一种犬源单链抗体及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体公开了一种犬源单链抗体及其构建方法和应用。本发明通过设计犬抗体可变区简并引物，成功扩增出犬的重链可变区VH和轻链可变区VL基因。在此基础上利用噬菌体展示技术，成功构建犬源单链抗体scFv文库。所构建的scFv单链抗体库具有多样性和足够大的库容量。本发明通过Dot-ELISA方法用犬DEA1.1血型抗原从scFv单链抗体库中筛选到3株能够与犬DEA1.1血型抗原相结合的单链抗体。其中Clone16具有较强的结合特性。根据Clone16基因构建了pET-32a-Clone16重组蛋白进行原核表达，纯化得到的抗体具有结合活性。为制备犬DEA1.1血型鉴定试剂提供了坚实的基础。
【专利说明】一种犬源单链抗体及其构建方法和应用【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，更具体地，涉及一种犬源单链抗体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]传统的抗体制备，包括杂交瘤一单克隆抗体技术，均需首先用抗原对机体进行免疫，所获抗体的性能取决于体内免疫的有效性。因此弱抗原、自身抗原、具有毒性的抗原的抗体以及人源性抗体的制备均比较困难。90年代发展起来的噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的重大进展，它已成为人源单抗研制的重要途径。噬菌体抗体库技术模拟了体内抗体生成过程，为不经免疫制备抗体提供了可能，已渐成为制备人源抗体的重要手段之一。 [0003]血型是以血液抗原形式表现出来的一种遗传形状。血型系统是根据红细胞膜上抗原种类不同而对血液进行分型的体系。目前已经发现的犬血型系统超过12个，每个血型系统采用DEA+数字方法进行命名。目前经国际确认的血型有8种，分别为DEA1.1、DEA1.2、DEA3、DEA4、DEA5、DEA6、DEA7和DEA8。由于犬血型抗原的信息都是未知的，现在还不能通过基因表达、生物合成和抗原纯化的方法得到较大量的犬血型抗原。用常规通过杂交瘤的方法制备单克隆抗体的方法制备犬血型单克隆抗体非常困难，会因为抗原不纯产生较多的其他红细胞抗原的抗体，给特异性抗体的制备和筛选提出了较大的挑战。但在犬之间互相免疫犬红细胞的方法就可以避免大量的非血型抗原的影响。产生的多克隆抗血清较多的是针对于犬血型的。同时，噬菌体展示技术可以通过免疫后动物的外周血淋巴细胞提取抗体基因信息。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中针对犬血型抗原的抗体研究技术的不足，提供一种犬源单链抗体。
[0005]本发明的第二个目的是提供一种用于构建犬源单链抗体库的引物组。
[0006]本发明的第三个目的是提供一种犬源单链抗体库。
[0007]本发明的第四个目的是提供所述犬源单链抗体库的构建方法。
[0008]本发明的第五个目的是提供所述引物组或犬源单链抗体或单链抗体库在制备犬血型鉴定试剂中的应用。
[0009]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种犬源单链抗体Clone 16,其特征在于,所述抗体的scFv序列长870bp,序列如SEQIDNO:48所示；其中重链可变区VH长435bp，序列如SEQ IDNO:49所示；轻链可变区VK长390bp，序列如SEQ ID NO:50所示；连接肽序列长45bp，序列如SEQ ID NO:51所示。
[0010]所述犬源单链抗体Clone 16的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示。
[0011]提供一种用于扩增所述单链抗体Clone 16基因序列的引物，序列如SEQ ID NO:53~54所示。[0012]提供用于构建犬源单链抗体库的引物组，包括抗体重链可变区引物、轻链可变区引物和连接肽序列引物，其引物序列如SEQ ID NO:1~47所示。
[0013]提供一种犬源单链抗体库，所述抗体库含有犬血型抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，及中间连接区linker序列(Gly4Ser) 3，有完整的抗原结合部位，以pCANTAB_5E为载体，库容量达到7X105。
