专利名称：一种检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法
一种检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法技术领域
本发明属于药物检测的技术领域，具体是一种检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法。
背景技术：
绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、兴奋中枢神经系统和清除自由基等作用。含绿原酸类成分的中药注射剂如双黄连注射液、清开灵注射液等约占已上市中药注射剂品种数量的22%，其临床疗效确切，而不良反应时有发生(主要为过敏反应，其中类过敏反应约占70%-80%)。绿原酸类成分作为一种主要的药效成分，同时又是一种可疑的致敏物质，但至今该类成分是否为过敏原尚未有定论，其客观真实性亟待阐明！目前，类过敏反应检查缺乏足够可靠的动物模型，也就难以建立相应的评价方法。新近开展的小鼠耳廓蓝染试验法、 降压检查法在物种差异、反应链末端化、重现性等方面还有待解决；过敏介质或扫描/透射电镜检测，因半衰期短或需化学固定、显色处理，操作繁琐、且细胞已死亡导致系列生物信息缺失；仅能观察某一时相状态，缺乏连续动态监测。发明内容
为解决上述技术缺陷，本发明公开了一种检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，一般检测溶液或药液的类过敏反应时，本领域都是采用RBL-2H3作为检测对象，本发明的方法可实时反映RBL-2H3在添加含绿原酸类成分前后经历的生长、伸展、形态变化、死亡生理状态，并且得出绿原酸类成份导致类过敏反应的溶液浓度范围，从而在使用含绿原酸类成份药品的治疗中，可避免药液产生过敏反应对人体造成的不良影响，提高治疗效率，减轻患者的痛苦。
实现上述目的技术方案是，本发明公开的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，包括以下步骤，(I)分别制备不同浓度的RBL-2H3细胞悬液和绿原酸类 成分溶液；(2)利用实时细胞分析仪对不同细胞浓度的RBL-2H3悬液中的细胞生长指数进行监测，确定实时细胞分析仪检测绿原酸类成分导致类过敏反应时使用的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度及添加绿原酸类成分溶液的最佳时间点；(3)利用实时细胞分析仪检测添加绿原酸类成分溶液前后的RBL-2H3细胞生长指数值，根据添加绿原酸类成分溶液后RBL-2H3细胞生长指数值的变化情况，判断绿原酸类成分是否会导致类过敏反应。
所述的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法中，采用的实时细胞分析仪为DP 型实时细胞分析仪。DP型号是罗氏公司推出的最新型号的实时细胞分析仪，新的DP型实时细胞分析仪利用无标记、非侵入性电极阻抗测量得出细胞生长指数值，提供了实时的细胞分析，并对平行进行短期和长期的分析研究者来说具有高度的灵活性，DP型的实时细胞分析仪的检测板共3块16个孔板，可由三个不同的用户同时操作，由于其体积小，检测板可放入标准的培养箱中，轻松实现最优的培养的条件。
所述的绿原酸类成分为绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸或新绿原酸。绿原酸类成分是对绿原酸及其异构体、分解产物、提取中可能产生的结构变异等的统称。所述不同浓度绿原酸类成分溶液的配制方法是，将绿原酸类成分用RBL-2H3细胞培养液溶解，再用孔径为0.2 μ m的微孔滤膜过滤除菌得到绿原酸类成分母液，再用RBL-2H3细胞培养液将绿原酸类成分母液稀释，得到不同浓度的绿原酸类成分溶液。利用RBL-2H3细胞培养液作为绿原酸类成分溶液的溶剂，防止其它化学试剂破坏细胞的黏性、弹性，避免了细胞破裂、聚堆不好观察现象的发生。所述RBL-2H3细胞培养液为质量浓度15%胎牛血清的DMEM培养液或质量浓度15%胎牛血清的MEM培养液。