鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒，该试剂盒含有三对特异性引物。实验证明，应用本发明可检测DTMUV和所有亚型AIV并能进行H9亚型AIV分型检测，具有操作简便、敏感性高、特异性强等优点。本发明用于H9亚型禽流感病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭坦布苏病毒的混合感染的检测诊断，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
【专利说明】鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于PCR检测【技术领域】，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus, DTMUV)最早发现于中国的福建、浙江、江苏等东部沿海主要蛋鸭养殖区，是一种新兴的致病性黄病毒。DTMUV感染鸭后可导致蛋鸭产蛋量严重下降，产蛋率可从90%下降至10%以内，甚至绝产；感染雏鸭后可导致雏鸭出现站立不稳，倒地不起等神经症状，进而导致雏鸭淘汰率升高，严重的甚至高达80 %，因此给养鸭业带来了严重的经济损失。禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)属于正黏病毒科A型流感病毒属，AIV为单股负链RNA,由8个独立的RNA节段组成。AIV根据致病性的不同，可分为高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。HPAIV (如H5亚型)通常可引起感染鸭群的突然死亡和大量死亡；H9亚型AIV虽属LPAIV，但它分布广泛，能造成鸭的免疫抑制并引发与其他鸭病的混合感染，产蛋鸭感染后也可造成产蛋量的明显下降，极大影响了蛋鸭的经济效益，因此它对养鸭业的危害也不可忽视。
[0003]上述疾病都是极大危害养鸭业经济效益的鸭病毒性传染病，目前，对这两类病毒传统的检测方法主要有病毒分离、血清学试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，但这些方法存在耗时长、敏感性差、难标准化等局限性，尤其是当这两种病毒混合感染时，更增加了临床诊断的难度。因此，开发一种快速检测DTMUV和AIV且能同时进行H9亚型AIV分型检测的技术具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性高、特异性强、操作简便快速的鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物I和2 (检测DTMUV)、引物3和4 (检测AIV分型H9亚型)、引物5和6(检测AIV)，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.6的喊基序列。
[0006]引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为
0.5-1: 0.5-1: I: I: I: I。
[0007]引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为1:1:1:1:1:1。
[0008]上述鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测引物组在PCR扩增方面的应用，PCR扩增的退火温度为50.(TC -60.1°C。
[0009]PCR扩增的退火温度为53.(TC。
[0010]鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒，包括引物组、PCR缓冲液和水；
[0011]引物组包括三对特异性引物，分别是引物I和2、引物3和4、引物5和6，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.6的碱基序列，其浓度均为25 μ mol/mL,在PCR反应体系中的终浓度分别为 0.8 μ mol/mL-Ι.2 μ mol/mL、0.1 μ mol/mL-Ο.5 μ mol/mL、0.1 μ mol/ml-0.5 μ mol/mL ；
[0012]PCR 缓冲液为 2 X Taq PCR Mix。
[0013]引物I和2、引物3和4、引物5和6在PCR反应体系中的终浓度分别为0.8 μ mol/mL、0.2 μ mol/mL、0.4 μ mol/mL。
[0014]上述鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的应用，PCR扩增的退火温度为50.(TC -60.1°C。
[0015] PCR扩增的退火温度为53.(TC。
[0016]针对目前缺乏对DTMUV、所有亚型AIV和H9亚型AIV同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人结合多重PCR —管多检、高通量、低成本、高效率等优点，研究设计了三对特异性引物，据此建立了鸭坦布苏病毒和所有亚型禽流感病毒并能进行H9亚型AIV分型检测的多重PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明可检测DTMUV和所有亚型AIV并能进行H9亚型AIV分型检测，具有操作简便、敏感性高、特异性强等优点。本发明用于H9亚型禽流感病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭坦布苏病毒的混合感染的检测诊断，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是多重PCR的特异性试验结果电泳图，图中，M:100bp DNA ladder ；11:阴性对照(ddH20) ；1:H9AIV的cDNA+鸭坦布苏病毒的cDNA (等体积混合)；2:H9AIV的cDNA ；3:鸭坦布苏病毒的cDNA ；4:H5AIV的cDNA ；5:番鸭呼肠孤病毒的cDNA ；6:番鸭细小病毒的DNA ；7:鸭圆环病毒DNA ；8:鸭副粘病毒的cDNA ；9:鸭肝炎病毒的cDNA ；10:鸭瘟病毒的DNA。
[0018]图2是多重PCR的敏感性试验结果电泳图，图中，M:1OObp DNA ladder ；1:450ng/μ LDTMUV、760ng/y L H9、760ng/μ LM 基因的 cDNA ；2:45ng/y L DTMUV、76ng/μ L H9、76ng/μ LM 基因的 cDNA ；3:6.4.5ng/ μ L DTMUV,7.6ng/ μ L Η9、7.6ng/ μ LM 基因的 cDNA ；4:450pg/ μ L DTMUV、760pg/ μ L H9、760pg/ μ LM 基因的 cDNA ；5:45pg/ μ L DTMUV、76pg/ μ LH9、76pg/y LM 基因的 cDNA ；6:4.5pg/μ L DTMUV、7.6pg/y LH9、7.6pg/y LM 基因的 cDNA。