[0014]提供所述犬源单链抗体库的构建方法，包括以下步骤:
51.总RNA提取和cDNA的合成:取免疫后的犬外周血，分离淋巴细胞，提取总RNA，经逆转录PCR逆转录为cDNA ；
52.PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因:根据犬抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1~33所示；以SI获得的cDNA为模板，扩增可变区基因VH和VL ； 53.单链抗体scFv基因的扩增:设计含连接肽序列Iinker和5>77、AfoiJ酶切位点的引物，由S2获得的重链VH和轻链VL可变区基因的基础上再经扩增获得scFv基因；
54.单链抗体scFv库的构建:双酶切scFv基因片段，并插入pACNTAB-5E构建重组质粒，转化感受态万.coli TGl,获得初步的单链抗体库,经反复淘筛,获得犬源单链抗体库。
[0015]本发明利用Amerhsma公司的pCANATB_5E载体将scFv抗体展示于g3蛋白上。所以大部分表达蛋白会发生通读，表达scFV-g3融合蛋白，并通过噬菌体的组装展示于噬菌体衣壳上。
[0016]构建噬菌体抗体库的细胞来源一般有三个方面:杂交瘤细胞,免疫机体致敏B淋巴细胞，非致敏B淋巴细胞。其中非致敏B淋巴细胞，即经自然免疫的患者B淋巴细胞是目的抗体基因的良好来源。因为自然免疫的人体内淋巴细胞经过抗原压力选择和亲和力成熟，其目的抗体基因的mRNA丰度相对较高，有利于所建文库的筛选，并利于克隆出高亲和力的抗体(Ichiyoshi et al., 1995 ；Kasaian et al., 1994)。因此,本研究选用犬DEAL I 血型抗原红细胞为免疫源，免疫DEA1.1阴性的犬。这样可以最大可能降低犬红细胞上的其他非血型抗原物质参加免疫刺激犬免疫系统。并希望由此构建的抗犬DEA1.1血型抗体库能尽量反映出这犬体内血型抗体的真实状态。
[0017]优选地，SI所述免疫后的犬的免疫方法为:选用犬DEA1.1血型抗原红细胞为免疫源，免疫DEA1.1阴性的犬。本发明中，选择经犬DEA1.1血型抗原免疫的犬外周血淋巴细胞来构建抗体基因库，有利于增加抗体库的针对性。将犬外周血淋巴细胞mRNA反转录成cDNA的时候，本发明选用的是Oligo dT18进行反转录，由于此引物需要反转录出mRNA的全长才有效，因此对外周血总mRNA的提取要求较高。
[0018]虽然设计扩增小鼠、人、兔、鸡和其他物种的抗体可变区VH和VL基因的简并引物都已经报道(Chiang et al., 1989 ；Co1ma et al., 1991 ；Orlandi et al., 1989 ；ffang etal.，2000)，但至今还没有关于犬抗体可变区基因简并引物报道。抗体可变区(V区)是由4个骨架区(FR)与3个CDR区相间隔而构成的，即呈(N端)“FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4”(C端)排列。而相对来说，骨架区FR编码序列相对保守。因此，设计出分别针对抗体可变区基因上、下游相对保守DNA碱基序列的引物，就有可能通过PCR得到全套的抗体可变区序列。本发明设计并验证了 VH和VL基因两套不同的简并引物，每条引物分别与犬抗体重轻链可变区的末端序列匹配。为了增加抗体基因的多样性，本发明把所有设计的引物进行两两随机组合，分别扩增抗体基因片段。避免了由于引物对之间相互抑制或基因模板拷贝较低的情况。通过PCR扩增可分别扩增出大约430bp的VH和390bp的VL基因。
[0019]本研究采用传统的三片段SOE-PCR法组装VH、VL和linker。VH和VL经含有编码(Gly4Ser) 3序列的Linker组装成scFv Linker全长45bp,两端分别与VH基因3’末端和VL基因5’末端序列匹配，中间45bp编码(Gly4Ser) 3连接肚。VH和VL基因片段的等量加入，是有效进行组装和PCR扩增的关键。PCR扩增组装scFv时，在sFcv的5’和3’末端分别引入了 Sfil、NotI酶切位点，通过这两个酶切位点将scFv基因插入pCANATB-5E载体中。SfiU NotI酶切位点在抗体基因中出现的频率很低，在构建抗体库时能保证大部分scFv基因能被正确克隆。