所述步骤(2)的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100 μ I的RBL-2H3细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中C02的体积浓度为5%，温度为37°C;②设置信号采集频率为I次/min，测量实时细胞分析仪未有RBL-2H3细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准分别将100 μ I不同细胞浓度的RBL-2H3细胞培悬液加入每个检测板板孔中的RBL-2H3细胞培养液中，设定信号采集频率为I次/15min，测量实时细胞分析仪有RBL-2H3细胞时培养液中的细胞生长指数；④分析比较不同浓度RBL-2H3细胞悬液的细胞生长指数曲线，选择RBL-2H3细胞加入到RBL-2H3细胞培养液后最快经过潜伏期进入对数生长期，且当实时细胞分析仪检测到45h时RBL-2H3细胞仍能处于对数生长期对应的RBL-2H3细胞悬液浓度，即为实时细胞分析仪检测绿原酸类成分导致类过敏反应时使用的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度；⑤分析④步确定的最佳细胞浓度的RBL-2H3细胞所对应的细胞生长指数曲线，当细胞生长指数为I的时间点，即为添加绿原酸类成分溶液的最佳时间点。上述步骤④分析比较不同浓度RBL-2H3细胞悬液的细胞生长指数曲线时，不同浓度RBL-2H3细胞细胞悬液是RBL-2H3细胞浓度为2X 105、4X 105、5X 105、8X 105的细胞悬液，上述RBL-2H3浓度的单位为个/ml。上述步骤④确定的用于实时细胞分析仪检测绿原酸类成分导致类过敏反应的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度为2X 105个/ml。确定用于实时细胞分析仪检测绿原酸类成分导致类过敏反应的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度时，依据RBL-2H3细胞的对数生长期作为判断细胞悬浮液浓度指标的原因是，对数生长期是细胞活力最好时期，是进行实验的最佳时期，细胞浓度过小则细胞需要经过较长时间的潜伏期才能进入对数生长期，导致试验周期过长；细胞浓度过大则营养物质消耗快，且细胞易粘 连、叠加，则细胞很快经过对数生长期并开始脱落、死亡。在选择用于检测的最佳细胞浓度时，一般选择RBL-2H3细胞进入对数生长期的1/3 2/3细胞的生长率显著增高的时段，同时为了方便后续不同浓度绿原酸类成分溶液添加到RBL-2H3细胞悬液中的细胞生长曲线好拟合对比，综合考察，一般细胞指数为I的时间点，为添加绿原酸类成分溶液的最佳时间点。所述步骤(3)的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100 μ I的RBL-2H3细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中C02的体积浓度为5%，温度为37°C，设置信号采集频率为I次/min,实时细胞分析仪检测未有RBL-2H3细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准将步骤(2) 确定的最佳细胞浓度的RBL-2H3细胞悬液100 μ I加入到每个检测板板孔的RBL-2H3细胞培养液中，设定信号采集频率为I次/15min，实时细胞分析仪对培养液中RBL-2H3的细胞生长指数进行监测；③待细胞生长到步骤(2)确定的最佳添加绿原酸类成分溶液的时间点时，吸弃检测板板孔中的RBL-2H3细胞培养液，再向每个板孔中加入200 μ I不同浓度的绿原酸类成分溶液，另设置2个板孔，添加200 μ 1RBL-2H3细胞培养液，即为空白对照板孔；④设定信号采集频率为I次/min，实时细胞分析仪检测绿原酸类成分溶液中RBL-2H3细胞生长指数。步骤①中基准的测定是为了扣除细胞培养液本身所带电荷可能产生的背景数值，有效保证了结果的准确性及可重复性。
