专利名称：一种使用dc细胞刺激cik细胞快速增殖的方法
技术领域：
本发明属于过继免疫治疗中细胞培养领域，尤其涉及一种使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法。
背景技术：
全国每6分钟就有一人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每七到八人中就有一人死于癌症。未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升。从“癌症县”至IJ “癌症村”，中国肿瘤发病的历史与地理坐标背后，是社会发展与生活方式数十年变迁带来的癌症高发态势。肿瘤是目前成胁人类健康的重大疾病之一。目前，恶性肿瘤是全球第二大致命疾病，也是中国城乡居民第一位死亡原因，中国每年新发肿瘤患者总数约200万，新增肿瘤患者年增长率在10%左右。《2013年报》上的发病年龄曲线提示着，中国癌症发病呈现年轻化趋势，乳腺癌、肺癌、结肠癌、甲状腺癌等癌症的发病年龄均低于此前的数据。最新数据显示，全国35岁至39岁年龄段中，平均每10万人中有87.07人会罹患癌症，而在40岁至44岁年龄段中，这一数字达到了 154.53。对于导致中国癌症患者年轻化的原因，肿瘤学家们的共识是:环境污染、不良生活方式与现代社会生活造成的精神压力。季加孚举例说，空气中的PM2.5问题，是近10年才出现的。癌症的发展需要长期的过程，因此，对于今天已经五六十岁的人来说，这种空气污染不会明显增加他们患肺癌的风险。但试想，一个10年前出生的人，从他小时候起，就长期呼吸这种空气，今后得肺癌的几率肯定要大大提高。《2013年报》显示，中国人癌症的发病高峰在75岁 80岁年龄组。“原先人的寿命没有那么长，癌症还没有来得及发生，人就已经因其他疾病而去世了。而现在，中国70岁以上的老人越来越多了，癌症发生的几率也就大大增加了”。中国人口仍在不断趋于老龄化，癌症发病率上升的势头还将持续。如果对癌症的发病率进行横向比较，占据癌症发病率排行榜前10位的都是发达国家，如丹麦、法国、澳大利亚等，中国的发病率尚属中等水平，大约在八九十位。虽然手术、放化疗仍是肿瘤的主要治疗方法，但是，即使根治性手术也只能解决局部问题，不能避免全身转移。放、化疗存在的最大问题是其杀伤作用没有针对性，长期的化疗、放疗会损伤机体的免疫系统及各器官组织的功能，甚至诱发新的癌变。更为重要的是由于肿瘤细胞缺乏特异性的抗原、肿瘤细胞的抗原调变及MHC分子表达异常等因素导致肿瘤免疫逃逸，成为肿瘤治疗的一大难题。患过癌症的病人有这样一种说法:“80%的癌症患者不是死于癌症，而是死于过度化疗。”这是因为，化疗药物往往有副作用，在杀死癌细胞的同时也杀死健康细胞，导致病人免疫力低下，还会造成呕吐、脱发、局部组织坏死等等。尽管如今的化疗药物已能够避免患者的呕吐反应，复杂的药物配合方案也可以降低对人体的误伤，但这样的进步，仍是杯水车薪。
细胞免疫治疗是近几年兴起的第四种肿瘤治疗方法,细胞免疫治疗是指把病人的细胞从血里面分离出来，在体外用一些细胞因子，使它变成一种杀伤细胞，再回输到血液中去，这种杀伤细胞可以识别肿瘤细胞进行杀伤。还有一种给病人直接用一些免疫制剂，像干扰素还有白介素II等等，都叫免疫治疗。免疫治疗指的是刺激人体自身免疫系统来抵抗癌症的治疗方法。免疫系统是人体抵抗疾病的自身的防卫系统。免疫疗法也叫做生物反应修正剂(Biologic Response Modifiers)或生物疗法。细胞因子诱导的杀伤细胞(CytokineInduced Killer cell,CIK)是一种新型的免疫活性细胞，它是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该细胞群中多数细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞。CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广及非MHC限制性杀瘤的优点。目前，CIK疗法被认为是新一代抗肿瘤过继免疫治疗的首选方案。CIK细胞在抗肿瘤治疗过程中的特点包括= (I)CIK细胞增殖速度快，可以在短期内大量扩增，满足临床治疗的需要。(2) CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常细胞无毒性作用。(3) CIK细胞杀瘤活性高，杀瘤谱广，对多种耐药肿瘤细胞同样敏感。(4)CIK细胞是典型的个体化生物治疗模式。它来源于自体T淋巴细胞，将这类细胞回输后，可提高对肿瘤细胞的杀伤活性，还能提高机体的免疫能力，从而对肿瘤治疗施以双重作用。(5)杀瘤活性不受CSA、FK506等免疫抑制剂的影响。(6)对正常骨髓造血前体细胞毒性很小。(7)能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡。