抗微生物的胶原构建体的制作方法

专利名称：抗微生物的胶原构建体的制作方法
技术领域：
本发明属于再生医学和组织工程学领域。本发明涉及从所加工的组织材料或基 质制备的生物工程化的构建体，该组织材料或基质是动物来源的。本发明的生物工程化 的构建体是采用保持所加工的组织基质的生物相容性、细胞相容性、强度和生物重塑性 能的方法制备的。为该生物工程化的构建体赋予抗微生物性能，该构建体用于移植、植 入、组织修复、创伤修复和重塑，或者用于哺乳动物宿主中的其他用途。
背景技术：
简介再生医学和组织工程学领域将工程化方法和生命科学原理相结合起来，以便了 解正常及病理状态下的哺乳动物组织中结构与功能之间的关系。再生医学和组织工程化 的目标是开发并最终应用生物代用品来保存、维持或改进组织的功能。胶原是机体中最主要的结构蛋白质，约占机体总蛋白质的三分之一。胶原构成 皮肤、腱、骨和牙齿的有机物质的大部分，而且在大多数其他机体结构中作为纤维性内 含物存在。胶原的一些性能包括高抗张强度；部分地由于螺旋结构模拟潜在抗原决定簇 而产生的低抗原性；和低延展性、低半透性和低溶解性。此外，胶原是细胞附着的天然 物质。这些和其他性能使得胶原成为组织工程化和制造可植入的生物相容性代用品和生 物重塑假体的合适材料。已经对从被移植哺乳动物组织中获得胶原组织和组织构造的方法以及用这些组 织和组织构造构建假体的方法进行了广泛研究，以用于创伤愈合、外科手术修复以及组 织或器官的替代。研究人员的持续目标在于开发生物工程化的构建体，该构建体可成功 地用于提高患者所接受的卫生保健的标准。发明概述生物来源的胶原材料如肠粘膜下层可用于组织的修复或替换，并持续被开发和 改进。给新的生物工程化的、可生物重塑的构建体赋予抗微生物性能，以提高它们在 再生医学中的优良性能，再生医学包括创伤愈合、组织的修复和替换。公开了处理猪 空肠近端的机械方法和化学方法，制备来源于肠粘膜下层的单一的、非细胞的肠胶原层 (ICL)，用该ICL制备具有抗微生物性能的薄片，用于治疗、修复和替代。该加工去除 细胞和细胞碎片，而保留天然胶原组织基质的结构。用经加工的组织基质薄片制备具有 期望规格的单层和多层的层压的、交联构建体。单层创伤敷料产品、层压的多层补片用 于软组织修复以及用作血管移植物的管状构建体的功效已经被研究。经加工的、肠道来 源的组织材料提供必需的物理支持，而产生最少的粘连，并且能够整合到周围天然组织 中，并被宿主细胞渗透。体内生物重塑不包括这些构建体的机械整合。该植入物的固有 性质和功能性能是十分重要的参数，如弹性系数、缝合保持力和极性抗张强度，通过改 变层数和交联条件等方式，使这些条件适合特定需求。将抗微生物性能引入到这些构建 体中，控制或降低使用这些构建体的处理部位的细菌活性。本发明的目的在于提供一种具有抗微生物性能的生物工程化的胶原构建体，其 包括源于如小肠粘膜下层的组织来源的片状的纯化胶原组织基质层，或者经加工的、源于小肠粘膜下层的肠道胶原层，它们均被抗微生物剂处理过。当用本发明的生物工程 化的胶原构建体作为创伤敷料处理哺乳动物患者的伤口时，将该构建体应用于创面床上 以基本上覆盖该伤口，给患者自身的皮肤组织提供一个湿润的环境，以促进皮肤组织再 生，同时该构建体中的抗微生物剂控制或降低伤口中的细菌活性。构建体具有生物相容 性是指该构建体不具有细胞毒性，不会引起皮肤脱敏以及不会引起原发性皮肤炎症。在一个具体实施方案中，创伤敷料包括厚度约0.05mn到约0.07mm的经加工的 肠道胶原片和一种抗微生物剂，该胶原片来源于小肠粘膜下层。鉴于该纯化的组织基 质的片状几何学特点，可以将它们叠加，然后将各层化学粘合在一起，得到多层的构建 体。因此，其他的具体实施方案是包含双层或更多层的纯化组织基质的构建体，纯化组 织基质被粘合在一起而且经过抗微生物剂的处理。本发明的构建体可以是有网孔的、被 穿孔的或有窗的，以更适合创面床的大小，更好地排泄伤口渗出物，或者为了适应上述 两种需求。本发明的另一个目的在于处理需要护理和处置的伤口，特别是需要抗微生物剂 介入和保护的伤口，该伤口包括如下创伤类型中的任何一种部分和完全厚度伤口、压 迫性溃疡、静脉溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道/地雷伤口、外科手术伤口、 用于自体移植的供体部位伤口、Moh氏外科手术后伤口、激光手术后伤口、伤口开裂、 外伤伤口擦伤、破裂、二级烧伤、皮肤撕裂或者流液型伤口。本发明的另一个目的在于提供用于处理和修复软组织和器官的外科手术修复装 置，如补片或者网膜，其包括双层或更多层加工的、源于小肠粘膜下层的肠道胶原，其 层数可以在2到10之间，将这些肠道胶原粘合和交联在一起，形成具有生物相容性和可 生物重塑的多层构建体，当将构建体植入到受损或患病的软组织时，同时发生可控制的 生物降解和足够的活细胞替代，使得最初的植入假体被患者中的活细胞重塑。本发明的 另一个目的是提供处理需要修复和抗微生物剂介入的受损或患病的软组织的方法，包括 植入一种假体，该假体包括包含两层或多层叠加的、化学粘合的加工的、源于与抗微生 物剂接触的小肠粘膜下层的肠道胶原，当将该假体植入受损的或患病的软组织时，同时 发生可控制的生物降解和适当的活细胞替代，使得最初的植入假体被患者中的活细胞重 塑。例如，需要修复的受损的或患病的软组织是腹壁和胸壁缺陷、肌肉翻转加固、直肠 和阴道下垂、骨盆底重建、疝气、缝合线加固和重建过程。发明详述本发明涉及生物工程化的胶原构建体(例如，假体、移植物)，包括片状的纯化 的胶原组织基质层，该基质层是经加工的组织材料，来源于天然组织并被抗微生物剂处 理过，例如经加工的、源于小肠粘膜下层的肠道胶原层。生物工程化的胶原构建体可以 是单层的加工的组织基质，或者是多层叠加的、粘合的加工的组织基质。当用本发明的 生物工程化的胶原构建体处理哺乳动物受试者的伤口时，将该构建体应用于创面床上以 基本上覆盖该伤口，给患者自身的皮肤组织提供一个湿润的环境以促进皮肤组织再生， 同时抗菌成分控制或降低伤口中和伤口周围的细菌活性。当本发明的生物工程化的胶原 构建体作为外科手术装置时，将其植入到哺乳动物受试者的植入部位，起到功能修复、 增强或替代机体部分或组织结构的作用。抗微生物剂通过阻止细菌在构建体上附着和增 殖，控制或降低伤口中或植入部位的细菌活性。本发明的抗菌构建体具有生物相容性是指该构建体不具有细胞毒性，不会引起皮肤脱敏以及不会引起原发性皮肤炎症。本发明的假体也是“可生物重塑的”，是指发生可控制的生物降解，同时伴随 宿主或患者的细胞提供内源性的新基质来重塑和替代，以产生新组织。因此，当在本发 明的假体中掺入抗微生物剂并用作替代组织时，具有多种性能。第一，作为机体部分的 替代品或者伤口的覆盖物。第二，当作为机体部分的替代品时，起到作为宿主细胞向内 生长的重塑模板的作用。第三，提供针对处理部位的局部抗微生物活性。本发明的假体材料是加工的、源于哺乳动物胶原组织的纯化的胶原组织基质， 可将其自身或与经过其他加工的、纯化组织基质粘合在一起，并使其具有抗微生物性 能，形成可用于移植或植入到需要处理的受试者机体的某个部位上的假体本发明包括用加工的组织材料制备组织工程化假体的方法，该方法无需用粘合 剂、缝合线或者钉子来将各层粘合在一起，而且能够保持该假体的生物重塑性。术语
“加工的组织基质”和“加工的组织材料”是指从动物，尤其是哺乳动物中获得的天然 正常细胞组织，以机械方式清除掉附随组织，并且以化学方式清除掉细胞、细胞碎片， 基本上不含有非胶原的细胞外基质成分。加工的组织基质基本上不含有并纯化除去了非 胶原成分，保留了其天然的基质结构、组织、强度和形状。用于制备本发明的生物工程 化的移植物的加工的组织材料成分来源于包含胶原的动物组织，这种胶原组织的来源包 括但是不限于肠道、真皮、筋膜、包心膜、硬脑膜、胎盘和其他包含胶原组织基质的 平面的或成面的构造组织。这些组织的结构和几何学特点使得它们能够容易地被清洁、 操作和装配，用于制备本发明的生物工程化的移植物。根据本发明，技术人员能够在其 他动物来源中确定、获得和处理具有类似平面结构、几何学特点和基质组成的其他合适 组织来源。用于制备本发明的生物工程化的移植物的一种这种加工的组织基质成分是源于 小肠粘膜下层的肠道胶原层。小肠的合适来源是哺乳动物生物体，如人、奶牛、猪、绵 羊、狗山羊或者马，而猪的小肠是容易获得的来源。本发明的假体是采用经加工的肠道胶原层(有时称作为“肠道胶原层”或 "ICL")来制备的，该肠道胶原层是经加工的、源于猪小肠粘膜下层的组织材料。在获