综上，本发明检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法有益效果是，1、选用RBL-2H3作为被测细胞，RBL-2H3可从肿瘤状态的嗜碱性细胞分离和克隆出来， 这些细胞能够在体外增殖、传代，被广泛地用做类过敏反应肥大细胞脱颗粒的体外实验模型；2、在本发明中所使用的方法能够将绿原酸类成分溶液对细胞作用的全过程进行实时在线监测，无需标记、灵敏专属、而且能节约大量的人力物力；3、通过对不同浓度细胞悬液中RBL-2H3细胞生长情况进行监测，对比不同浓度下的 RBL-2H3细胞增殖曲线，能够筛选出用于检测绿原酸类成分导致类过敏反应的最佳细胞浓度的细胞悬液和最佳添加绿原酸类成分溶液的最佳时间点；3、通过对本发明方法所得到的图谱数据，与现有技术利用显微照片进行分析相比，能够得到各个绿原酸单体致类过敏反应的真实性及引起类过敏反应的浓度范围，同时节约了检测时间，操作方便，仅需利用仪器自动生成的图谱就可清楚、精确的了解绿原酸类成分各种单体的类过敏反应。
4、通过对比不同绿原酸溶剂的图谱之间的差异也能对其作用机制研究提供支持;5、本发明的技术方案具有定性定量、简便快捷、易于推广的优点。
图1为DP实时细胞分析仪监测的不同浓度compound48/80溶液中RBL-2H3的细胞生长指数值谱图，该谱图以时间横轴，细胞生长指数Cl值为纵轴；图2为DP实时细胞分析仪监测的不同浓度绿原酸溶液中RBL-2H3的细胞生长指数值谱图，该谱图以时间横轴，细胞生长指数Cl值为纵轴；图3为DP实时细胞分析仪监测的不同浓度异绿原酸A溶液中RBL-2H3的细胞生长指数值谱图，该谱图以时间横轴，细胞生长指数Cl值为纵轴；其中，曲线I为DP实时细胞分析仪监测不同浓度cOmpOund48/80溶液中RBL-2H3的细胞生长指数时，设置的空白对照组的细胞生长指数曲线；曲线2为质量浓度100ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的细胞生长指数； 曲线3为质量浓度50ug/ml的COmpOund48/80溶液中R·BL-2H3的细胞生长指数；曲线4为质量浓度40ug/ml的compound48/80溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；曲线5为质量浓度30ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；曲线6为质量浓度20ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；
曲线7为质量浓度10ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；
曲线8为质量浓度5ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；
曲线9为DP实时细胞分析仪监测不同浓度绿原酸溶液中RBL-2H3的细胞生长指数时，设置的空白对照组的细胞生长指数曲线；
曲线10为质量浓度200ug/ml的绿原酸溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；
曲线11为质量浓度100ug/ml的绿原酸溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；
曲线12为质量浓度50ug/ml的绿原酸溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；
曲线13为质量浓度25ug/ml的绿原酸溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；
曲线14为质量浓度12.5u g/ml的绿原酸溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；
曲线15为质量浓度6.25ug/ml的绿原酸溶液中RBL-2H3的细胞生长指数；
曲线16为DP实时细胞分析仪监测不同浓度异绿原酸A溶液中RBL-2H3的细胞生长指数时，设置的空白对照组的细胞生长指数曲线；
曲线17为质量浓度200ug/ml的异绿原酸A溶液中RBL-2H3细胞的生长指数；
曲线18为质量浓度100ug/ml的异绿原酸A溶液中RBL-2H3细胞的生长指数；
曲线19为质量浓度50ug/ml的异绿原酸A溶液中RBL-2H3细胞的生长指数；
曲线20为质量浓度25ug/ml的异绿原酸A溶液中RBL-2H3细胞的生长指数；
曲线21为质量浓度12.5ug/ml的异绿原酸A溶液中RBL-2H3细胞的生长指数；
曲线22为质量浓度6.25ug/ml的异绿原酸A溶液中RBL-2H3细胞的生长指数。