[0020]优选地，S3所述连接肽序列linker和Sfil、NotI酶切位点的引物序列如SEQ IDNO:34~47所示。 [0021]噬菌体抗体库筛选方法有很多，包括纯抗原筛选、非纯抗原筛选、功能性筛选、选择性感染筛选等。非纯抗原筛选包括细胞表面筛选、组织筛选、动物活体内筛选等。对于无法提纯或抗原性质不确定的抗原，传统的固相化和液相化筛选方法存在很多局限性。本研究采用自己构建的Dot-ELISA方法，把犬DEA1.1血型抗原固定到硝酸纤维素膜上，用固相化抗原的方法，进行抗体的筛选。众所周知，犬红细胞细胞表面原性质不确定的。其表面不但含有血型相关特异性抗原，同时也含有大量的非特异性抗原，如蛋白、糖类和脂类等。由于噬菌体抗体容易与这些非特异性抗原结合，利用单一的犬DEA1.1阳性细胞进行筛选时，有可能筛选到大量的非特异性抗体。同时使少数表面表达高特异性抗体的噬菌体丢失，筛选效率较低。本研究中，利用犬DEA1.1阴性的犬红细胞对抗体库进行负性筛选和犬DEA1.1血型阳性抗原进行阳性筛选，使筛选效率大大提高。
[0022]优选地，S4所述淘筛的方法为:以犬血型抗原阳性和阴性红细胞膜，固化到硝酸纤维素膜上，对单链抗体scFv库进行“粘附-洗脱-扩增”的筛选；每轮筛选后对扩增的噬菌体进行滴度测定，检测特异性噬菌体的富集结果。
[0023]噬菌体抗体经过连续的“吸附一洗脱一扩增”过程噬菌体的投入/产出比例不断提高，这样就可获得与犬DEA1.1血型抗原结合较紧密的噬菌体克隆。在PCANATB-5E载体中，scFv基因插于g3信号肽与g3蛋白之间，3’末端加上E-Tag标签,并通过I个琥拍酸终止密码子与g3基因相连。TGl菌株表达C末端带有E-Tag标签，通过抗E-Tag抗体作一抗，验证噬菌体抗体的结合活性。从第3轮筛选后得到的细菌菌落中随机挑选100个克隆进行Dot-ELISA活性鉴定，确定筛选出抗犬DEA1.1血型的噬菌体。经基因测序合并重复的抗体基因，实验筛选出3株抗犬DEA1.1血型抗原的阳性克隆，经ELISA方法验证，Clonel6能够很好的结合犬DEA1.1血型抗原，并具有很高的亲和力。本发明选用载体pET-32a构建重组蛋白质粒pET-32a-Clonel6，在克隆位点下游有一个His-Tag标签，有利于Clonel6的高表达和抗体纯化。经验证和分析，构建的重组蛋白可以很好的可溶性表达。纯化的Cloneie单链抗体蛋白用Dot-ELISA方法进行临床样本验证，具有很好的结合活性。
[0024]提供所述引物组在制备犬血型鉴定试剂中的应用。
[0025]提供所述单链抗体在制备犬血型鉴定试剂中的应用。
[0026]提供所述单链抗体库在制备犬血型鉴定试剂中的应用。
[0027]与现有技术相比，本发明的有益效果:本发明基于犬DEAL I血型抗原得不到纯化抗原的前提下，用DEAL I阳性犬红细胞作为免疫原免疫DEA1.1阴性的犬，经多次免疫得到良好的的免疫效果，并获得大量的抗犬DEA1.1血型多克隆抗血清。
[0028]本发明成功构建犬的简并引物，通过所述简并引物成功建立了犬源噬菌体展示抗体库，经过鉴定发现，所设计的引物可以扩增出多样化单链抗体scFv基因组合。通过文库库容量计算，本研究所建立的犬DEA1.1血型抗原免疫库库容量大于7 X 105，可以认为是一个足够大的免疫库。经过随机挑选测序得到的序列表明，所构建的犬单链抗体库具有多样性。
[0029]本发明以Dot-ELISA方法为基础，把犬DEA1.1血型抗原固定到硝酸纤维素膜上，并用噬菌体抗体免疫库进行3轮筛，最终筛选到3株能够与犬DEA1.1血型抗原相结合的单链抗体。临床样本验证得Clonel6具有较强的结合特性。根据Clonel6基因构建了 pET-32a-Clonel6重组蛋白进行原核表达，纯化得到的抗体具有结合活性。为制备犬DEA1.1血型鉴定试剂提供了坚实的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为犬源VH、Vk和Va PCR扩增凝胶电泳图；
图2为重链可变区引物对扩增结果；1~7上游引物为JHl-2，8~14上游引物为JH3 ； 图3为轻链可变区kappa引物对扩增验证；1~9分别为kappa For I~9引物组合扩
增；
图4为轻链可变区lambda引物对扩增验证；(A):1~8为JLl和VLl~8 ;9~17为JL2 和 VLl ~8 ; (B)I ~8 为 JL3 和 VLl ~8 ;9 ~17 为 JL4 和 VLl ~8 ; (C):l ~8 为 JL5和VLl~8 ;9~13为JLl~5和VL9 ；
图5为犬源scFv的融合PCR扩增凝胶电泳图；