[0019]图3是应用本发明多重PCR的部分临床样品检测结果电泳图，图中，M为IOObp DNAladder ；1为阳性对照(H9亚型禽流感病毒cDNA+鸭坦布苏病毒cDNA) ；2~17为实验室采集的鸭病料。
【具体实施方式】
[0020]以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下:
[0021]鸭坦布苏病毒记载在“鸭坦布苏病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测方法的建立”，南方农业学报，2014，45 (2):314-317，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0022]鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所；
[0023]鸭肝炎病毒AV2111株(以下简称为DHV I)购自中国兽医药品监察所；
[0024]番鸭细小病毒记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18(6): 5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0025]鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010,37(11): 156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0026]鸭副粘病毒(鸭新城疫)记载在“鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立”，中国动物检疫，2012，29 (5):34-37，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0027]番鸭呼肠孤病毒记载在“番鸭花肝病病原的研究”，中国兽医科技，2003，5(33):
7-8，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0028]H5亚型禽流感病毒记载在“H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立”，南方农业学报，2013，02:323-327，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0029]H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0030]IOObp Marker ladder、2XTaq PCRMix(AS111-12)、DNA/RNA提取试剂盒、反转录试剂均购自北京全式金生物技术有限公司。
[0031]实施例1、引物的设计与合成
[0032]根据GenBank中H9AIV的HA基因、AIV的M基因与DTMUV的NS2基因的保守序列，采用DNAStar软件进行多序列比对,在保守区用primer5.0设计引物。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。(表1)。
[0033]表1引物信息
[0034]
【权利要求】
1.鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测引物组，其特征在于包括三对特异性引物，分别是引物I和2、引物3和4、引物5和6，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.6的喊基序列。
2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测引物组，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为0.5-1: 0.5-1: 1: 1: 1: 1。
3.根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测引物组，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为1:1:1:1:1:1。
4.权利要求2所述鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测引物组在PCR扩增方面的应用，其特征在于:所述PCR扩增的退火温度为50.(TC -60.1°C。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述PCR扩增的退火温度为53.(TC。
6.一种鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒，其特征在于包括引物组、PCR缓冲液和水； 所述引物组包括三对特异性引物，分别是引物I和2、引物3和4、引物5和6，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.6的碱基序列，其浓度均为25 μ mol/mL,在PCR反应体系中的终浓度分别为 0.8 μ mol/mL-Ι.2 μ mol/mL、0.1 μ mol/mL-Ο.5 μ mol/mL、0.1 μ mol/ml-0.5 μ mol/mL ； 所述PCR缓冲液为2 X Taq PCR Mix。
7.根据权利要求6所述鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒，其特征在于:所述引物I和2、引物3和4、引物5和6在PCR反应体系中的终浓度分别为0.8 μ mol/mL、0.2 μ mol/mL、0.4 μ mol/mL。
8.权利要求7所述鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的应用，其特征在于:所述PCR扩增的退火温度为50.(TC -60.1°C。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述PCR扩增的退火温度为53.(TC。
【文档编号】C12N15/11GK103993105SQ201410263718
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】谢芝勋, 赵虹, 谢丽基, 刘加波, 罗思思, 谢志勤, 黄娇玲, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所