具体实施例方式以下结合具体实施例来进一步说明发明内容。实施例一:本发明检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，绿原酸类成分有绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸或新绿原酸，本发明方法可同时对不同浓度、各种绿原酸单体导致类过敏反应进监测，类过敏反应是是一种无免疫系统参与的，由化学性或药理性介导的，首次用药即表现出与过敏反应相似症状的临床反应。实施例一列举的是检测绿原酸溶液导致类过敏反应的方法，本实施例中用到的实时细胞分析仪均是DP型实施细胞分析仪。1、试验中所用到的仪器:RTCA DP (德国Roche公司)；E_Plate 16检测板(6x6plates,德国Roche公司);恒温培养箱(5410型，美国Napco公司);冷冻离心机(HC-3018R型，安徽中科中佳科学仪器有限公司);电子天平(AL-204型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；吉尔森移液器(P100型、PlOOO型，法国GILSON公司)；微孔滤膜(0.20 μπι，美国Millipore 公司);培养瓶(25cm、75cm,美国 Corning 公司);离心管(2mL、5mL、IOmL>5OmL,美国Corning公司)。检测不同浓度下绿原酸溶液导致类过敏反应的方法，包括以下步骤，(I)分别制备不同浓度的RBL-2H3细胞悬液和绿原酸溶液；(2)利用实时细胞分析仪对不同细胞浓度的RBL-2H3悬液中的细胞生长指数进行监测，确定实时细胞分析仪检测绿原酸溶液导致类过敏反应时使用的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度及添加绿原酸溶液溶液的最佳时间点；
(3)利用实时细胞分析仪检测添加绿原酸溶液前后的RBL-2H3细胞生长指数值，根据添加绿原酸溶液后RBL-2H3细胞生长指数值的变化情况，判断绿原酸溶液是否会导致类过敏反应。
步骤(I)中制备不同浓度的RBL-2H3细胞悬液时，RBL-2H3是从Wistar大鼠保持肿瘤状态的嗜碱性细胞中分离和克隆出来的嗜碱性白血病细胞株，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，利用现有的方法对RBL-2H3细胞培养，RBL-2H3细胞用的培养液是质量浓度为15%胎牛血清的DMEM培养液，用体积浓度为5%C02，温度为37°C的恒温培养箱中培养，制备RBL-2H3细胞悬液的具体步骤为选取在RBL-2H3细胞培养液中生长状态良好的RBL-2H3细胞，用质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA消化，加入RBL-2H3细胞培养液终止消化、吹打初步得到细胞悬液，再转移至离心管离心5min，离心后加入RBL-2H3细胞培养液并吹匀，此时得到的RBL-2H3细胞悬液中的细胞呈分散的单个细胞状态。根据加入的 RBL-2H3细胞培养液的量，分别制备RBL-2H3细胞浓度为5X 104、5X 105、2X 105、4X 105、 8X105、1.25X104,2.5X104,6.25X103 个/ml 的 RBL-2H3 细胞悬液。
所述不同浓度绿原酸溶液的配制方法是，将绿原酸粉末5mg用25mlDMEM培养液溶解，再用孔径为0.2 μ m的微孔滤膜过滤除菌得到200 μ g/ml绿原酸母液，用DMEM培养液将绿原酸母液稀释，得到100、50、25、12.5,6.25 μ g/ml的绿原酸溶液。
所述步骤(2)的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入ΙΟΟμ I的RBL-2H3细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中 C02的体积浓度为5%，温度为37°C;②设置信号采集频率为I次/min,测量实时细胞分析仪未有RBL-2H3细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准分别将 100 μ I不同细胞浓度的RBL-2H3细胞培悬液加入每个检测板板孔中的RBL-2H3细胞培养液中，设定信号采集频率为I次/15min，测量实时细胞分析仪有RBL-2H3细胞时培养液中的细胞生长指数；④分析比较不同浓度RBL-2H3细胞悬液的细胞生长指数曲线，选择RBL-2H3 细胞加入到RBL-2H3细胞培养液后最快经过潜伏期进入对数生长期，且当实时细胞分析仪检测到45h时RBL-2H3细胞仍能处于对数生长期对应的RBL-2H3细胞悬液浓度，即为实时细胞分析仪检测绿原酸溶液导致类过敏反应时使用的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度； ⑤分析④步确定的最佳细胞浓度的RBL-2H3细胞所对应的细胞生长指数曲线，当细胞生长指数为I的时间点，即为添加绿原酸溶液的最佳时间点。