图6为scFv噬菌体库质粒酶切鉴定；
图7为噬菌体scFv库的淘选Dot-ELISA鉴定；
图8为抗犬DEA1.1血型抗原犬源scFv基因氨基酸序列；
图9为Clonel6基因克隆与鉴定；M =Marker DL2000 ；1:阳性Clonel6菌液PCR鉴定；2-3:pET-32a-Clonel6阳性菌PCR鉴定；4:阴性对照；
图10为重组质粒pET-32a-Clonel6双酶切鉴定；
图11为不同时间IPTG诱导融合蛋白表达的SDS-PAGE结果；M:蛋白质分子质量标准；1:载体pET-32a诱导前；2:载体pET_32a诱导后6h ；3重组质粒pET-32a_Clonel6诱导前；4:重组质粒pET-32a-Clonel6诱导后Ih ；5:重组质粒pET-32a_Clonel6诱导后2h ；6:重组质粒pET-32a-Clonel6诱导后3h ；7:重组质粒pET-32a_Clonel6诱导后4h ；8:重组质粒pET-32a-Clonel6 诱导后 5h ；9:重组质粒 pET-32a_Clonel6 诱导后 6h ；
图12为重组蛋白可溶性分析；M:蛋白分子量标准；1:PET-32a-Cl0nel6诱导后4h裂解沉淀；2:pET-32a-Clonel6诱导后4h裂解上清；
图13为Clonel6单链抗体Western-Blot鉴定结果；M:蛋白Marker ；1:裂解沉淀；2:裂解上清；2:阴性对照；
图14为单链抗体Clonel6临床样本Dot-ELISA活性分析；图15为单链抗体Cloneie基因序列及氨基酸序列对应图谱；
图16为单链抗体Clonel基因序列及氨基酸序列对应图谱；
图17为单链抗体Clone5基因序列及氨基酸序列对应图谱。
【具体实施方式】
[0031]下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，【具体实施方式】中所用的分子克隆技术均为本领域公开充分的常规技术，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
[0032]实施例1 scFv基因的扩增 (I)犬外周血淋巴细胞的分离 用犬DEA1.1阳性抗原红细胞免疫DEA1.1阴性犬，每次经腹腔和静脉免疫5%红细胞5ml，经过5次免疫后采集犬外周血，取新鲜抗凝全血，EDTA (枸橼酸钠或肝素)抗凝剂均可。用等体积PBS或0.9% NaCl (生理盐水)稀释全血。在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。分离液、抗凝未经稀释全血、PBS (或生理盐水)体积比为1:1:1。室温，水平转子700~800g (2000~2500rpm)离心20~30min。离心结束后，离心管管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层薄且较致密的白膜，为单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层。小心吸取白膜层到另一离心管中。用PBS稀释到一定体积，颠倒混匀。室温，水平转子250g (1000rpm),离心10min,弃上清。重复洗漆I~2次。
[0033](2)犬淋巴细胞总RNA提取
将分离得到的犬淋巴细胞进行细胞计数，分装约为IO7每管放入1.5mL离心管中，向管中加入750 μ L Trizol Ls Reagent直接裂解细胞，剧烈颠倒振荡，室温静置5min ;加入200 μ L氯仿，室温下混匀后静置I~2min，接着在2~8°C下，10000r/min离心15min，而后取出离心管小心吸取上清液500 μ L加入另一新的DEPC (焦炭酸二乙酯)处理过的1.5mL离心管中，并向此管加入500 μ L异丙醇(上清液与异丙醇等比例混合)并混匀；然后在2~8°C下，12000g离心10min，取出离心管小心倾倒掉上清液，接着加入1000 μ L 75%乙醇，而后在2~8°C下8000g离心5min，取出离心管小心倒掉上清液，倒置离心管于滤纸上使其在室温下充分干燥；最后加入11.5 μ L DEPC处理水，得到犬淋巴细胞总RNA，直接进行反转录或者_20°C冻存备用。
[0034](3 )第一链 cDNA 合成
