一种块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种食用菌块菌液体发酵工艺，属于生物工程【技术领域】。所述工艺解决了人工栽培菌块周期长、成本高等问题，其具体步骤：将块菌菌种接种于PDA培养基在22-27℃下培养5-10天；然后转接入装有液体培养基的三角瓶，置于转速100-180r/min的摇床中培养5-8天得液体菌种，温度为22-27℃；将液体菌种接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养得到块菌菌丝体，发酵条件：搅拌速度200r/min，溶氧50％，pH值6.0-8.0，温度22-27℃，时间5-8天，块菌菌丝体经提取制得块菌多糖。所述工艺降低了生产成本，通过特定的培养基，显著提高块菌胞外和胞内多糖的产量，有利于工业化发酵生产。
【专利说明】一种块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种食用菌块菌液体发酵工艺，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]块菌与鱼子酱、鹅肝酱，在欧美被称为三大珍品，在欧洲国家领袖在国际交往中是非常流行的食品，是世界公认的顶级食品。块菌的子囊果呈球形、半球形或块状，直径一般在1.5-12厘米，成熟后为褐色、红褐色至深褐色，基部常凹陷，表面布以大小不一的小疣。块菌富含17种氨基酸、8种维生素、适量的蛋白质、以及雄性酮、留醇、鞘脂、脂肪酸、氨基酸及微量元素等50余种生理活性成分，据研究，块菌多糖作为一个新的真菌多糖，毒性低、水溶性好、抑制肿瘤作用明显，是抗肿瘤免疫疗法的药物。
[0003]块菌作为一种生长于地下的药食两用真菌，在自然界中要求生长于碱性土壤、气候温和的环境，同时与橡树、栎树等树种的根系共生，苛刻的生长条件直接导致了其天然产量的供不应求。为了弥补块菌天然产量的不足有不少学者进行了半人工模拟栽培的研究，但是人工栽培存在周期长，一般需要7-9年，需要耗费大量的人力和物理，成本高，且受环境条件影响大，在一定程度上限制了对其开发利用，而采用液体发酵技术是目前深度开发食用菌活性成分的有效方法，并已成功在灵芝、香菇等珍稀食药用菌实现规模化生产，但是目前块菌液体发酵的研究报道较少。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种发酵成本低，菌丝生产效率高的块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺。
[0005]本发明上述的目的通过如下技术方案实现:一种块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺，所述的工艺包括如下步骤:
[0006]S1、斜面菌种活化培养:将块菌菌种接种于PDA培养基上,进行斜面菌种的培养，培养温度22-27°C，培养时间5-10天；
[0007]S2、液体菌种的制备:挑取步骤SI中活化好的斜面菌种，将其转接入装有液体培养基的三角瓶中，置于摇床中培养制得液体菌种，培养条件为:温度为22_27°C，摇床转速为100-180r/min，培养时间为5_8天；所述液体培养基的组成成分为:葡萄糖:15_25g/L，酵母:1.5-2.5g/L，麦芽提取物:2.5-7.5g/L, KH2PO4:0.5-1.5g/L, MgSO4.7H20:0.25-0.75g/L，维生素BI:100 μ g/L,余量为蒸懼水，pH值为6.0-8.0 ；
[0008]S3、液体发酵培养:将步骤S2中制得的液体菌种接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养得到块菌菌丝体，经提取制得块菌多糖；其中，发酵条件为:搅拌速度为200r/min，溶氧为50%，pH值为6.0-8.0，温度22_27°C，时间5_8天；所述发酵培养基的组成成分为:葡萄糖:15-25g/L，麦芽提取物:2.5-7.5g/L，KH2PO4:0.5-1.5g/L, MgSO4.7H20:0.25-0.75g/L，水解乳蛋白:25-35g/L，维生素B1: 100 μ g/L，余量为蒸馏水。
[0009]在本发明块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺步骤S2中若摇床转速太慢，培养基中的溶解氧就不足，很快就会影响菌丝生长。若培养时间太短，菌丝还没生长，块菌多糖的产量极低，而培养时间太长培养基营养不够，菌丝容易自溶，反而影响最终块菌多糖的收率。而培养的温度、PH太高或太低都会抑制菌丝的生长，从而影响块菌多糖的收率。
[0010]步骤S3中的溶氧、pH值、发酵温度、发酵时间都直接影响着块菌的生长，过高或者过低都会降低最终产物的收率，因此，本发明块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺中将步骤S3中的发酵条件严格控制为搅拌速度200r/min，溶氧50%，pH值6.0-8.0，温度22_27°C，时间5-8天。
[0011]作为优选，在上述块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺中，步骤SI中所述的块菌菌种为印度块菌(TuberIndicum)、台湾原生块菌(TuberFormosanum)、意大利白块菌(TuberMagnatum)、法国黑抱块菌(TuberMelanosporum)、假凹陷块菌(TuberPseudoexcavatum)中的一种或多种。这些块菌菌种均可通过商业途径购买得到。