上述步骤④分析比较不同浓度RBL-2H3细胞悬液的细胞生长指数曲线时，选择最佳浓度时是经过大量试验最终确定的，最后从2\105、4\105、5\105、8父105的中得到最佳的细胞浓度为2X IO5个/ml，当细胞生长指数为I的时间点一般是细胞在培养液中生长 20 28h时，从中选择最佳的时间点是23h时。
所述步骤(3)的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入ΙΟΟμ I的RBL-2H3细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中 C02的体积浓度为5%，温度为37°C，设置信号采集频率为I次/min,实时细胞分析仪检测未有RBL-2H3细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准将步骤(2) 确定的最佳细胞浓度的RBL-2H3细胞悬液100 μ I加入到每个检测板板孔的RBL-2H3细胞培养液中，设定信号采集频率为I次/15min，实时细胞分析仪对培养液中RBL-2H3的细胞生长指数进行监测；③待细胞生长到步骤(2)确定的最佳添加绿原酸溶液时间点 时，吸弃检测板板孔中的RBL-2H3细胞培养液，再向每个板孔中加入200 μ I不同浓度的绿原酸溶液，另设置2个板孔，添加200μ 1RBL-2H3细胞培养液，即为空白对照板孔；④设定信号采集频率为I次/min，实时细胞分析仪检测绿原酸溶液溶液中RBL-2H3细胞生长指数。监测结束后，将结果导入实时细胞分析仪Software 1.2.1中进行分析，提取数据用Origin 8.5作图，得到绿原酸溶液中RBL-2H3细胞的生长指数变化情况，见图2，由图可以看出，添加绿原酸溶液的RBL-2H3细胞生长指数值减低，说明绿原酸溶液会导致类过敏反应，并且绿原酸溶液的浓度越大，过敏反应越强。利用现有方法检查本发明方法的结果准确及可靠性，现有方法中利用肥大细胞脱颗粒对绿原酸溶液导致类过敏反应衡量，一般采取的方法是利用显微拍照观察细胞是否有大量肥大细胞脱颗粒。以下利用实时细胞分析仪检测Compound 48/80溶液和绿原酸溶液致类过敏时，选取空白对照、具有代表性的2个浓度(50 μ g/ml、20 μ g/ml)在不同时间点(24h、30h、36h )进行显微拍照。Compound 48/80是已知的诱导类过敏反应的药物，配制不同浓度的Compound48/80溶液:精密称取Compound 48/80粉末5mg，加入到50mlDMEM培养液中，完全溶解后用0.20 μπι微孔滤膜过滤除菌得到100 μ g/ml Compound 48/80母液，用培养液稀释母液得到以下6个浓度:50、40、30、20、10、5 μ g/ml ;得到不同质量浓度的Compound 48/80溶液后，利用实施例一中的检测绿原酸溶液导致类过敏反应的方法，检测不同浓度Compound48/80中RBL-2H3的细胞生长指数值，见图一，分析对比Compound 48/80溶液与绿原酸中的RBL-2H3细胞的细胞生长指数值，在前期未添加溶液时细胞都是处于快速增长期，当添加溶液后，细胞生长指数都开始下降，并且浓度值越高细胞生长指数值越小，说明绿原酸和已知的Compound 48/80溶液一样，都会导致类过敏反应。再根据显微镜的照片，可以看出绿原酸和Compound 48/80 一样，在它们溶液中的RBL-2H3细胞都具有肥大细胞脱颗粒，且浓度越高，脱颗粒越多。说明本发明方法利用细胞生长指数值作为衡量过敏反应的指标是准确，并且可重复进行。检测试验并不是在一个实施例中进行，为了确定本发明检测绿原酸类成分溶液导致类过敏反应的方法可靠、稳定，是经过无数次上述试验反复验证的，最终说明本发明方法利用细胞 生长指数值来衡量类过敏反应是完全可以实现的，并且带来了操作手法方便，仅利用实时细胞分析仪自动生成的图谱就可判断绿原酸类成分溶液是否会发生类过敏反应，对细胞生长状态实时监测，能够精确的确定类过敏强弱的浓度范围等具有实质性地有益效果。