取这种肠道胶原层的一种方法中，从哺乳动物中收集小肠，粗略地将附属的肠系膜组织 从小肠上分离。例如在与香肠包装机中的那些辊子类似的对向辊子之间，通过以机械方 式挤压未被加工的肠道材料，除去肌层(被膜肌肉)和粘膜(被膜粘膜)。由于小肠的被 膜粘膜下层比周围组织更硬，辊子将较为柔软的成分从粘膜下层中挤压掉，得到以机械 方式清洁的组织基质。在后面的实施例中，用刮肠机对猪小肠进行机械清洁，然后在一 系列溶液中进行化学清洁，得到经加工的组织基质。这种经过机械清洁和化学清洁的源 于小肠粘膜下层的肠道胶原层在此被称作为“ICL”，是用于制备本发明的抗菌构建体的 一类经加工的组织基质或材料。从组成上看，经加工的ICL组织材料是非细胞的I型端肽胶原，约为93%干燥重 量，具有少于约5%干燥重量的糖蛋白、粘多糖、蛋白多糖、脂质、非胶原蛋白和核酸如 DNA和RNA，基本上不含有细胞和细胞碎片。经加工的ICL组织材料大量保留了其基 质结构和强度。重要的是，经过清洁操作，部分保留了该组织基质的生物相容性和生物 重塑性，不含有对胶原的生物重塑性起副作用的清洁剂残留。因此，如同该组织在清洁操作中未被酶处理一样，胶原分子保留了其端肽区。为了获得经加工的组织基质，确定了适当的动物和组织来源。对组织进行机械 处理和化学处理，除去附属组织和非胶原成分，得到加工的组织基质。作为一个例子， ICL是用于生产本发明的生物工程化的移植物假体的一类经加工的组织基质。遵照下文 描述的方法来处理组织，生成经加工的组织基质，用于制作包含ICL和抗微生物剂的生 物工程化的移植物假体。为了获得猪ICL，用猪小肠粘膜下层作为本发明的生物工程化移植物假体的起始 材料。收集猪小肠，除去附属组织，然后用刮肠机进行机械清洁，结合机械作用和用水 洗涤，从被膜粘膜下层上强行地除去脂肪、肌肉和粘膜层。机械作用被描述成是当完整 的肠子在一系列辊子之间通过时，从被膜粘膜下层上挤压并去掉相继的各层。小肠粘膜 下层比周围组织硬，辊子从粘膜下层上将较软的成分挤压掉。技术人员能够确定本领域 中的其他机械清洁手段，包括其他物理操作，例如刮擦、挤压、压缩和摩擦。进行机械 清洁，使得仅保留肠道的粘膜下层，形成一种经机械清洁的肠道。在机械清洁后进行化学清洁处理，优选在室温下的无菌环境中进行，从经机械 清洁的肠道上除去细胞和基质成分。从肠道内腔的纵向切开经机械清洁的肠道，然后切 成长度约15cm到50cm的切片。称重后，将材料放到容器中，溶液与肠道材料的比例 为100 1 ν/ν。在最优选的化学清洁处理中，如Abraham的美国专利US5,993,844和 US6,599,690中公开的方法，这些文献的公开内容在此被引入，在碱性条件下，如加入氢 氧化钠(NaOH)，将胶原组织与有效量的螯合剂，例如乙二胺四乙酸钠(EDTA)接触；接 着与有效量的含盐的酸，例如含氯化钠的盐酸(HCl)接触；随后与有效量的缓冲液，如 IM氯化钠(NaCl)/IOmM磷酸缓冲生理盐水(PBS)接触；最后用水进行洗涤。每个处 理步骤优选使用旋转的或摇动的平台，以提高化学溶液和洗涤溶液的作用。经过清洁， 获得经加工的肠道胶原层，或经机械和化学清洁加工的、源于小肠粘膜下层的组织基质 ICL0在洗涤后，从清洁容器中取出ICL，轻轻挤压或擦拭，除去多余的水分。此时， 在被制备成假体之前，将ICL在-80°C下冷冻保存，在4°C的无菌磷酸溶液中保存，或者 进行干燥。如果进行干燥保存，将ICL薄片在一个平面上压平，如放在平板，优选多孔 的平板上或膜，如聚碳酸酯膜上，用解剖刀除去材料内腔反面的任何淋巴附属物，在室 温和湿润的条件下，在层流净化罩中干燥ICL薄片。ICL是一种平面的薄片结构，可用作为单层材料，或者被制作成作为假体的各种 类型的构建体，假体形状最终取决于其特定用途。为了形成本发明的多层假体，用一种 方法将ICL进行层压处理，使得在保留加工的基质材料的生物相容性和生物重塑性的同 时，还保留其作为一种替代组织的强度和结构特征。加工的、源于组织的组织基质保持 了天然组织基质的结构完整性，也就是说，起始材料的胶原基质结构仍然基本上是完整 的，并保持其物理性能，使得在植入时它具有许多固有的和功能的特点。在制备多层的 ICL层压制品时，将ICL薄片叠加以与其他薄片接触。无论是各层直接相互叠加在一起， 还是部分接触或重叠来形成更为复杂的结构，接触的部分是粘合的区域，各层在此相互 接触。在作为机体部分的替代品的临床应用中，包括植入过程中和最初的康复阶段，完 整构建体中的粘合区域应能够经受得起缝合和拉伸。在患者细胞定居并接着生物重塑假 体来形成新组织之前，粘合区域还应该保持足够的强度。
加工的组织基质用作单层假体，或者被制备成平面的、管状的或复杂形状的多 层粘合假体。当本发明的假体包含双层或多层的经加工的组织基质时，将各层用化学交 联剂交联来使其粘合在一起。当用化学交联方法将多层加工的组织基质粘合在一起时， 可以改变化学交联程度，调整假体上的生物重塑速度，该速度是假体被重吸收并被宿主 细胞和组织替代的速度。换句话说，在本发明假体中的交联程度越高，该假体被生物重 塑的速度越慢；相反，交联程度越低，生物重塑的速度越快。外科手术指标规定假体的 生物重塑的范围和/或速度。例如，当用单层构建体作为创伤敷料时，该假体可以是经 过化学交联或未经过化学交联的。例如，作为外科手术修复补片或网膜，假体是交联程 度低的多层构建体，使得该假体将较快地被生物重塑。例如，作为支持超级易动膀胱以 防止小便失禁的膀胱吊索，该假体是高度交联的多层构建体，使得该构建体不被很快地 生物重塑，也就是说，该假体基本上保持同样的构造，使得其被植入的时间更长。当呈现片状时，胶原基质或构建体通常具有两个相反的大面积表面。为了用 抗微生物剂处理加工的胶原基质，应用抗微生物剂时，将抗微生物剂与加工的胶原基质 的两面接触，或结合到两面上。可替代地，利用加工的胶原基质的纤维状和吸收性能， 将抗微生物剂应用到经加工的胶原材料的内部，应用到经加工的纤维状组织基质的空隙 中，例如将胶原基质浸没到含有抗微生物剂的溶液中，溶液通过吸收渗透到基质中。将 抗微生物剂呈递到多层构建体内部的另一种方法为处理单层的经加工的组织基质，然后 将各层叠加并粘合在一起。对于多层构造而言，这些方法包括以任何顺序实施用抗微 生物剂处理基质薄片，将基质薄片叠加形成多层并用交联剂交联该构建体的制备步骤包 括如下步骤用抗微生物剂处理基质薄片，将基质薄片叠加形成多层，然后用交联剂进 行交联；用抗微生物剂处理基质薄片，用交联剂进行交联，然后将基质薄片叠加形成多 层；用交联剂进行交联，用抗微生物剂处理基质薄片，然后将基质薄片叠加形成多层； 用交联剂进行交联，将基质薄片叠加形成多层，然后用抗微生物剂处理基质薄片；将基 质薄片叠加形成多层，用交联剂进行交联，然后用抗微生物剂处理基质薄片；或者将基 质薄片叠加形成多层，用抗微生物剂处理基质薄片，然后用交联剂进行交联。在有些情 形下，在包被抗微生物剂之后对基质进行交联可能不实用，因为有些抗微生物剂会被交 联剂洗掉。可以将未经处理和经处理的片层以不同排列叠加在一起，得到局部含有抗微生 物剂的假体。用于制备这种多层构造的方法包括将经抗微生物剂处理的组织基质片层和 未经处理的基质片叠加在一起，形成多层构建体，并将各层交联。例如，至少叠加两个 基质片层，交联并进行抗菌处理，得到经处理的基质构建体，然后将一层或多层未经处 理的基质薄片叠加到经处理的基质构建体的上层表面或下层表面或者上下层表面上，接 着对该构建体进行交联处理，得到组合的构建体。可替代地，至少叠加两层未经处理的 基质薄片，交联形成未经处理的基质构建体，然后将一个或多个经处理的基质薄片叠加 到未经处理的基质构建体的上表面或下表面或者上、下表面上，接着对该构建体进行交 联处理，得到组合的基质构建体。在另一个实施例中，交替叠加经处理的和未经处理的 基质薄片，然后交联形成组合的构建体。在另一个实施例中，交替地或以其他顺序叠加 用两种不同的抗微生物剂处理的基质薄片，生成一种组合的构建体。在另一个实施例 中，利用ICL材料的面，可以设定经处理的和未经处理的薄片之间的方向，或者薄片在组合的基质构建体中朝向经处理的或未经处理的基质构建体的方向。为了仅处理假体中所选择的部分或区域，通过遮盖不处理的表面部分，从而阻 止抗微生物剂与材料接触，而表面的其他区域可以被处理，从而使得材料的部分表面可 以被抗微生物剂处理。将抗微生物剂定位于胶原基质上的另一种方法为将胶原材料部分 浸没在溶液槽或溶液池中，使得胶原基质仅部分与抗微生物剂接触，而其他部分未进行 抗菌处理。将抗微生物剂定位于胶原基质上的还有一种方法是将抗微生物剂喷洒或推进 到材料的一个表面上，而不对反面进行处理。将单层和多层的构建体用抗微生物剂处理，使该构建体具有抗微生物性能。将 整个或者部分构建体与抗微生物剂接触，将至少一种抗微生物剂应用于到本发明的构建 体上。优选的抗微生物剂包括银基抗微生物剂和基于化学品的抗微生物剂。组合物中还 含有抗生素。