[0012]作为优选，在上述块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺中，步骤S2中所述的液体培养基的组成成分为:葡萄糖:20g/L，酵母:2.0g/L，麦芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L,MgSO4.7H20:0.5g/L，维生素 B1: 100 μ g/L，余量为蒸馏水。 [0013]作为优选，在上述块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺中，步骤S3中所述的发酵培养基的组成成分为:葡萄糖:20g/L,麦芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L, MgSO4.7H20:
0.5g/L，维生素BI dOOyg/L，水解乳蛋白:30g/L，余量为蒸馏水。
[0014]作为优选，在上述块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺中，步骤S3中所述的接种量为 200-800mg/L。
[0015]作为参考:所述的PDA琼脂培养基为:MgS04.7H20:0.15g/L，KH2PO4:0.30g/L,葡萄糖:20g/L，维生素BI:0.05g/L，土豆:200g/L。所述PDA琼脂培养基可通过商业途径购买得到。
[0016]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0017](I)、本发明避免了从价格昂贵的块菌子实体中提取多糖过程中原料有限等不利因素，大大降低了生产成本。
[0018](2)、本发明通过特定的培养基，有效促进细胞生长，提高生物量，显著提高块菌胞外和胞内多糖的产量，可达2.5g/L，有利于工业化发酵生产。
【具体实施方式】
[0019]以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0020]实施例1
[0021]斜面菌种活化培养:将块菌菌种接种于PDA培养基上,进行斜面菌种的培养,培养温度23°C，培养时间7天；
[0022]液体菌种的制备:挑取上述活化好的斜面菌种，将其转接入装有液体培养基的三角瓶中，置于摇床中培养制得液体菌种，培养条件为:温度为23°C，摇床转速为120r/min，培养时间为6天；所述液体培养基的组成成分为:葡萄糖:20g/L，酵母:2.0g/L，麦芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L, MgSO4.7H20:0.50g/L，维生素 B1: 100 μ g/L，余量为蒸馏水，pH值为 6.0-8.0 ；[0023]液体发酵培养:将上述制得的液体菌种接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养得到块菌菌丝体，初始接种量为500mg/L，发酵条件为:搅拌速度为200r/min，溶氧为50%，初始pH值为6.0，温度23°C，时间7天；所述发酵培养基的组成成分为:葡萄糖:20g/L，麦芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L, MgSO4.7H20:0.50g/L，水解乳蛋白:30g/L，维生素BI: 100 μ g/L,余量为蒸懼水；
[0024]将上述制得的块菌菌丝体在50°C下干燥至恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85%的乙醇在60°C下浸提30min，重复两次，去除单糖、双糖、低聚糖等干扰成分，再于沸水浴中浸提lh, 5000r/min离心15min,取上清液定容至100mL,浓硫酸-苯酹法测定多糖含量为2.6g/L。
[0025]实施例2
[0026]斜面菌种活化培养:将块菌菌种接种于PDA培养基上,进行斜面菌种的培养,培养温度25°C，培养时间6天；
[0027]液体菌种的制备:挑取上述活化好的斜面菌种，将其转接入装有液体培养基的三角瓶中，置于摇床中培养制得液体菌种，培养条件为:温度为24°C，摇床转速为120r/min，培养时间为5天；所述液体培养基的组成成分为:葡萄糖:25g/L，酵母:1.8g/L，麦芽提取物:3.0g/L, KH2PO4:1.2g/L，MgSO4.7H20:0.60g/L，维生素 B1: 100 μ g/L，余量为蒸馏水，pH值为 6.0-8.0 ；
[0028]液体发酵培养:将上述制得的液体菌种接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养得到块菌菌丝体，初始接种量为500mg/L，发酵条件为:搅拌速度为200r/min，溶氧为50%，初始pH值为6.0，温度24°C，时间5天；所述发酵培养基的组成成分为:葡萄糖:25g/L，麦芽提取物:3.0g/L, KH2PO4:1.2g/L, MgSO4.7H20:0.60g/L，水解乳蛋白:28g/L，维生素BI: 100 μ g/L,余量为蒸懼水；
[0029]将上述制得的块菌菌丝体在50°C下干燥至恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85%的乙醇在60°C下浸提30min，重复两次，去除单糖、双糖、低聚糖等干扰成分，再于沸水浴中浸提lh, 5000r/min离心15min,取上清液定容至IOOmL,浓硫酸-苯酹法测定多糖含量为2.4g/L。
[0030]实施例3
[0031]斜面菌种活化培养:将块菌菌种接种于PDA培养基上,进行斜面菌种的培养,培养温度22°C，培养时间8天；