实施例二:本实施例列举的是监测不同浓度下异绿原酸A溶液中RBL-2H3细胞的生长指数值，所用的试验仪器同实施例一，异绿原酸A对照品(纯度大于98%)，购于成都曼斯特生物科技有限公司。检测不同浓度下异绿原酸A溶液导致类过敏反应的方法步骤为，包括以下步骤，包括以下步骤，(I)分别制备不同浓度的RBL-2H3细胞悬液和异绿原酸A溶液；(2)利用实时细胞分析仪对不同细胞浓度的RBL-2H3悬液中的细胞生长指数进行监测，确定实时细胞分析仪检测异绿原酸A溶液导致类过敏反应时使用的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度及添加异绿原酸A溶液最佳时间点；(3)利用实时细胞分析仪检测添加异绿原酸A溶液前后的RBL-2H3细胞生长指数值，根据添加异绿原酸A溶液后RBL-2H3细胞生长指数值的变化情况，判断异绿原酸A溶液是否会导致类过敏反应。步骤(I)中制备不同浓度的RBL-2H3细胞悬液时，RBL-2H3是从Wistar大鼠保持肿瘤状态的嗜碱性细胞中分离和克隆出来的嗜碱性白血病细胞株，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，利用现有的方法对RBL-2H3细胞培养，RBL-2H3细胞用的培养液是质量浓度为15%胎牛血清的DMEM培养液，用体积浓度为5%C02，温度为37°C的恒温培养箱中培养，制备RBL-2H3细胞悬液的具体步骤为选取在RBL-2H3细胞培养液中生长状态良好的RBL-2H3细胞，用质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA消化，加入RBL-2H3细胞培养液终止消化、吹打初步得到细胞悬液，再转移至离心管离心5min，离心后加入RBL-2H3细胞培养液并吹匀，此时得到的RBL-2H3细胞悬液中的细胞呈分散的单个细胞状态。根据加入的 RBL-2H3细胞培养液的量，分别制备RBL-2H3细胞浓度为5X 104、5X 105、2X 105、4X 105、 8X 105、1.25X104,2.5X104,6.25X103 个 /ml 的 RBL-2H3 细胞悬液。
所述不同浓度异绿原酸A溶液的配制方法是，将异绿原酸A粉末5mg用25mlDMEM 培养液溶解，再用孔径为0.2 μ m的微孔滤膜过滤除菌得到200 μ g/ml异绿原酸A母液，用 DMEM培养液将异绿原酸A母液稀释，得到100、50、25、12.5,6.25 μ g/ml的异绿原酸A溶液。
所述步骤(2)的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入ΙΟΟμ I的RBL-2H3细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中 C02的体积浓度为5%，温度为37°C;②设置信号采集频率为I次/min,测量实时细胞分析仪未有RBL-2H3细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准分别将 100 μ I不同细胞浓度的RBL-2H3细胞培悬液加入每个检测板板孔中的RBL-2H3细胞培养液中，设定信号采集频率为I次/15min，测量实时细胞分析仪有RBL-2H3细胞时培养液中的细胞生长指数；④分析比较不同浓度RBL-2H3细胞悬液的细胞生长指数曲线，选择RBL-2H3 细胞加入到RBL-2H3细胞培养液后最快经过潜伏期进入对数生长期，且当实时细胞分析仪检测到45h时RBL-2H3细胞仍能处于对数生长期对应的RBL-2H3细胞悬液浓度，即为实时细胞分析仪检测异绿原酸A导致类过敏反应时使用的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度；⑤分析④步确定的最佳细胞浓度的RBL-2H3细胞所对应的细胞生长指数曲线，当细胞生长指数为I的时间点，即为添加异绿原酸A溶液的最佳时间点。
上述步骤④分析比较不同浓度RBL-2H3细胞悬液的细胞生长指数曲线时，选择最佳浓度时是经过大量试验最终确定的，最后从2X 105、4X 105、5X 105、8X IO5的中得到最佳的细胞浓度为2X IO5个/ml，当细胞生长指数为I的时间点一般是细胞在培养液中生长 20 28h时，从中选择最佳的时间点是23h时。