可以用组合试剂来处理胶原材料，提供广谱的抗微生物活性，例如，银基 抗微生物剂和基于化学品的抗微生物剂；基于化学品的抗微生物剂和抗生素；银基抗微 生物剂和抗生素；或者三种试剂的组合。可以选择银基抗微生物剂，以赋予包含经加工的组织基质的假体以抗微生物性 能。通过几种形式将银应用于胶原构建体中。银基抗微生物剂包括银或含银化合物，这 些化合物具有抗微生物活性，并且与胶原构建体和患者相容。纯银也被称作为元素银或 贵金属银，相对无活性，在常温下不与水或者氧气发生反应，而且不溶于弱酸和弱碱。也可以使用银离子。一般认为，离子形式的银尚且不能产生抗微生物性能，其 抗微生物的可能性小于其他抗微生物剂。虽然不期望受任何理论的约束，离子形式的银 通过直接影响细胞和细胞壁的呼吸和运输以及繁殖，来有效地抵抗细菌、酵母和真菌以 及细胞外的病毒。还可以使用其他形式的银，包括但是不限于氧化银；硝酸银；磺 胺嘧啶银(silver sulfazidine)(磺胺嘧啶银⑴包含一种不溶的聚合物化合物，其作为抗微 生物剂和抗真菌剂时缓慢地释放银离子，可局部用于处理严重的烧伤，防止细菌感染)； 咪唑银；磷酸钾银(arglaes) (AgKaP04)；胶态微粒银；晶体银，例如银纳米晶体，也被 称作为“纳米晶体银”，这是给伤口或植入物部位递送并持续释放银阳离子及其自由基 的另一种方法。按照数种不同的方法制备纳米晶体银(“纳米银”)组合物。一种方法为脉冲 等离子体方法，产生具有规则的晶格结构的纳米晶体，该晶格结构缺乏原子杂乱但是具 有高保真度的均勻分布和形态学。脉冲等离子体方法利用两个导电的加料棒。将这两个 棒插入到充满大气压力下的受控气体的反应室中，气体最可能是惰性气体如氩。将棒与 高压、脉冲放电电源连接。通过加料棒从脉冲电源快速释放电压，来合成纳米材料。高 压放电使得原材料变成高温、高压的金属等离子体。由于利用了独特的气体动力学，等 离子体迅速扩张到周围气体中，产生均勻的纳米颗粒气相悬浮液。用封闭的环状系统连 续收集生成的纳米颗粒。根据操作的参数，该方法制备的纳米晶体银颗粒的直径为lOnm 到lOOnm。通常选择在15nm到40nm之间，或者在20nm到25nm之间的颗粒用于本发 明中。制备纳米银组合物的其他方法包括Burrell的美国专利US6,719,987中描述的那些 方法。这些方法产生具有特征在于的原子杂乱的晶格的晶体。在Burrell的方法中，在 气相中生成将要被沉淀的材料，例如通过蒸发或溅射生成，并将其输送到一个温度受控制的大空间中。材料的原子与工作气体环境中的原子碰撞，损失能量并迅速地从汽相冷 凝到冰冷的底物上，例如液氮冷却的指状物上。通过限制扩散的条件产生原子杂乱，使 得在材料中保留了足够的原子杂乱。在-io°c到100°C的低底物温度下；使用高于标准 值的工作气压；小于约30度的入射角；较高的产生高于正常原子流量的沉淀速度来沉淀 银。通过所谓”掺杂”的方法或者通过在反应室中掺入反应气体(即氧气)，在金属基 质中存在不同原子或分子来达到原子杂乱的目的。按照该方法，氧气是工艺气体中的组 成部分。可以将基于化学品的抗微生物剂应用于胶原构建体中，以使构建体具备抗微生 物性能。不作为穷举，基于化学品的抗微生物剂可选自如下聚六亚甲基双胍盐酸盐 (PHMB)；葡萄糖酸氯己定；二氨基聚双胍，如US6,316,669中描述的那些，该文献的 公开内容在此被引入；蜂蜜；苯扎氯铵；三氯生(2，4，4'-三氯-2'-羟基二苯基 醚)；以及甲硅烷基季铵盐(十八碳烷基二甲基三甲氧基甲硅烷基丙基氯化铵)。除了抗微生物剂外，胶原构建体还包含一种抗生素。抗生素是由一种由微生物 产生的物质，其杀死其他微生物或抑制其他微生物的生长。通常，抗生素是低分子量的 (非蛋白质)分子，作为次级代谢产物产生的，主要由土壤中的微生物产生。大部分的 这种微生物形成某类孢子或其他潜伏细胞，一般认为在抗生素的生成与孢子形成之间存 在某些联系。其中，最有名的抗生素生产者是青霉菌属和头孢菌属，它们是包括青霉素 和相关化合物在内的日内酰胺类抗生素的主要来源。在细菌中，放射菌属，特别是链霉 菌，产生多种类型的抗生素，包括氨基糖苷，如链霉素，大环内酯物，如红霉素和四环 素。形成内生孢子的杆菌生产多肽类抗生素，例如多粘菌素和杆菌肽。对于一定范围内 的微生物来说，抗生素具有杀灭作用，即“杀死”作用，或者具有静止作用，是指一种 “抑制”作用。抗生素的作用范围是指受其影响的细菌或其他微生物的范围。抗生素有
效抵抗原核生物，杀死或者抑制大范围的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，被称作为“广 谱”；那些主要抵抗革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的被称作为“窄谱”；而那些有 效抵抗单一生物体或疾病的是“限谱”。优选使用的抗生素化合物是广谱抗生素。将抗 生素化合物以组合方式提供给胶原构建体，例如以窄谱的革兰氏阳性化合物与窄谱的革 兰氏阴性化合物的组合形式；但是，广谱、窄谱和限谱的抗生素的任何组合都是可被使 用的。用于本发明中的抗生素包括内酰胺(青霉素和头孢菌素)，例如青霉素 G，头孢菌素；半合成的青霉素(还包括克拉维酸(clavulanicacid))，例如氨苄青霉素、 羟氨苄青霉素以及甲氧苯青霉素；单环内酰胺(monobactam)，例如氨曲南(aztreonam)； 羧基青霉烯(carboxypenem)，例如亚胺培南(imipenem)；氨基糖苷，例如链霉素；庆 大霉素；糖肽，例如万古霉素；林肯霉素，例如氯洁霉素；大环内酯，例如红霉素；多 肽，例如多粘菌素；杆菌肽；多烯，例如两性霉素；制霉菌素；利福霉素，例如利福 平；四环素，例如四环素；半合成的四环素，例如强力霉素；和氯霉素。经加工的组织基质单独作为一个单层被用于单层假体中，或者用于制作具有双 层或多层的假体。如果用作单层，将抗微生物剂与经加工的组织基质接触，使基质具有 抗微生物性能。在与抗微生物剂接触之前或之后，将经加工的组织基质交联，控制该材 料的生物重塑和生物降解的速度。换句话说，单层的抗微生物构建体为单层并用抗微生物剂处理过；用交联剂交联的单层，然后用抗微生物剂处理；用抗微生物剂处理单 层，然后用交联剂交联。使用ICL制备包含双层或多层经加工的组织基质的多层假体的方法已经被公 开。本发明的一个具体实施方案涉及扁平的片状假体以及制备和使用该片状假体的 方法，该假体由双层或多层粘合并交联在一起的ICL组成，作为能够被患者的细胞生物 重塑的可移植生物材料。鉴于ICL的扁平的片状结构，该假体容易被制作来包含任意层 数，优选2 10层，更预选2 6层，层数取决于该构建体的最终特定用途所需的强度 和大小。ICL具有沿着大体相同方向排列的结构基质纤维。进行层叠时，可以改变各层 方向以调节经加工的组织片层中的总体组织纤维方向。将薄片层叠，使得它们的纤维相 互平行或者以不同的角度定向。也可以将片叠加来形成一种构建体，其具有跨越该假体 区域的连续的数层。可替代地，由于叠加排列的最终尺寸受到肠道圆周的限制，可以将 各层以拼贴的方式交叉排列而得到一种片状构建体，其表面积大于原始材料尺寸，但是 跨越假体区域没有连续的层。可以引入复杂的结构特征，例如在片层之间穿过或者横越 片层的管道或通道，形成管道结构或网络结构。在包括ICL的多层构建体的制作中，当以灭菌的ICL材料开始时，优选采用无
菌环境和消毒工具来保证构建体的无菌性。为了制备多层的ICL构建体，将第一个无菌 的刚性支持部件，如刚性聚碳酸酯薄片放置在层流室的无菌场中。如果经过机械和化学 的清洁处理，ICL薄片仍处于未水合状态，可在水溶液中，例如在水或者磷酸缓冲生理盐 水中对它们进行水合处理。用无菌吸水布擦拭ICL薄片，从该材料上吸掉多余水分。如 果还不行，对ICL材料进行修整，从内腔反面的浆膜表面上除去任何的淋巴附属物。将 第一个经修整的ICL薄片放置在聚碳酸酯薄片上，用手捋平聚碳酸酯薄片以除去任何气 泡、折叠和皱褶。将第二个经修整的ICL薄片放置在第一个薄片上，再用手捋平聚碳酸 酯薄片以除去任何气泡、折叠和皱褶。重复操作直到获得用于特定用途的期望层数，优 选2 10层。天然的管状ICL具有面的特征在天然状态下朝向肠道内腔的内粘膜表面以及 朝向腔外的相反的外浆膜表面。已知这些表面影响假体的手术后性能的特征，但是可以 进行调整来提高装置的性能。目前由于使用合成装置，产生附着，使得有必要再进行操 作来从周围组织中除去该附着物。在具有双层TCL的心包补片或者疝气修复假体的制备 过程中，优选这两个层的粘合区域处于浆膜表面之间，这是由于粘膜表面已被证明能够 在植入后防止手术后的附着产生。在其他具体实施方案中，优选ICL补片假体的一个表 面是无粘着力的、非附着性的，而其他表面具有粘附到宿主组织上的亲合力。在这种情 形下，假体具有一个粘膜表面和其他浆膜表面。在还有另一个具体实施方案中，优选相 反表面能够产生附着力，使与之任意侧面接触的组织长在一起，因此，该假体在构建体 的两侧具有浆膜表面。如果构建体是由双层以上的薄片组成的，植入时仅两个外层薄片 可能与其他机体结构接触，内层可能对手术后的附着形成并不起作用，则内层的方向较 不重要。在叠加完期望数量的ICL薄片后，通过将薄片一同脱水，在连接区域将它们粘 合，也就是说，在薄片接触之处粘合。尽管不期望受任何理论的约束，但是脱水时水分