[0032]液体菌种的制备:挑取上述活化好的斜面菌种，将其转接入装有液体培养基的三角瓶中，置于摇床中培养制得液体菌种，培养条件为:温度为26°C，摇床转速为170r/min，培养时间为7天；所述液体培养基的组成成分为:葡萄糖:18g/L，酵母:2.3g/L，麦芽提取物:6.0g/L, KH2PO4:0.7g/L，MgSO4.7H20:0.30g/L，维生素 B1: 100 μ g/L，余量为蒸馏水，pH值为 6.0-8.0 ；
[0033]液体发酵培养:将上述制得的液体菌种接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养得到块菌菌丝体，初始接种量为500mg/L，发酵条件为:搅拌速度为200r/min，溶氧为50%，初始pH值为7.0，温度26°C，时间6天；所述发酵培养基的组成成分为:葡萄糖:15g/L，麦芽提取物:5.5g/L, KH2PO4:0.8g/L, MgSO4.7H20:0.30g/L，水解乳蛋白:32g/L，维生素BI: 100 μ g/L,余量为蒸懼水；[0034]将上述制得的块菌菌丝体在50°C下干燥至恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85%的乙醇在60°C下浸提30min，重复两次，去除单糖、双糖、低聚糖等干扰成分，再于沸水浴中浸提lh, 5000r/min离心15min,取上清液定容至100mL,浓硫酸-苯酹法测定多糖含量为2.5g/L。
[0035]现有技术中液体深层发酵生产块菌多糖的制备方法制得的多糖含量一般为0.91-1.60g/L，可见通过本发明块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺明显提高了多糖的产量,并大大降低了生产成本,有利于工业化发酵生产。
[0036]本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属【技术领域】的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
[0037]尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
【权利要求】
1.一种块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤: 51、斜面菌种活化培养:将块菌菌种接种于PDA培养基上，进行斜面菌种的培养，培养温度22-27°C，培养时间5-10天； 52、液体菌种的制备:挑取步骤SI中活化好的斜面菌种，将其转接入装有液体培养基的三角瓶中，置于摇床中培养制得液体菌种，培养条件为:温度为22-27°C，摇床转速为100-180r/min，培养时间为5_8天；所述液体培养基的组成成分为:葡萄糖:15_25g/L，酵母:1.5-2.5g/L，麦芽提取物:2.5-7.5g/L, KH2PO4:0.5-1.5g/L, MgSO4.7H20:0.25-0.75g/L，维生素BI:100 μ g/L,余量为蒸懼水，pH值为6.0-8.0 ； 53、液体发酵培养:将步骤S2中制得的液体菌种接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养得到块菌菌丝体，经提取制得块菌多糖；其中，发酵条件为:搅拌速度为200r/min，溶氧为50%，pH值为6.0-8.0，温度22_27°C，时间5_8天；所述发酵培养基的组成成分为:葡萄糖:15-25g/L,麦芽提取物:2.5-7.5g/L，KH2PO4:0.5-1.5g/L, MgSO4.7H20:0.25-0.75g/L，水解乳蛋白:25-35g/L，维生素B1: 100 μ g/L，余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺，其特征在于，步骤SI中所述的块菌菌种为印度块菌(Tuber Indicum)、台湾原生块菌(TuberFormosanum)、意大利白块菌(TuberMagnatum)、法国黑孢块菌(TuberMelanosporum)、假凹陷块菌(TuberPseudoexcavatum)中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺，其特征在于，步骤S2中所述的液体培养基的组成成分为:葡萄糖:20g/L，酵母:2.0g/L，麦芽提取物:5.0g/L，KH2PO4:1.0g/L, MgSO4.7H20:0.5g/L，维生素 B1: 100 μ g/L，余量为蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺，其特征在于，步骤S3中所述的发酵培养基的组成成分为:葡萄糖:20g/L，麦芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L,MgSO4.7H20:0.5g/L，维生素B1:100 μ g/L，水解乳蛋白:30g/L，余量为蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的块菌液体发酵生产块菌多糖的工艺，其特征在于，步骤S3中所述的接种量为200-800mg/L。
【文档编号】C12P19/04GK104017841SQ201410263701
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】杜孟浩, 张金萍, 胡立松 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所