所述步骤(3)的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入ΙΟΟμ I的RBL-2H3细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中 C02的体积浓度为5%，温度为37°C，设置信号采集频率为I次/min,实时细胞分析仪检测未有RBL-2H3细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准将步骤(2) 确定的最佳细胞浓度的RBL-2H3细胞悬液100 μ I加入到每个检测板板孔的RBL-2H3细胞培养液中，设定信号采集频率为I次/15min，实时细胞分析仪对培养液中RBL-2H3的细胞生长指数进行监测；③待细胞生长到步骤(2)确定的最佳添加异绿原酸A溶液的时间点时，吸弃检测板板孔中的RBL-2H3细胞培养液，再向每个板孔中加入200 μ I不同浓度的异绿原酸 Α,另设置2个板孔，添加200 μ 1RBL-2H3细胞培养液，即为空白对照板孔设定信号采集频率为I次/min，实时细胞分析仪检测异绿原酸A溶液中RBL-2H3细胞生长指数。
监测结束后，将结果导入实时细胞分析仪Software 1.2.1中进行分析，提取数据用Origin 8.5作图，得到异绿原酸A溶液中RBL-2H3细胞的生长指数变化情况，见图3，由图可以看出，添加异绿原酸A溶液的RBL-2H3细胞生长指数值减低，说明异绿原酸A溶液会导致类过敏反应，并且异绿原酸A溶液的浓度越大，过敏反应越强。利用DP型实时细胞分析仪监测异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸、新绿原酸类过敏反应，根据细胞生长指数变化情况判断是否发生类过敏反应的方法同上述几个实施例，本发明的方法还可用于检测同一浓度下、不同种类的绿原酸单体是否导致类过敏反应，还可用于评价不同浓度、不同种类的绿原酸单体导致类过敏反应，以上仅为说明发明内容所列举出的几个实施例而已，一切基于本发明实质内容所做出成份、数量等简单的变化，均应落在本发明的保护 范围内。
权利要求
1.一种检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤，(O分别制备不同浓度的RBL-2H3细胞悬液和绿原酸类成分溶液；(2)利用实时细胞分析仪对不同细胞浓度的RBL-2H3悬液中的细胞生长指数进行监测，确定实时细胞分析仪检测绿原酸类成分导致类过敏反应时使用的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度及添加绿原酸类成分溶液的最佳时间点；(3)利用实时细胞分析仪检测添加绿原酸类成分溶液前后的RBL-2H3细胞生长指数值，根据添加绿原酸类成分溶液后RBL-2H3细胞生长指数值的变化情况，判断绿原酸类成分是否会导致类过敏反应。
2.根据权利要求I所述的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，其特征在于，所述实时细胞分析仪为DP型实时细胞分析仪。
3.根据权利要求I所述的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，其特征在于，所述绿原酸类成分为绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸或新绿原酸。
4.根据权利要求I所述的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，其特征在于，所述不同浓度绿原酸类成分溶液的配制方法是，将绿原酸类成分用RBL-2H3细胞培养液超声溶解10 20min，再用孔径为O. 2 μ m的微孔滤膜过滤除菌得到绿原酸类成分母液，再用RBL-2H3细胞培养液将绿原酸类成分母液稀释，得到不同浓度的绿原酸类成分溶液。
5.根据权利要求4所述的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，其特征在于，所述RBL-2H3细胞培养液为质量浓度15%胎牛血清的DMEM培养液或质量浓度15%胎牛血清的MEM培养液。