12从ICL基质的纤维之间被除去，引起ICL层的胶原纤维聚集在一起。可能对第一个支持部 件的裸露面进行脱水，或者在第一个支持部件和第二个支持部件之间进行脱水，例如， 在进行干燥处理之前，将第二个聚碳酸酯薄片放置在最上层的ICL上，施加少量压力或 不施加压力，固定在第一个支持部件上，使所有层以扁平的平面排列在一起。为了便于 脱水，支持部件是多孔的，以便气体和水分通过，到达脱水层。在空气中、真空中或者 通过化学手段，对片层进行干燥处理，化学手段如使用丙酮或醇例如乙醇或异丙醇。脱 水到室内湿度，在约10%相对湿度到约20%相对湿度之间，或更低；或者约10%到约 20%w/w的湿度，或更低。脱水是容易实施的，通过改变固定聚碳酸酯薄片的框架的角 度，直到ICL片层朝向源于层流室的气流，在约20°C的室温下和室内湿度下处理至少约1 小时到24小时。尽管不是必需的，但是在一种实施方案中，在交联之前对要脱水的片层进行脱 水。将要脱水的ICL片层从多孔支持物上一同剥离下来，在水溶性再水合试剂中再水 合，优选在水中再水合，将它们转移到含有水溶性再水合试剂中，在约4°C到约20°C的 温度下放置至少约10到约15分钟，对这些片层进行再水合处理，而无需将它们分离或分层。然后将叠加的ICL与交联剂接触，在粘合区域将被脱水的粘合片层或者被脱水 和再水合的粘合片层交联在一起，优选使用化学交联剂交联，以保护ICL材料的生物重 塑性。如上提及，脱水使得邻近的ICL层的基质中的胶原纤维聚集在一起，将那些片 层交联在一起，在粘合片层的成分之间形成化学键。对粘合假体装置进行交联还为该装 置提供了强度和持久性，以改进其操作性能。各种类型的交联剂在本领域中是已知的， 并且可以被使用，例如核糖和其他糖、氧化剂和脱水加热(DHT)方法。优选的交联剂 是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)。在另一种优选方法中， 如Staros，J.V., Biochem.21, 3950-3955，1982中所述，将磺基_N_羟基琥珀酰亚胺加 入EDC交联剂中。除了化学交联剂之外，还可以使用基于纤维蛋白的胶水或者医药级 的粘合剂如聚氨酯、乙酸乙烯酯或聚环氧基，将片层粘合在一起。在最优选的方法中， 将EDC溶解在水中，浓度优选在约O.lmM到约100mM之间，更优选在约l.OmM到约 10mM之间，最优选为约l.OmM。除了水，磷酸缓冲生理盐水或者2_[N_吗啉代]乙磺 酸(MES)缓冲液也可以被用于溶解EDC。可以将其他试剂，例如丙酮或醇添加到溶液 中，在水中至多为99%，典型地为50%，使得交联更为一致和有效。这些试剂从层中除 去水分，使基质纤维聚集在一起，促进这些纤维之间的交联。在交联剂中，这些试剂与 水的比例可用于调控交联。由于随着时间推移，EDC会失去活性，因此EDC交联溶液是 在使用前被立即配制的。为了将交联剂与ICL接触，将被脱水的、粘合的ICL层转移到 容器如浅的盘子中，将交联剂轻轻倒到盘子中，确保ICL片层被覆盖并且不漂浮，在ICL 构建体的片层下或中间没有气泡。将容器覆盖，在约4°C到约20°C的温度下，ICL片层 被交联约4到约24小时，更优选8到约16小时。通过温度调控交联，在较低温度下， 反应缓慢，因而交联更为有效；在较高温度下，EDC更不稳定，交联效率较低。在交联后，倒出交联剂并除去，将构建体与洗涤剂接触，在盘子中进行冲洗来 除去交联剂。优选的洗涤剂是水或者其他水溶液。优选地，将化学粘合的构建体用等体 积的无菌水冲洗三次，每次约5分钟，进行充分冲洗。如本文所述，将构建体与抗微生物剂接触，可以通过分别接触或处理各个经加工的组织基质，或者通过接触或处理多层 的中间构建体，来赋予该构建体以抗微生物性能。用抗微生物剂处理单层或者多层的加 工的组织基质的方法将随着所用的抗微生物剂类型而改变，但是应当能够保持经加工的 组织基质的可生物重塑性、生物力学性能和生物相容性。当选择纳米晶体银作为抗微生物剂时，通过使胶原基质材料与纳米晶体银接 触，将纳米晶体应用于胶原基质材料中，通过将试剂悬浮在溶液中通过涂覆它，通过涂 覆加工的基质材料来应用抗微生物剂。将纳米晶体银分散在水、水溶液或者一种溶剂中 而形成分散的纳米晶体银的溶液。将ICL浸没在装有一定体积纳米晶体银溶液的盘子 中，使得当ICL浸没在其中时，纳米晶体银粘附到ICL上。在浸没过程中，搅动或搅拌 该溶液。然后从溶液中取出ICL，并将其放置在允许水或溶剂从含有结合的银的TCL中 蒸发而产生含有纳米晶体银涂层的ICL构建体的环境下。用于给ICL涂覆含有纳米晶体 银的分散体的其他方法包括喷洒并允许溶剂从ICL中蒸发。当选择PHMB作为抗微生物剂时，将PHMB添加到溶液中，使用在水中的 0.09%-0.5% v/v,将经加工的组织基质浸没在溶液中，使得PHMB溶液浸透该基质。在 足以使得溶液浸透经加工的组织基质的时间之后，从溶液中取出基质并进行干燥，使得 当溶剂蒸发时，PHMB仍保留在基质上。在制作多层、粘合的移植物假体之前或之后，对经加工的组织基质和构建体进 行处理或修饰，包括物理的或者化学的处理或修饰。对经清洁的组织基质和构建体进 行物理修饰，例如定形、通过拉伸和松弛进行修整、或打孔、网状化或穿孔。在进行打 孔、网状化或穿孔时，调整降低材料的总体张力，以便更好地适合于创面床大小，或者 更适合分泌物的流通和排出，或者对上述两者都有利。也可以进行化学修饰，如结合生 长因子、选择的细胞外基质成分、遗传材料以及其他试剂，这些将对被处理的、被修复 的或者被替换的机体部分的生物重塑和修复产生影响。本领域技术人员在考虑了构建体所需的性能特征后，确定物理修饰组织基质和 本发明的构建体的方法。使用在膜面上按图案排列有针头、刀片或者钉栓的模具，以一 定穿孔形式提供该构建体，该穿孔与构建体的反面相通。将构建体放置在平台上，下压 模具使得针头、刀片或钉栓压入构建体中，抵达平台，从而穿过构建体。在产生裂缝 或网格模式的方法中，使用与在自体皮肤移植操作中通常使用的那些类似的皮肤啮合装 置。一种装置是齐默尔皮肤啮合器。用受激准分子激光器(例如在KrF或ArF的波长下) 对构建体进行激光钻孔，产生穿透整个假体的微米级的孔，有助于细胞向内生长。可以 在制备假体过程中的任何时候对构建体进行打孔、穿孔或激光钻孔，但是优选在净化之 前进行，或者在最后消毒后进行。对于某些指标，优选该穿孔或激光钻孔穿过假体的所 有片层，有助于细胞通过或液体排出。对于某些指示，优选这些孔不穿过所有片层，使 得细胞能够接近多层构建体的内部，或者有助于构建体形成新血管。对单层构建体进行的其他物理修饰是穿孔或打孔，它们连通构建体的两侧。对 单层构建体进行的另一种物理修饰是将该构建体网状化，这给构建体提供了排列的类似 于网孔的裂缝模式。以一种模式产生裂缝，其网孔比例类似于皮肤啮合器产生的比例， 例如由齐默尔产生的比例。网孔比例设定在1 1.5或2 1。为了制备抗微生物性能 的单层ICL构建体，将ICL的粘膜面铺展到光滑的聚碳酸酯薄片上，确保除去皱褶、气泡和可见的淋巴附属物。将ICL铺展在聚碳酸酯薄片上，使尺寸最优化。任选地，使材料 的整个表面充分干燥。然后将至少一种抗微生物剂应用到该材料上。任选地，通过网状 化或者穿孔，对材料进行物理修饰，然后将其切割成一定尺寸，包装，最后按照无菌规 范进行灭菌。在可替代的具体实施方案中，在对材料进行网状化、穿孔或打孔的物理修 饰后，对材料进行抗微生物的处理。制备经加工的组织基质，并用抗微生物剂包被，再将构建体修整为期望的尺 寸。作为例证，可用的尺寸为约6平方英寸(约15.2cmX15.2cm)，但是可以制备成任意 大小，用于移植给患者。然后将抗微生物的加工的胶原基质包装在容器中，该容器可被密封，用于最终 灭菌、储藏和分发。可以将抗微生物的加工的胶原基质以干燥或湿润的状态包装在容器 中。优选的包装材料与抗微生物的处理以及胶原基质相容，如果以湿润状态包装时，与 保持产品处于湿润状态的试剂相容。如果将构建体用光敏的抗微生物剂处理，例如银基 抗微生物剂，可以使用防止光线透过或者使光线滤过的包装材料来包装产品，以防止抗 微生物活性下降和构建体变色。最后用医学杀菌装置领域知晓的手段对构建体进行灭菌。优选的灭菌方法为 按照US5,460,962，将构建体与用足量的10N氢氧化钠(NaOH)中和的无菌0.1%过乙酸 (PA)接触，该文献的公开内容在此将被引入。