将下列试剂加到一个无菌 Eppendorf 管中:1 μ L Oligo (dT) 18(0.5 μ g/ μ L)、10 μ L 总RNA、I μ LDEPC水，总体积为12 μ L。70°C、5min反应后立即置于冰上。加入下列试剂:4μ L5Xbuffer (第一链)、1 μ L RNase 抑制剂、I μ L IOmM dNTP。轻柔混匀，37°C孵育 5min。加入I μ L逆转录酶，用移液器轻柔上下混匀，避免产生气泡。42°C孵育60min，70°C、IOmin终止反应，放置冰上。产物可以用于第二链合成或保存于_20°C。
[0035]提取的犬外周血淋巴细胞总RNA经琼脂糖凝胶电泳可见，18s RNA和25s RNA两条条带清晰可见，说明所得的总RNA完整性良好。经随机引物Oligo (dT) 18反转录成第一链cDNA后，用重链可变区引物验证基因是否可用。如图1所示，根据重链引物进行扩增，能很扩增出430bp片段，轻链可变区引物可以扩增出390bp片段，说明提取的RNA可以进行下一步实验。
[0036](4)引物设计
根据犬已发表的抗体基因序列，将序列分类，分别在保守区域设计扩增抗体重链可变区基因引物和轻链可变区基因引物。按照轻重链引物设计含有酶切位点和linker序列的引物(表1、2)。引物列表如下:
表1犬源重链和轻链抗体可变区引物
【权利要求】
1.一种犬源单链抗体Clone 16,其特征在于,所述抗体的scFv序列长870bp,序列如SEQ IDNO:48所示；其中重链可变区VH长435bp，序列如SEQ IDNO:49所示；轻链可变区VK长390bp，序列如SEQ ID NO:50所示；连接肽序列长45bp，序列如SEQ ID NO:51所示。
2.根据权利要求1所述犬源单链抗体Clone16，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:52所示。
3.一种用于扩增权利要求1所述单链抗体Clone 16基因序列的引物，其特征在于，序列如SEQ ID NO:53~54所示。
4.用于构建犬源单链抗体库的引物组，其特征在于，包括抗体重链可变区引物、轻链可变区引物和连接肽序列引物，其引物序列如SEQ ID NO:1~47所示。
5.一种犬源单链抗体库，其特征在于，所述抗体库含有犬血型抗体重链可变区VH和轻链可变区VL,及中间连接区linker序列(Gly4Ser)3,有完整的抗原结合部位，以PCANTAB-5E为载体，库容量达到7X 105。
6.一种权利要求5所述犬源单链抗体库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.总RNA提取和cDNA的合成:取免疫后的犬外周血，分离淋巴细胞，提取总RNA，经逆转录PCR逆转录为cDNA ； 52.PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因:根据犬抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区的引 物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1~33所示；以SI获得的cDNA为模板，扩增可变区基因VH和VL ； 53.单链抗体scFv基因的扩增:设计含连接肽序列Iinker和5>77、AfoiJ酶切位点的引物，由S2获得的重链VH和轻链VL可变区基因的基础上再经扩增获得scFv基因； 54.单链抗体scFv库的构建:双酶切scFv基因片段，并插入pACNTAB-5E构建重组质粒，转化感受态万.co7iTGl,获得初步的单链抗体库,经反复淘筛,获得犬源单链抗体库。
7.根据权利要求6所述的犬源单链抗体库的构建方法，其特征在于，S3所述连接肽序列linker和Sfi1、NotI酶切位点的引物序列如SEQ ID NO:34~47所示。
8.根据权利要求6所述的犬源单链抗体库的构建方法，其特征在于，S4所述淘筛的方法为:以犬血型抗原阳性和阴性红细胞膜，固化到硝酸纤维素膜上，对单链抗体scFv库进行“粘附-洗脱-扩增”的筛选；每轮筛选后对扩增的噬菌体进行滴度测定，检测特异性噬菌体的富集结果。
9.权利要求1或2所述单链抗体或权利要求4所述引物组或权利要求5所述单链抗体库在制备犬血型鉴定试剂中的应用。
【文档编号】C12N15/13GK104017080SQ201410263525
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】李守军, 李华涛, 贾坤, 孙凌霜 申请人:华南农业大学