(8)由于CIK细胞是活化的自体细胞，应用起来非常安全。树突状细胞(Dendritic Cells，DC)源自骨髓中的前体细胞，是已知机体内抗原呈递能力最强的细胞，比普通抗原呈递细胞强1000倍，它在负载肿瘤抗原后，能刺激T淋巴细胞分化为具有抗肿瘤活性的细胞毒性T淋巴细胞，对肿瘤细胞实施特异性杀伤。DC细胞可通过多种机制发挥其抗肿瘤免疫作用。(I)诱导细胞免疫；DC摄取肿瘤抗原后，将其加工处理为肽-MHC分子复合物表达于细胞表面，进而与T细胞表面的T细胞受体(T cell receptor, TCR)结合，同时与DC表面高表达的CD80、CD86等共刺激分子协同作用下，共同激活T细胞,启动⑶8+细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)介导的免疫应答。(2)增强体液免 疫一方面，DC通过促进抗原特异性⑶4+辅助性T细胞(HelperT Cell, Th)的产生，促进抗体生成；另一方面，DC直接作用于B细胞，促进免疫球蛋白的分泌。DC通过I型干扰素(Interferon，IFN)的分泌，直接诱导初始和记忆B细胞分化为浆细胞，产生大量免疫球蛋白IgM。(3)分泌多种细胞因子或趋化因子；DC分泌的IL-12可诱导ThO细胞向Thl细胞分化，启动细胞性免疫应答，抑制IL-12的产生则促进IL-10的分泌及Th2细胞极化。IL-15以膜结合方式存在于DC表面，显著刺激次级淋巴器官中自然杀伤细胞的增殖。DC还可分泌一种特异性趋化因子，选择性趋化初始型T细胞，增强对免疫应答的诱导作用。(4)DC通过与某些肿瘤细胞相互接触，直接抑制肿瘤细胞的生长。(5)肿瘤抗原致敏的DC可释放一种具有抗原递呈能力的囊泡小体exosomes,该小体内含有大量MHC-1、II类分子。然而，DC细胞成熟慢、生存期短、CIK细胞的扩增培养时间较长，两者单独培养存在一定的缺陷。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法，旨在解决DC细胞成熟慢、生存期短，CIK细胞的扩增培养时间较长的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法，该方法包括以下步骤:外周血单核细胞PBMC的分离；细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导培养；CIK细胞诱导培养；DC细胞诱导培养；CIK细胞表型⑶3+CD56+的检测。进一步、，PBMC是从健康人外周血白细胞经Ficoll密度梯度离心获得，PBMC的分离具体步骤如下:(I)事先预热的生理盐水与血站取来的外周血白细胞1:1稀释，移液管吹打混匀；(2)将40mL淋巴细胞分离液与Ficoll等量均分放入2个50mL刻度离心管，每管20mL ；(3)将步骤(I)中50mL液体等量均分缓慢滴加放入步骤(2)已加入Ficoll的2个离心管中，滴加过程中注意用力均匀,加入的速度也要均匀,避免破坏Ficoll-外周血界面的完整，800g条件下,离心20min ；(4)离心完成后，管内液体分为三层，移液管弃去上层15mL液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带5-10mL放入步骤(5)准备的50mL刻度离心管中，混匀，1500rpm，离心 8min ；`(5)弃上清，再加入30mL生理盐水，混勻，1200rpm,离心6min ；(6)弃上清，30mL培养基重悬细胞，吹打混匀，取样ΙΟΟμ I至1.5mLEP管，加入400 μ I生理盐水和500 μ I typan blue染色计数，30mL培养基重悬细胞液，1000r/min,离心6min，弃上清，获得PBMC。进一步，细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导培养具体方法如下:步骤一、调制IL-2和IFN-Y:分别用D-PBS溶解后，调节至1000IU/μ 1，4°C保存；步骤二、配包被液:50mL离心管中加入D-PBS20mL，加入RetroNectin250y 1，终浓度12.5ug/mL，爱欧山CD3抗体100 μ 1，终浓度5ug/mL ；步骤三、将包被液加入T175cm2培养瓶，平放，混匀，4°C，避光，过夜。进一步，CIK细胞诱导培养的具体方法为:3)清洗培养瓶:取出包被过的培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mL