在放置在摇动平台上的容器中，例如在1L Nalge容器中进行净化约18士2小时。然后将构建体与三倍体积的无菌水接触三次来进行 洗涤，每次10分钟。在更优选的方法中，使用25-37kGy的伽马射线照射来对ICL构建 体进行灭菌。伽马射线照射显著地但不是有害地降低杨氏模量、极限抗张强度以及收缩 温度。伽马射线照射后的机械性能仍足以在应用范围内使用，伽马射线被广泛用于可植 入医疗装置领域，是一种优选手段。每次灭菌包括放射量测定指示剂，来证明该剂量在 特定范围内。用包装材料以及与构建体的组分相适应的设计来包装构建体，并且确保在 存储过程中的无菌状态。优选的包装手段是一种双层的可剥离的包装，其中基础包装是 热封的硬质泡沫塑料衬垫包装，其由乙二醇改进的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETG)盘子 组成，具有一个纸面的箔盖，该箔盖被封装在由聚乙烯/对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄 片组成的二级热封袋中。将基础包装和二级包装以及其中含有的ICL构建体一同用伽马 射线灭菌。本发明的假体可以是扁平的、管状的，或者具有复杂的几何结构。加工成形的 假体的形状可由其特定用途所决定。因此，当形成本发明假体的粘合片层时，可以对模 型或者板面支持部件进行改进以提供期望的形状。植入扁平的多层假体，修复、补充或 者替代患病的或受损的器官，例如腹壁、心包膜、疝气和各种其他器官和结构，包括但 是不限于骨骼、骨膜、软骨膜椎间盘、关节软骨、真皮、肠道、韧带和腱。此外，扁平 的多层假体可用作血管或心脏内的补片，或者作为心瓣膜的替代品。单层或多层的扁平的薄片假体被用于覆盖受试者的伤口，形成湿气隔离物，使 伤口部位轻松舒适，并且在伤口部位稳定地开始愈合时提供抗微生物的活性。扁平的薄片也可被用作为器官支持物，例如，使用薄片作为器官的吊索用于支 持下垂或者超级易动的器官，如膀胱或子宫。可以使用管状的假体，如用于替换管状器 官的横截面，如血管系统、食道、气管、肠道和输卵管。这些器官具有基本的管状，包括外表面和内腔表面。此外，扁平的薄片和管状结构还可以被成形在一起而形成复杂结 构，以替换或者补充心脏或血管的瓣膜。用于制作本发明的抗微生物的构建体的ICL材料是生物相容的。按照用于医疗 装置的生物评价的Tripartite和ISO-10993指导，对用ICL制备成的假体进行生物相容性 测试。“生物相容性”是指假体是无细胞毒性的、血液相容的、无热原的、不含内毒素 的、非遗传毒性的、不产生抗原的，并且不会引发皮肤敏化反应，不会引发原发性皮肤 炎症反应，不会引起急性全身性毒性，并且不会引发亚慢性毒性。将在下文中对这些生 物相容性质作更为详细的讨论。当使用名为“细胞毒性的体外L929琼脂覆盖测试(L929 AgarOverlay Test for Cytotoxicity In Vitro)"的测试，对在测试产品中暴露期间的L929细胞进行观察，结果表 明用ICL制备的构建体产品无生物活性(0级)或细胞毒性。阳性对照产品(3级)和阴 性对照产品(0级)的细胞反应验证了该系统的有效性。按照USP指南进行检测和评价。 本发明的假体被认为是无细胞毒性的，满足细胞毒性的体外L929琼脂覆盖测试的要求。按照改进的ASTM提取方法，对本发明的假体进行血液相容性测试(体外溶血 反应，使用改进的ASTM提取方法进行体外测试)。按期望实施阳性和阴性对照，在研 究条件下，装置提取物的平均溶血指数是0%。研究结果表明本发明的假体不会引起溶 血，是血液相容性的。按照目前用于热原性检测的USP操作，在兔子中对本发明的假体进行热原性测 试。在研究条件下，兔子体温在观察期间的总升高是在可接受的USP界限内。结果证明 本发明的假体是无热原性的。本发明的假体不含内毒素，优选地，含量动.06EU/ml(每 cm2的产品)。内毒素是特定的热原，是革兰性阴性细菌的细胞壁的一部分，由细菌脱落 并污染材料。本发明的假体不引发皮肤敏化反应。还没有文献报道，用于清洁猪肠道胶原的 化学药品会引发敏化反应，或者将改变胶原而引发这种反应。对由化学清洁的ICL形成 的本发明的假体进行敏化反应测试，结果指示该假体不会引发敏化反应。本发明的假体不会引发原发性皮肤刺激反应。对化学清洁的ICL进行刺激测 试，结果表明由化学清洁的ICL形成的本发明的假体不会引发皮肤刺激反应。对用于制备本发明的假体的化学清洁的TCL进行急性系统性毒性和皮内毒性测 试，其结果证明在所检测的假体中没有毒性。此外，在动物植入试验中，没有化学清洁 的猪肠道胶原会引起急性系统性毒性的证据。对含有猪肠道胶原的本发明的假体进行亚慢性毒性测试，证实没有装置的亚慢 性毒性。还没有文献报道，用于清洁猪肠道胶原的化学药品将会影响引起遗传毒性的可 能性，或者将改变胶原而引发这种反应。对含有猪肠道胶原的本发明的假体进行遗传毒 性测试，证实没有装置的遗传毒性。对用于制备本发明的假体的猪肠道胶原进行化学清洁处理的目的在于通过除去 细胞、细胞残留物以及非胶原的和非弹性的蛋白基质成分，使抗原性最小化。通过采用 化学清洁的猪肠道胶原进行植入试验证实，含有猪肠道胶原的本发明的假体没有装置的 抗原性。
本发明的ICL构建体优选是无病毒活性的。在加工过程中，对两个化学清洁程 序NaOH/EDTA碱性螯合溶液(pH 11-12)和HCL/NaCl酸性盐溶液(pH 0_1)灭活四种 相关病毒和模型病毒的效率进行了测试。基于源猪材料选择模型病毒，并且用来代表广 泛的物理化学特性(DNA病毒、RNA病毒、包膜病毒和非包膜病毒)。病毒包括狂犬病 病毒、牛病毒性腹泻病毒、呼吸道肠道病毒_3和猪细小病毒。根据FDA和ICH指导性 文件进行试验，包括CBER/FDA "Points to Consider in theCharacterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (1993) ” ； ICH "Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products Viral SafetyEvaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Humanor Animal Origin” (CPMP/1CH/295/95)； 以及 CPMP BiotechnologyWorking Party “Note for Guidance on Virus Validation Studies TheDesign, Contribution and Interpretation of Studies Validating thelnactivation and Removal of Viruses” (CPMP/ BWP/268/95)。试验结果证明，对于所有四种标准病毒来说，这两个化学清洁步骤的累 计灭活动病毒超过106。该数据表明化学清洁操作是强大而有效的过程，其保持灭活多种 病毒性物质的潜能。本发明的假体是可生物重塑的。可作为机体部分的替代品或支持物，本发明的 假体还可以作为宿主细胞向内生长的可生物重塑的基质骨架。“生物重塑”用于此是指 通过宿主细胞以约等于生物降解的速度向内生长而生成内源性结构胶原、血管形成和细 胞种群恢复，通过宿主细胞和酶使植入假体的基质成分进行重整和替换。移植物假体被 植入到受试者的所有或者基本上所有的宿主组织中，移植物假体保持其结构特征，但是 被它们所植入的受试者重塑，并作为所修复或替换的组织的类似物。除了这些可生物重 塑的品质外，由双层或多层经加工的组织基质制成的本发明的假体还被制备成包含期望 的生物力学特性。杨氏模量(MPa)被定义为压力和张力之间的线性比例常数。极限抗张强度(N/ mm)是跨越假体的强度的测量值。这两个特性是假体中的TCL的层数的函数。当用作 载重或支持装置时，应当能够满足起始康复阶段和整个重塑过程中的物理活动的严格要 求。通过切削测试，测定粘合区域的层压强度。在外科手术植入后，重要的是在 物理压力下不会立即分层。在动物试验中，移植材料都没有显示任何的分层证据。对 于ImMEDC交联的多层构建体来说，在植入前，两个相对的层之间的粘着强度约为 8.1 士 2.1N/mm。收缩温度(°C)是基质交联程度的指示。收缩温度越高，材料中的基质交联程度 越高。未交联的、经伽马射线照射的ICL的收缩温度约为60.5士 1.0°C。在优选的实施 方案中，对于分别在溶于50%丙酮中的ImMEDC 约100mM EDC中交联的装置来说， EDC交联的假体优选具有的收缩温度在约64.0士0.2°C到约72.5士 1.1°C之间。