙转化法，将重组载体转化BL21 (DE3)pLysS感受态细胞中，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养12小时。转化方法如下:I)取10μ L过夜连接产物加到I管感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置 30min ；2)将离心管置于42°C水浴中热激90s，不要晃动离心管；
3)迅速将离心管置于冰上，冷却2min ；4)加入800 μ L LB液体培养基，37°C，150rmp摇床培养45min ；5)取200 μ L培养液涂布于相应的抗生素平板筛选转化子。挑取菌落，碱裂解法提取质粒DNA，EcoRI和SacI双酶切及测序验证，得到一株含该核苷酸序列表达载体的重组菌株BL21pLysS (pET28a_aprN’)。实施例4重组纳豆激酶的活性和热稳定性分析1、方法将BL21pLysS (pET28a_aprN’ )以2%的接菌量接种于含有卡那霉素的LB液体培养基(卡那霉素浓度50 μ g/mL)中，37°C振荡培养至0D600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度
0.1mM, 16°C诱导18h，离心收集菌体，超声波破碎得上清。Ni树脂分离纯化的重组酶NK’。以重组酶NK为对照，分析NK’的活性和热稳定性。纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活力，具体实施方法参照Astrup法(Astrup T.andMullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity.Arch.Biochem.Biophys.(1952)40(2).);根据尿激酶标准曲线计算酶的活力单位,尿激酶标准曲线的制作参考马明等的方法(马明等.高纳豆激酶酶活枯草芽孢杆菌的筛选及菌种鉴定.中国食物与营养，2006, (8):29-32.)。65°C热处理20min,纤维蛋白平板法检测热稳定性。2、结果对分离纯化的BL21pLysS (pET28a_aprN，)和对照菌株 BL21pLysS (pET28a_aprN)表达的重组酶NK’和NK进行了活性和热稳定性分析，突变酶NK’在37°C的纤维蛋白溶解活性比对照酶NK提高了 11.18% ;65°C处理20min后对照酶NK完全失去活性，而突变酶NK’仍保留18U/mg的活性，具体结果见附表I。以上结果表明NK中与活性和热稳定性有关的位点分别为175位Ala，位于不稳定区段169-178之间；225位Pro，位于不稳定区段223-230之间。两个不稳定区内的氨基酸残基替换使得NK的活性和热稳定性发生明显提高。表INK与NK’的活性和热稳定性分析(活力单位为U/mg)
权利要求
1.一种纳豆激酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.权利要求I所述的基因,其活性位点位于如SEQID NO: I的核苷酸序列的106位、481位、524位和674位。
3.权利要求I所述的基因，与野生型纳豆激酶基因aprN相比，共有4个核苷酸位点发生突变106位核苷酸由A变为G，密码子由AAA到AAG ；481位核苷酸由T变为C，密码子由GTT变为GTC ；524位核苷酸由A变为G，密码子由ACG变为GCG ；674位核苷酸由T变为C，密码子由TCC变为CCC。
4.权利要求I所述基因在制备高活、热稳定性纳豆激酶中的应用。
5.—种纳豆激酶多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.权利要求5所述的多肽，与天然纳豆激酶相比，特征是SEQID NO:2的一个或一个以上不稳定区经过氨基酸残基的替换形成具有更高纳豆激酶活性和/或热稳定性的多肽，所述不稳定区选自 SEQ ID NO:2 ψ 169-178、203-216、223-230、234-243、260-274 和345-363。
7.权利要求6所述的多肽，其中所述替换是不稳定区169-178和不稳定区223-230发生单个氨基酸替换。
8.权利要求6所述的多肽，其中所述替换是不稳定区169-178的175位Thr变为Ala；不稳定区223-230的225位Ser变为Pro。
9.权利要求5 8任一所述的多肽在制备纳豆激酶类产品中的应用。
全文摘要
本发明从高活热稳定性纳豆激酶生产菌中获得了一种活性和热稳定性均提高的纳豆激酶基因。经酶活性和热稳定性分析，证实位于不稳定区段169-178和223-230的175和225位氨基酸残基替换导致纳豆激酶活性和热稳定性提高。本发明还涉及此基因在制备纳豆激酶方面的应用。
文档编号C12N15/57GK103255156SQ20131021113
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月30日 优先权日2013年5月30日
发明者唐选明, 李淑英, 聂莹 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所