培养基洗一次；4)接种细胞:用40mL含2%胎牛血清的细胞培养液GT-T551重悬步骤2)所获得PBMC细胞，并将获得PBMC细胞加入已包被的T175cm2培养瓶，添加IL-240 μ 1，终浓度1000IU/mL, IFN- Y 40 μ 1，终浓度 1000IU/mL ；3)将接种后的培养瓶置37°C，5% CO2培养箱培养。进一步，DC细胞诱导培养的具体方法为:I)第零天，分血，分两组，一组贴壁过夜，另一组贴壁45分钟后，弃掉贴壁细胞剩下的细胞继续贴壁过夜，包板准备培养CIK，75mL培养瓶中加入IOmL包被液；2)第一天，早上将未贴壁细胞冻存，冻存液-LMD: DMSO:细胞+培养液=1:1: 8，剩余贴壁细胞+AM-V+GM-CSF 和 IL-4，各 lOOng/ml ;3)第三天，补充因子至全量；4)第六天抗原负载-采用携带抗原TERT的5型腺病毒载体进行感染；5)第七天:刺激 DC 成熟，100ng/ml 的 TNF- a，100ng/ml 的 IL-6 和 25ng/ml 的IL-1 β ；6)第八天取样4-6 X IO6细胞测DC表型同时进行特异性成熟DC与CIK细胞进行共培养，DC细胞与CIK细胞的数量比值为1: 10，共培养时间为7天，每隔一天换液AM-V，调整IL-2的浓度为20IU/mL ；7)第十六天 收取CIK细胞，计数，测细胞表型。本发明提供的使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法在短期内使得CIK细胞的数量得到大幅扩增，同时保证CIK细胞(Cytokine-1nduced Killer Cells)表面的CD3+CD56+的比例不会发生较大改变，但双阳性比例会有所提高，杀伤功能会一定程度上的到增强，明显缩短了 CIK的扩增时间，同时提高了增殖倍数，具有重要的科研价值。
图1是本发明实施例提供的使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法流程图；图2是本发明实施例提供的流式细胞术检测三种DCs表型⑶80、⑶83、⑶86和CDl α不意图；图3是本发明实施例提供的DC-CIK共培养图片；图4是本发明实施例提供的CIK经DC刺激前后表型流式细胞检测结果对比示意图。左图为CIK未经刺激时⑶3 (横坐标)⑶56 (纵坐标)的流式分析图，其中⑶3⑶56双阳性率为1.2%右图为CIK经DC刺激时⑶3⑶56的流式分析图，经刺激后⑶3⑶56双阳性率为35.9%，说明使用DC刺激CIK后CIK的⑶3⑶56表型双阳性比例大大提高，杀伤功能也随之提闻。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。图1示出了本发明提供的使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。如图1所示，本发明的实施例提供的使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法包括以下步骤:外周血单核细胞PBMC的分离；细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导培养；CIK细胞诱导培养；DC细胞诱导培养；
CIK细胞表型⑶3+CD56+的检测。作为本发明实施例的一优化方案，PBMC是从健康人外周血白细胞经Ficoll密度梯度离心获得，PBMC的分离具体步骤如下:(I)事先预热的生理盐水与血站取来的外周血白细胞1:1稀释，移液管吹打混匀；(2)将40mL淋巴细胞分离液与Ficoll等量均分放入2个50mL刻度离心管，每管20mL ；(3)将步骤(I)中50mL液体等量均分缓慢滴加放入步骤⑵已加入Ficoll的2个离心管中，滴加过程中注意用力均匀,加入的速度也要均匀,避免破坏Ficoll-外周血界面的完整，800g条件下,离心20min ；(4)离心完成后，管内液体分为三层，移液管弃去上层15mL液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带5-10mL放入步骤(5)准备的50mL刻度离心管中，昆匀，1500rpm，离心 8min ；(5)弃上清，再加入30mL生理盐水，混勻，1200rpm,离心6min ；(6)弃上清，30mL培养基重悬细胞，吹打混匀，取样ΙΟΟμ I至1.5mLEP管，加入400 μ I生理盐水和500 μ I typan blue染色计数，30mL培养基重悬细胞液，1000r/min,离心6min，弃上清，获得PBMC。作为本发明实施例的一优化方案，细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导培养具体方法如下:步骤一、调制IL-2和IFN-Y:分别 用D-PBS溶解后，调节至1000IU/μ 1，4°C保存；步骤二、配包被液:50mL离心管中加入D-PBS20mL，加入RetroNectin250y 1，终浓度12.5ug/mL，爱欧山CD3抗体100 μ 1，终浓度5ug/mL ；步骤三、将包被液加入T175cm2培养瓶，平放，混匀，4°C，避光，过夜。