机械性能包括机械完整性，使得假体在生物重塑过程中防止蠕变，而且是易曲 折的和可缝合的。术语“易曲折的”是指好的操作特性，以在临床中应用。术语“可缝合的”是指该层的机械性能，包括缝合保持力，使得当将假体缝合 到天然组织的部分上时，针和缝合材料能够穿过假体材料。在缝合过程中，这种假体必 需不会由于因缝合而对它们施加的张力而被撕裂，在缝合线打结时它们也不会撕裂。假体的可缝合性，即假体在缝合时不会发生撕裂，它与假体材料的内在机械强度、移植物 的厚度、施加在缝合线上的张力、以及打死结的比例相关。在lOOmMEDC和50%丙酮 中高度交联的扁平的六层假体的缝合保持力为约6.7士 1.6N。在溶于水中的ImMEDC中 交联的双层假体的缝合保持力为约3.7N士0.5N。由于外科医生的缝合力为约1.8N，交联 的扁平的双层假体的优选较低的缝合保持力为约2N。术语“非蠕变的”用于此是指假体的生物力学特性赋予了耐久力，使得该假体 在植入后不发生超过正常限度的伸长、扩张、或者膨胀。如下文所述，植入的本发明的 假体的总伸长在可接受的限制内。宿主细胞以大于生物降解引起的植入材料降低其机械 强度的速度替换结构性胶原并重塑，本发明的假体需要能够抵抗由植入后细胞生物重塑 所引起的伸长。尽管本发明的经加工的组织材料被叠加并粘合，但是它们是“半透性的”。半 透性使得宿主细胞向内生长，用于重塑或者沉积影响生物重塑性、细胞向内生长、防止 或促进附着或者血流的试剂和成分。假体的“无孔的”性质通过植入假体，防止将要 保留的液体流过。相反，假体应用时要求具有多孔或打孔性质，则在假体中形成孔、穿 孔、打孔、裂缝或者网孔。本发明的假体的机械完整性使得其能够被覆盖或折叠，以及能够被切割或修整 来获得干净的边缘，而无需将构建体的边缘分层或破坏。源于小肠的被膜粘膜下层的经加工的肠道胶原薄片通常具有从约0.05mm到约 0.07_的厚度。如果所纯化的组织基质具有片状几何结构，则将其叠加后化学粘合在一 起，提供厚度较大的多层构建体。本发明的多层粘合假体装置的经加工的组织基质片层 源于相同的胶原材料，例如双层或多层ICL，或者源于不同的胶原材料，例如单层或多层 ICL以及单层或多层阔筋膜。具有抗微生物性能的构建体被用于处理伤口，包括部分和完全厚度伤口、压 迫性溃疡、静脉溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道伤口 /地雷伤口、外科手术伤 口(例如自体移植造成的供体部位伤口、Moh氏手术后伤口、激光手术后伤口、伤口开 裂)、外伤伤口(例如擦伤、破口、二度烧伤、以及皮肤撕裂)以及流液型伤口。创伤敷 料是经机械和化学清洁的猪肠道胶原的单层薄片或多层构建体，包括至少一种抗微生物 剂，各个经加工的组织基质薄片的厚度为约0.05mm到约0.07mm，含有连通薄片两侧的 窗孔。该产品主要包含天然形式的I型猪胶原(约>95%)，少于约0.7%的脂质，而且 检测不到粘多糖(约<0.6%)和DNA(约<0.1ng/iU)。猪肠道胶原基本上不含有细胞 和细胞残留物。本发明的创伤敷料可以是交联的或者未交联的，如果是交联的，则交联 达到调控和控制生物降解、生物重塑或者宿主细胞替换敷料的程度。对创伤敷料进行物 理改变，使得液体能够流过。创伤敷料提供湿润的愈合环境，作为控制细菌污染并使之 最小化的屏障，并通过覆盖感觉神经末端来减轻患者的疼痛。抗微生物剂给伤口部位及 其周边提供抵抗微生物污染的有效保护。将创伤敷料应用到具有需要处理的伤口的患者。在应用前，采用标准的创伤敷 料技术对创面床进行清洁并除去疤痕组织。优选地，对伤口进行清洁，使得伤口边缘含 有活组织。在应用本发明的敷料时，将其切割成创面床的外轮廓。如果伤口比单块敷料 大，则使用多块敷料，交迭地覆盖住整个伤口。如果敷料处于干燥状态，则使用无菌生
18理盐水或者其他等渗溶液使其发生再水合。敷料边缘与完整组织接触，然后捋平以确保 敷料与下方的创面床接触。如果薄片下方集聚了过量的渗出物，则在薄片上剪切出小的 开口，让渗出物排出。本发明的抗微生物的创伤敷料用作伤口与传统的创伤敷料之间的界面，或者作 为第二种创伤敷料。可替代地，本发明的抗微生物的创伤敷料用作皮肤替代品，例如 自体移植物、同种异体移植物或经培养的皮肤构建体的覆盖物。当用作覆盖物时，创伤 敷料提供湿润的伤口环境，使得源于皮肤替代品的细胞将在创面床增殖以更快地闭合伤在应用后，优选应用适当的非附着的第二敷料，以维持湿润的伤口环境。根据 伤口位置、大小、深度和使用者的偏爱来确定最适宜的第二敷料。根据维持湿润、清洁 的创面床的需要来更换第二敷料。敷料的更换频率将根据所处理的伤口的类型、大小和 深度、产生的渗出物的体积以及所用敷料的类型而改变。在愈合发生时，在使用其他创 伤敷料的情形下，需要替换创伤敷料，直到实现完全愈合。本发明的其他实施方案涉及具有抗微生物性能的多层构建体。本发明的假体装 置具有双层或多层粘合在一起的胶原层。“粘合胶原层”用于此是指由双层或多层相同 或不同胶原材料组成，这些片层经过一定方式处理，使得片层相互叠加在一起并且通过 自层压和化学交联充分地结合在一起。更特别地，假体装置是外科手术网膜或者移植物，其被植入来加固软组织，包 括但是不限于腹壁和胸壁缺陷、肌肉翻转加固、直肠和阴道下垂、骨盆底重构、疝 气、桥连筋膜缺损中的裂口、缝合线加固和重构操作。本发明的网膜或移植物包括五层 猪ICL薄片以及抗微生物剂，厚度为约0.20mm到约0.25mm。该产品主要由天然形式的 I型猪胶原(约> 95% )组成，脂质少于约0.7%，而且检测不到粘多糖(约< 0.6% )和 DNA(约<0.1ng/iU)。猪肠道胶原基本上不含有细胞和细胞残留物。该假体以无菌的 片状形式被提供，大小在5X5cm到12X36cm的范围内，以双层的可剥离的形式包装。 假体的变性温度为约58士5°C;抗张强度超过15N;使用2-0编丝缝线时的缝合保持强度 超过2N;而最终的内毒素含量<0.06EU/ml(每cm2的产品)。特别地，扁平的薄片构建 体假体由五层ICL以及抗微生物剂组成，用ImM 1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳化二 亚胺盐酸盐(EDC)粘合和交联。为了制备该构建体，将第一个ICL薄片的粘膜面朝下， 铺展在光滑的聚碳酸酯薄片上；确保去除皱褶、气泡和可见的淋巴附属物。铺展ICL使 得尺寸最优化。将三片ICL (粘膜面朝下)层叠到第一个ICL薄片上，当层叠每个层时， 确保除去皱褶、气泡和可见的淋巴附属物。第五个薄片应当粘膜面朝上，确保除去皱褶 和气泡。在层叠第五个薄片之前除去可见的淋巴附属物。将层一起干燥24士8小时。将 层一起干燥，然后在水中的ImM EDC中，在每个30cm的五层薄片500mL交联溶液中交 联18士2小时。将各个产品用无菌水冲洗，然后在还处于水合状态时切割成最终的尺寸 规格。在可替代的实施方案中，假体装置是外科手术吊索，含有至少一种抗微生物 剂，用于植入以加固和支持存在缺陷的软组织，包括但是不限于如下操作微创型尿道 悬吊系统、下垂修复(尿道、阴道、直肠和结肠)、骨盆底重构、膀胱支持、骶骨阴道悬 吊、重构操作和组织修复。在另一个最优选的具体实施方案中，假体装置是外科手术吊索，由3 5层粘合、交联在一起的使用至少一种抗微生物剂处理的ICL组成。为了制 作五层装置，将ICL的粘膜面朝下铺展到光滑的聚碳酸酯薄片上；确保除去皱褶、气泡 和可见的淋巴附属物。铺展ICL，使得尺寸最优化。将第二、第三和第四层ICL(粘膜面 朝下)叠加到第一层上，当叠加每个片层时确保除去皱褶、气泡和可见的淋巴附属物。 将第五层薄片的粘膜面朝上，确保除去皱褶和气泡。在叠加该第五层薄片时应当除去可 见的淋巴附属物(将第一个ICL薄片粘膜面朝下铺展到光滑的聚碳酸酯薄片上；确保除 去皱褶、气泡和可见的淋巴附属物；将第二个ICL薄片(粘膜面朝下)层叠到第一个薄 片上，并将第三个薄片的粘膜面朝上层叠到第二个薄片上，来制备三层的构建体)。将 片层干燥24士8小时，一旦干燥，在溶于水中的ImMEDC中，在每个30cm的五层薄片 500mL的交联溶液中交联18士2小时。将每个粘合的交联的构建体用无菌水冲洗，然后 在还处于水合状态时切割成最终的尺寸规格。为了给微创型尿道提供支持，用吊索处理 由于尿道超级易动或内在的括约肌缺陷导致的小便失禁。外科手术吊索由五层层压的猪 肠道胶原薄片和一种抗微生物剂组成，厚度为约0.20mm到约0.25mm。将该装置用1_乙 基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)交联。该装置主要由天然形式的 I型猪胶原(约> 95% )组成，脂质少于约0.7%，而且检测不到粘多糖(约< 0.6% )和 DNA(约<0.1ng/iU)。