6.根据权利要求I所述的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入 οομ I的RBL-2H3细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中C02的体积浓度为5%，温度为37°C;②设置信号采集频率为I次/min，测量实时细胞分析仪未有RBL-2H3细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准分别将100 μ I不同细胞浓度的RBL-2H3细胞悬液加入每个检测板板孔中的RBL-2H3细胞培养液中，设定信号采集频率为I次/15min，测量实时细胞分析仪有RBL-2H3细胞时培养液中的细胞生长指数；④分析比较不同浓度RBL-2H3细胞悬液的细胞生长指数曲线，选择RBL-2H3细胞加入到RBL-2H3细胞培养液后最快经过潜伏期进入对数生长期，且当实时细胞分析仪检测到45h时RBL-2H3细胞仍能处于对数生长期对应的RBL-2H3细胞悬液浓度，即为实时细胞分析仪检测绿原酸类成分导致类过敏反应时使用的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度分析④步确定的最佳细胞浓度的RBL-2H3细胞所对应的细胞生长指数曲线，当细胞生长指数为I的时间点，即为添加绿原酸类成分溶液的最佳时间点。
7.根据权利要求6所述的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，其特征在于，步骤④分析比较不同浓度RBL-2H3细胞悬液的细胞生长指数曲线时，不同浓度RBL-2H3细胞细胞悬液是RBL-2H3细胞浓度为2X 105、4X 105、5X 105、8X 105的细胞悬液，上述RBL-2H3浓度的单位为个/ml。
8.根据权利要求6或7所述的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，其特征在于，步骤④确定的用于实时细胞分析仪检测绿原酸类成分导致类过敏反应的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度为2X 105个/ml。
9.根据权利要求I所述的检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入ΙΟΟμ I 的RBL-2H3细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中C02的体积浓度为5%，温度为37°C，设置信号采集频率为I次/min，实时细胞分析仪检测未有RBL-2H3 细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准将步骤(2)确定的最佳细胞浓度的RBL-2H3细胞悬液100 μ I加入到每个检测板板孔的RBL-2H3细胞培养液中， 设定信号采集频率为I次/15min，实时细胞分析仪对培养液中RBL-2H3的细胞生长指数进行监测；③待细胞生长到步骤(2)确定的最佳添加绿原酸类成分溶液的时间点时，吸弃检测板板孔中的RBL-2H3细胞培养液，再向每个板孔中加入200 μ I不同浓度的绿原酸类成分溶液，另设置2个板孔，添加200 μ 1RBL-2H3细胞培养液，即为空白对照板孔；④设定信号采集频率为I次/min，实时细胞分析仪检测绿原酸类成分溶液中RBL-2H3细胞生长指数。
全文摘要
本发明公开的一种检测绿原酸类成分导致类过敏反应的方法，包括以下步骤，(1)分别制备不同浓度的RBL-2H3细胞悬液和绿原酸类成分溶液；(2)确定实时细胞分析仪检测绿原酸类成分导致类过敏反应时使用的RBL-2H3细胞悬液的最佳细胞浓度及添加绿原酸类成分溶液的最佳时间点；(3)利用实时细胞分析仪检测添加绿原酸类成分溶液前后的RBL-2H3细胞生长指数值。本发明的优点是，可实时反映RBL-2H3细胞在添加绿原酸类成分溶液前后经历的生长、伸展、形态变化、死亡生理状态，并且能够得出绿原酸类成分导致类过敏反应的溶液浓度范围。
文档编号C12Q1/02GK103255197SQ20131021062
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月31日 优先权日2013年5月31日
发明者鄢丹, 马丽娜, 张乐乐, 韩玉梅, 张毅, 肖小河 申请人:中国人民解放军第三0二医院