作为本发明实施例的一优化方案，CIK细胞诱导培养的具体方法为:5)清洗培养瓶:取出包被过的培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mL培养基洗一次；6)接种细胞:用40mL含2%胎牛血清的细胞培养液GT-T551重悬步骤2)所获得PBMC细胞，并将获得PBMC细胞加入已包被的T175cm2培养瓶，添加IL-240 μ 1，终浓度1000IU/mL, IFN- Y 40 μ 1，终浓度 1000IU/mL ；3)将接种后的培养瓶置37°C，5% CO2培养箱培养。作为本发明实施例的一优化方案，DC细胞诱导培养的具体方法为:I)第零天，分血，分两组，一组贴壁过夜，另一组贴壁45分钟后，弃掉贴壁细胞剩下的细胞继续贴壁过夜，包板准备培养CIK，75ml培养瓶中加入IOml包被液；2)第一天，早上将未贴壁细胞冻存，冻存液-LMD: DMSO:细胞+培养液=1:1: 8，剩余贴壁细胞+AM-V+GM-CSF 和 IL-4，各 100ng/ml ;3)第三天，补充因子至全量；4)第六天抗原负载-采用携带抗原TERT的5型腺病毒载体进行感染；5)第七天:刺激 DC 成熟，100ng/ml 的 TNF- a，100ng/ml 的 IL-6 和 25ng/ml 的IL-1 β ；
6)第八天取样4-6 X IO6细胞测DC表型同时进行特异性成熟DC与CIK细胞进行共培养，DC细胞与CIK细胞的数量比值为1: 10，共培养时间为7天，每隔一天换液AM-V，调整IL-2的浓度为20IU/mL ；7)第十六天收取CIK细胞，计数，测细胞表型。下面结合附图1-4及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。从血站获得外周血白细胞调制IL-2和IFN- Y:分别用D-PBS溶解后，调节至1000IU/μ 1，4 V保存。配包被液:50mL离心管中加入D_PBS20mL，加入RetroNectin250 μ I (终浓度 12.5ug/mL)，爱欧山 CD3 抗体 100 μ I (终浓度 5ug/mL);将包被液加入T175cm2培养瓶，平放，混匀，4°C，避光，过夜；(I)事先预热的生理盐水与血站取来的外周血白细胞1:1稀释，移液管吹打混匀；(2)将40mL淋巴细胞分离液与Ficoll等量均分放入2个50mL刻度离心管，每管20mL ；(3)将步骤(I)中50mL液体等量均分缓慢滴加放入步骤⑵已加入Ficoll的2个离心管中。滴加过程中注意用力均匀,加入的速度也要均匀,尽量避免破坏Ficoll-外周血界面的完整，800g条件下，离心20min ；(4)离心完成后，管内液体分为三层，移液管弃去上层约15mL液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带(约5-10mL)放入50mL刻度离心管中，混勻，1500rpm,离心8min ；(5)弃上清，再加入30mL生理盐水，混勻，1200rpm,离心6min ；(6)弃上清，30mL培养基重悬细胞，吹打混匀，取样100μ I至1.5mLEP管，加入400 μ I生理盐水和500 μ I typan blue染色计数，30mL培养基重悬细胞液，1000r/min,离心6min。弃上清，获得PBMC。DC细胞诱导培养:第零天，分血，分两组，一组贴壁过夜，另一组贴壁45分钟后，弃掉贴壁细胞剩下的细胞继续贴壁过夜，包板准备养CIK (75ml培养瓶中加入IOml包被液)；第一天，早上将未贴壁细胞冻存(冻存液-LMD: DMSO:细胞+培养液=I: I: 8)，剩余贴壁细胞+AM-V+GM-CSF和IL-4(各100ng/ml);第三天，补充因子至全量；第六天抗原负载-采用携带抗原TERT的5型腺病毒载体进行感染；第七天:刺激DC 成熟，100ng/ml 的 TNF- a，100ng/ml 的 IL-6 和 25ng/ml 的 IL-1 β ;第八天取样 4-6 X IO6细胞测DC表型同时进行特异性成熟DC与CIK细胞进行共培养，DC细胞与CIK细胞的数量比值为1: 10，共培养时间为7天，每隔一天换液AM-V，调整IL-2的浓度为20IU/mL。第十六天收取CIK细胞，计数，测CIK细胞⑶3⑶56表型。CIK未经刺激时⑶3 (横坐标)⑶56(纵坐标)的流式分析图，其中⑶3⑶56双阳性率为1.2%，CIK经DC刺激时⑶3⑶56的流式分析图，经刺激后⑶3⑶56双阳性率为35.9%，说明使用DC刺激CIK后CIK的⑶3⑶56表型双阳性比例大大提高，杀伤功能也随之提高。以上所 述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 外周血单核细胞PBMC的分离； 细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导培养； CIK细胞诱导培养； DC细胞诱导培养； CIK细胞表型⑶3+⑶56+的检测。