猪肠道胶原基本上不含有细胞和细胞残留物。假体的变性温 度(DSC)超过约63°C ；抗张强度超过约15N ；使用2-0编丝缝线时的缝合保留强度超 过2N;而最终的内毒素含量<0.06EU/ml(每cm2的产品)。吊索的生物重塑方面可以 被改变和调整，本发明的吊索假体不是机体部分的替代品，而是被植入作为辅助结构的 器官支持装置。优选地，吊索的ICL片层具有更高的交联程度，以降低吊索的可生物重 塑性。吊索假体是一种高度生物相容的、弹性的胶原结构，当作为器官支持装置被植入 时，能够维持所需的结构性支持。 在还有另一个优选的实施方案中，假体装置是硬脑膜修复补片，被植入来修复 硬脑膜，硬脑膜是保护中枢神经系统的韧性部分。本发明的硬脑膜修复装置由四层片层 粘合并交联在一起的TCL以及一种抗微生物剂构成。为了制作该四层的装置，将TCL的 粘膜面朝下铺展到光滑的聚碳酸酯薄片上；确保除去皱褶、气泡和可见的淋巴附属物。 铺展ICL，使得尺寸最优化。将第二个和第三个ICL薄片(粘膜面朝下)层叠到第一层 的上面，当层叠每个层时，确保除去皱褶、气泡和可见的淋巴附属物。将第四个薄片的 粘膜面朝上铺展，确保除去皱褶和气泡。在叠加第四个薄片之前，应当除去可见的淋巴 附属物。将片层干燥24士8小时，一旦干燥，在溶于2-[N吗啉代]乙磺酸(MES)缓冲 液中的约O.lmM 约ImM EDC中，在每个30cm的四层薄片500mL的交联溶液中交联 18士2小时。将各个粘合和交联的构建体用无菌水冲洗，然后当还处于水合状态时切割成 最终的尺寸规格。硬脑膜修复装置由四层层压的猪肠道胶原薄片组成，厚度为约0.14mm 到约0.21mm。将该装置用1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)交 联。该装置主要由天然形式的I型猪胶原(约>95%)组成，脂质少于约0.7%，而且检 测不到粘多糖(约< 0.6% )和DNA(约< O.lng/ u 1)。猪肠道胶原基本上不含有细胞和 细胞残留物。假体的变性温度(DSC)超过约63°C ；抗张强度超过约15N ；使用2-0编 丝缝线时的缝合保持强度超过2N ；而最终的内毒素含量< 0.06EU/ml (每cm2的产品)。 硬脑膜修复装置是生物相容的和可生物重塑的，当植入到需要进行硬脑膜修复的患者中时，作为硬脑膜的替代品，随着时间推移，它将被宿主细胞生物重塑，宿主细胞降解并 替代该装置，使得新的宿主组织替代该装置。例如，使用多层的ICL构建体来修复体壁结构。例如，该构建体可以被用作为 心包补片、膀胱壁补片、疝气修复装置(作为释放压力的补片或塞子)，或者用作吊索来 支持超级易动的或下垂的器官(脱肛，拱顶下垂、膀胱突出症)。多层构建体可用于处 理结缔组织，例如轴转肌(rotator cuff)或被膜修复中使用。多层构建体可用于硬脑膜修 复，修复颅骨切开术后的头盖缺陷或者用于修复沿着脊髓的神经管。当纤维环板层结构 破裂(即，椎间盘突出)时，该材料可用于修复纤维环板层，或者作为堵塞由椎间盘突出 造成的孔洞的塞子或者作为该孔洞的盖子，或者同时作为塞子和盖子。材料可用于整形 手术，例如乳房固定术，腹腔手术，以及面部整形手术(增高额头和脸颊)。单层和多 层ICL材料可用作伤口覆盖物或者敷料，辅助伤口修复。此外，该材料以扁平、卷曲或 者折叠的方式被植入，用于组织填充和互补。在构建体中包括大量ICL片层，用于填充 或者强度指示。在植入前，进一步对片层进行处理，或者包裹上胶原或其他细胞外基质 成分、透明质酸、肝素、生长因子、肽或经培养的细胞。提供如下实施例来更好地阐述本发明的实施，无论如何不应将它们解释为用来 限制本发明的保护范围。可以预期，在组成、形状和厚度方面对装置进行的设计可以根 据构建体的最终指标来选择。本领域技术人员将意识到，在不背离本发明的精神和保护 范围的情形下，可以对在此描述的方法进行各种改进。实施例实施例1 对机械清洁的猪小肠讲行化学清洁收集猪小肠，并使用Bitteriing刮肠器(Nottingham，UK)进行机械剥离，该设备
通过将机械作用与用水洗涤组合，从粘膜下层上强力除去脂肪、肌肉和粘膜片层。机械 作用被描述为当完整的肠子通过一系列的辊子时，该辊子挤压并从粘膜下层上剥下相继 的层。小肠的粘膜下层比周围组织硬，辊子将较软的成分从粘膜下层上挤压掉。机械清 洁的结果使得仅保留肠子的粘膜下层。在无菌的室温条件下实施剩下的操作，按照Abraham等人的PCT申请号WO 98/49969中描述的化学清洁，该文献的公开内容在此被引入作为参考。所有化学溶液都 在室温下使用。沿着肠道内腔的纵向方向切开肠子，然后切成15cm切片。对材料进行 称重，并以溶液与肠道材料约100 lv/v的比例将其放置到容器中。往各个含有肠子的容器中加入约1L用0.22 y m(微米)滤器灭菌的100mM乙二 胺四乙酸钠(EDTA)/10mM氢氧化钠(NaOH)溶液。然后，将容器放在摇台上，在约 200rpm下放置约18小时。摇晃后，从各容器中除去EDTA/NaOH溶液。然后，往各个容器中加入约1L用0.22iim(微米)滤器灭菌的1M盐酸(HC1)/1M 氯化钠(NaCl)溶液。然后，将容器放在摇台上，在约200rpm下放置约6 8小时。摇 晃后，从各容器中除去HCl/NaCl溶液。然后，往各个容器中加入约1L用0.22iim滤器灭菌的1M氯化钠(NaCl)/10mM 磷酸缓冲生理盐水(PBS)。然后，将容器放在摇台上，在约200rpm下放置约18小时。 摇晃后，从各容器中除去NaCl/PBS溶液。然后，往各个容器中加入约1L用0.22iim滤器灭菌的lOmMPBS。然后，将容器放在摇台上，在约200rpm下放置约2小时。摇晃后，从各容器中除去磷酸缓冲的生理 盐水。最后，往各个容器中加入约1L用0.22 ym滤器灭菌的水。然后，将容器放在摇 台上，在约200rpm下放置约1小时。摇晃后，从各容器中除去水。将经加工的ICL样本切割和固定，用于组织学分析。对对照和经处理的组织的 横截面和纵切面样本进行苏木精-伊红染色(H&E)以及Masson三色染色。经加工的ICL 组织样本显示不含有细胞和细胞碎片，而未经加工的对照样本正常地并且如期望地存在 很多细胞。单层ICL材料可作为单层使用或者用于制备粘合的多层构建体、管状的构建体 或者具有管状的和扁平的几何学特征的复杂构建体。实施例2 制作多层ICL构津体的方法将按照实施例1的方法处理的ICL用于制备具有双层ICL的多层构建体。将 无菌的多孔聚碳酸酯薄片(孔径大小，生产商)放置在层流室的无菌场中。用无菌 TEXWIPES (LYM-TECH Scientific，Chicopee，MA)擦拭 ICL，从该材料上吸掉多余
水分。从ICL材料的内腔反面除去淋巴附属物，然后剪切成长约6英寸的切片(约 15.2cm)。将第一个经修理的ICL薄片放置在聚碳酸酯薄片上，粘膜面朝下，手工除去任 何气泡、折叠和皱褶。将第二个经修理的ICL薄片放置在上面，朝向第一个薄片的内腔 反面，使第二个薄片的内腔反面接触第一个薄片的内腔反面，再手工除去气泡、折叠和 皱褶。将具有ICL片层的聚碳酸酯薄片以一定角度竖起，使得ICL层面对从层流室吹来 的气流。在约20°C的室温下，将层在腔室中干燥约18士2小时。将干燥的ICL层一同 从聚碳酸酯薄片上剥离下来，而不使它们分开或分层，转移到在室温下的水浴中，使层 水合约15分钟。由于EDC随着时间推移会失去活性，在交联之前立即制备100mMEDC/50%丙 酮的化学交联溶液。将经水合的层转移到浅盘中，轻轻地将交联剂倒入盘中，确保层被 覆盖并且不漂浮，使得在构建体下方或中间没有气泡。将盘子盖上，并在通风橱中放置 约18士2小时。倒出交联溶液并弃去。在盘中用无菌水冲洗构建体三次，每次冲洗约5 分钟。用解剖刀和尺子，将构建体修理成期望的尺寸。按照US5,460,962，将构建体用经氢氧化钠ION NaOH中和的无菌0.1 %过乙酸 (PA)处理而净化，该文献的公开内容在此被引入。将构建体放置在lLNalge容器中，在 摇台上净化约18士2小时。将构建体用三倍体积的无菌水洗涤10分钟，用Minncare条 带试验监控PA活性，确保从构建体中除去它。然后，用真空封口机将构建体包装在塑料袋中，接着放在密封袋中，进行 25.0 35.0kGy伽马射线照射。实施例3:抑菌试验本实施例的目的在于阐述如何检测加入到单层构建体中的抗微生物物质的有效 量，该有效量提供微生物屏障以及微生物杀灭剂。单层构建体是从由按照实施例1中公 开的方法制备的源于猪肠道粘膜下层(ICL)的经加工的组织材料制备得到的。数种抗微 生物物质被应用于ICL，将它们溶解或悬浮在如下溶液中1.0.5%硝酸银溶液