2.如权利要求I所述的使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法，其特征在于，PBMC是从健康人外周血白细胞经Ficoll密度梯度离心获得，PBMC的分离具体步骤如下 (1)事先预热的生理盐水与血站取来的外周血白细胞I: I稀释，移液管吹打混匀； (2)将40mL淋巴细胞分离液与Ficoil等量均分放入2个50mL刻度离心管，每管20mL； (3)将步骤(I)中50mL液体等量均分缓慢滴加放入步骤(2)已加入Ficoll的2个离心管中，滴加过程中注意用力均匀，加入的速度也要均匀，避免破坏Ficoll-外周血界面的完整,800g条件下,离心20min ； (4)离心完成后，管内液体分为三层，移液管弃去上层15mL液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带5-10mL放入步骤(5)准备的50mL刻度离心管中，混匀，1500rpm，离心8min ； (5)弃上清，再加入30mL生理盐水，混勻，1200rpm,离心6min； (6)弃上清，30mL培养基重悬细胞，吹打混匀，取样100μ I至I. 5mLEP管，加入400 μ I生理盐水和500 μ I typan blue染色计数,30mL培养基重悬细胞液，1000r/min,离心6min,弃上清，获得PBMC。
3.如权利要求I所述的使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法，其特征在于，细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导培养具体方法如下 步骤一、调制IL-2和IFN-Y :分别用D-PBS溶解后，调节至IOOOIU/μ 1，4°C保存； 步骤二、配包被液50mL离心管中加入D-PBS20mL，加入RetroNectin250y 1，终浓度12. 5ug/mL，爱欧山 CD3 抗体 100 μ 1，终浓度 5ug/mL ； 步骤三、将包被液加入T175cm2培养瓶，平放，混匀，4°C，避光，过夜。
4.如权利要求I所述的使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法，其特征在于，CIK细胞诱导培养的具体方法为 1)清洗培养瓶取出包被过的培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mL培养基洗一次； 2)接种细胞用40mL含2%胎牛血清的细胞培养液GT-T551重悬步骤2)所获得PBMC细胞，并将获得PBMC细胞加入已包被的T175cm2培养瓶，添加IL-240y 1，终浓度1000IU/mL, IFN- Y 40 μ 1，终浓度 1000IU/mL ； 3)将接种后的培养瓶置37°C，5%CO2培养箱培养。
5.如权利要求I所述的使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法，其特征在于，DC细胞诱导培养的具体方法为 I)第零天，分血，分两组，一组贴壁过夜，另一组贴壁45分钟后，弃掉贴壁细胞剩下的细胞继续贴壁过夜，包板准备培养CIK，75ml培养瓶中加入IOml包被液；2)第一天，早上将未贴壁细胞冻存，冻存液-LMD DMSO :细胞+培养液=1 : I : 8，剩余贴壁细胞 +AM-V+GM-CSF 和 IL-4，各 100ng/mL ； 3)第三天，补充因子至全量； 4)第六天抗原负载-采用携带抗原TERT的5型腺病毒载体进行感染； 5)第七天刺激DC 成熟，100ng/ml 的 TNF- a，100ng/ml 的 IL-6 和 25ng/ml 的 IL-1 β ； 6)第八天取样4-6X IO6细胞测DC表型同时进行特异性成熟DC与CIK细胞进行共培养，DC细胞 与CIK细胞的数量比值为I : 10，共培养时间为7天，每隔一天换液AM-V，调整IL-2的浓度为20IU/mL ； 7)第十六天收取CIK细胞，计数，测细胞表型。
全文摘要
本发明公开了一种使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法，该方法包括以下步骤外周血单核细胞PBMC的分离；细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导培养；CIK细胞诱导培养；DC细胞诱导培养；CIK细胞表型CD3+CD56+的检测。本发明提供的使用DC细胞刺激CIK细胞快速增殖的方法在短期内使得CIK细胞的数量得到大幅扩增，同时保证CIK细胞表面的CD3+CD56+的比例不会发生较大改变，明显缩短了CIK的扩增时间，同时提高了增殖倍数，具有重要的科研价值。
文档编号C12N5/0783GK103255105SQ201310210949
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月31日 优先权日2013年5月31日
发明者陈晚华, 孙庆文, 曲平波, 王延春, 颜廷骥, 张俊艺 申请人:陈晚华