2.1%硝酸银溶液3.溶于异丙醇(IPA)中的1-2%纳米晶体银溶液4.溶于1XPBS中的1-2%纳米晶体银溶液5.溶于磷酸缓冲生理盐水溶液中的1-2%聚六亚甲基双胍(PHMB)6.溶于纯净水中的1-2%聚六亚甲基双胍(PHMB)将化学清洁的ICL切割成4cmX 6cm的切片，将水合的或脱水的各个切片放置到 约100mL的各种溶液中过夜。从各溶液中取出经加工的ICL并干燥。将未经加工的ICL 样本用作对照。从各个样本切片中剪切出圆形切片。用细菌在琼脂平板上划线。将样 本放置在平板上，并培育24小时来观察。在IPA中制备的纳米晶体银(N.S.)溶液完全分散并停留在溶液中，但是在 1XPBS中的N.S.不停留在溶液中并且在将该溶液添加到ICL之前需要摇晃。将TPA蒸 发过夜，并且TPA十分均勻地分布在水合和脱水的ICL薄片上，脱水的薄片保持较为固 定的形状，并且更容易处置。两种薄片都变为碳黑色。ICL朝向盘子的侧面似乎不影 响ICL的包被，或者也不影响该材料产生大抑菌圈(ZOI)的效率。N.S.产品产生最佳的 ZOI，并在4天后也产生不允许细菌生长到24小时ZOI中的ZOI，如同一些其他样本那 样。尽管硝酸银样本的ZOI比N.S.小，但是比其他的大，已经报道的硝酸银的毒性并不 必然地使得其是ICL的理想添加剂。硝酸银的已知抗微生物性能使得可以将N.S.与硝酸 银相比，N.S.的效率超过硝酸银。两种PHMB溶液似乎是相当的，但是在浸泡后ICL并不相同。PBS溶液在ICL上 留下不均勻的盐残留，而WFI溶液没有使ICL具有明显改变。两者都产生类似的ZOL。 它们都较小，并且并不以与N.S.ZOI相同的方式产生ZOI。纳米晶体银和PHMB被发现是有效的抗微生物剂，可应用于ICL构建体，它们 在该试验中的杀菌作用证明了这一点。实施例4 =对含有抗微生物的纳米晶体银或PHMB的胶原构建体进行的处理制备叠加的双层ICL构建体(叠加并交联)，然后用一种抗微生物剂处理，来生 产具有抗微生物性能的双层构建体。按照实施例2制备12种双层的ICL构建体，每种大小为约9cmX9cm。在制 备中，将这些ICL构建体用10mMEDC/0.1MMES[2-(N-吗啉代)乙磺酸](Pierce， Rockford, IL)缓冲液交联16 20小时，然后在无菌过滤水中冲洗3次，每次30分钟。 然后，用一种抗微生物剂处理所制备的构建体。将抗微生物剂制备成溶液或分散体。将10g、l.Og、O.lg、O.Olg。O.OOlg纳米 晶体银(纳米技术(Ag-20)或等价物，Austin，TX)与1L悬浮剂异丙醇(无菌过滤水 也是可接受的悬浮剂)混合，制备五种纳米晶体银分散体。将Cosmocil CQ (20% PHMB 溶液，ArchChemicals，Inc., Norwalk, CT)与 RODI/WFI 混合，来制备 0.2%、0.1%、 0.02%, 0.002% PHMB 溶液。为了用抗微生物剂包被层压和交联的构建体，将经水合处理的构建体放置在 9.5cmX9.5cm盘子中。将50mL各种试剂轻轻倒入盘中，将盘子放置在摇台上。包被时 间为10秒、1小时、3小时和过夜(约18小时)。在设定的时间结束时，允许样本在聚 碳酸酯薄片上，在生物安全层流室的无菌气流中干燥，干燥达到10 20%相对湿度。
生成的构建体是层压的、交联的双层TCL构建体，并用一种抗微生物剂处理 过，使该构建体具有抗微生物的性质。棚列5:龍腿制本慰，ffl〒吿丨丨 作双层的抗微牛物构津体制备单层的ICL构建体，交联，并用一种抗微生物剂处理，然后层压形成双层 构建体，来制备具有抗微生物性质的双层加工的组织基质构建体。在用抗微生物剂处理 之后，将构建体层压，从而将抗微生物剂掺入到经加工的组织基质的片层之间。按照实施例1制备ICL，将其铺展在聚碳酸酯薄片上，并除去淋巴附属物。将 薄片剪切成大小为约10cmX9cm。将各个ICL切片放在10mM EDC/0.1M MES[2_ (N-吗 啉代)乙磺酸](Pierce，Rockford, IL)缓冲液中交联，每26个薄片使用2升溶液，并在 设定值为4的摇台上搅拌16-20小时，然后在至少2L无菌过滤水中洗涤三次，每次30分 钟。将抗微生物剂配制成溶液或分散体。通过将l.Og、O.lg、O.Olg纳米晶体银 (Nanotechnologies(Ag-20)或等价物，Austin，TX)混合在1L分散剂，例如异丙醇(无菌 过滤水也是可接受的分散剂)中而制备了三种纳米晶体银分散体。将COSmOcilCQ(20% PHMB 溶液，ArchChemicals，Inc.Norwalk, CT)与 RODI/WFI 混合，制备了 0.2%、 0.1%, 0.02% PHMB 溶液。用抗微生物剂包被ICL，将薄片放置在125ml无菌的方形容器中(Nalgene)，每 个容器含有四个薄片。往各个容器中倒入lOOmL含有抗微生物剂的溶液或分散体，浸没 该构建体。在旋转式摇动器平台上搅拌容器，使ICL保持浸没3-6小时。将经抗微生物处理的ICL叠加来制备构建体。将经加工的ICL薄片平铺到聚碳 酸酯薄片上，然后将第二个经加工的ICL薄片直接放置在上方，覆盖在第一层上，在层 之间没有气泡。然后将包括构建体的聚碳酸酯薄片放在生物安全层流室的无菌气流中， 至少干燥12小时，达到10-20%的相对湿度。制备得到的构建体是双层的ICL构建体，该构建体已经被交联，并且被一种抗 微生物剂处理以具备抗微生物性能，经过层压使得不仅在构建体的表面而且在构建体的 片层之间都掺有抗微生物剂。实施例6 对含有抗微生物的纳米晶体银的双层胶原构建体进行处理制备(层压并且交联的)层压的双层ICL构建体，然后用一种抗微生物剂处理， 以生产具有抗微生物性能的双层构建体。按照实施例2，制备12种双层ICL构建体，每种大小为约35-40cmX9cm。在 制备过程中，将ICL构建体用10mM EDC/0.1M MES[2_(N_吗啉代)乙磺酸](Pierce, Rockford, IL)缓冲液交联16-20小时，然后在无菌过滤水中冲洗30分钟。然后，将所 制备的构建体用一种抗微生物剂处理。将抗微生物剂制备成分散体。将10.0g、5.0g、l.Og纳米晶体银 (Nanotechnologies(Ag-20)或等价物，Austin，TX)与1L异丙醇混合来制备三种纳米晶
体银分散体，异丙醇作为纳米晶体银的分散剂(无菌过滤水也是可接受的分散剂)。为了用一种抗微生物剂包被构建体，将薄片放置在1L无菌的方形容器 (Nalgene)中，每个容器含有四个薄片。往各个容器中倒入200mL含有抗微生物剂的溶液或分散体，浸没该构建体。将容器在旋转式摇动器平台上搅拌，使ICL保持浸没3-6小 时。将已经与纳米晶体银分散体接触的构建体在1L无菌过滤水中洗涤一次。将经抗微 生物处理的构建体平铺在聚碳酸酯薄片上，在生物安全层流室的无菌气流中至少干燥12 小时，达到10-20%的相对湿度。制备得到的构建体是双层的ICL构建体，该构建体已经被层压和交联，并用一 种抗微生物剂处理过而赋予其抗微生物性能。棚列7: X寸■腿射勿傭狐■測 于制作双层的抗微牛物构津体制备交联的单层ICL构建体，交联并用一种抗微生物剂处理，然后层压而形成 一种双层构建体，来制备具有抗微生物性能的双层构建体。在用抗微生物剂处理后，对 构建体进行层压处理，通过包被外表面，有可能将更多的抗微生物剂掺入到构建体中， 并且抗微生物剂存在于构建体的片层之间。按照实施例1制备ICL。然后将ICL覆盖在聚碳酸酯薄片上，35_40cm长X9cm 宽，除去淋巴附属物。将各个薄片用10mMEDC/0.1MMES[2-(N_吗啉代)乙磺酸] (Pierce, Rockford, IL)缓冲液交联，每30个薄片使用3升溶液，并在设定值为4的摇台 上搅拌16-20小时，然后在3-5L无菌过滤水中冲洗三次，每次30分钟。将抗微生物剂制备成分散体。将lO.Og、5.0g、l.Og纳米晶体银 (Nanotechnologies(Ag-20)或等价物，Austin，TX)与1L分散剂，如异丙醇混合，还将 5.0g纳米晶体银溶于1L RODI中，来制备四种纳米晶体银分散体。为了用一种抗微生物剂包被ICL，将ICL薄片放置在250mL无菌容器(Nalgene) 中，每个容器含有四个薄片。往各个容器中倒入200mL含有抗微生物剂的溶液或分散 体，浸没该构建体。将容器在旋转式摇动器平台上搅拌，使ICL保持浸没3-6小时。将 已经与纳米晶体银分散体接触的ICL在1L无菌过滤水中洗涤一次。将经过抗微生物处理的ICL层叠来制备双层构建体。将经加工的ICL薄片平铺到 聚碳酸酯薄片上，然后将第二个经加工的ICL薄片直接放置在上方，覆盖在第一层上， 在片层之间没有气泡。然后将包括构建体的聚碳酸酯薄片放在生物安全层流室的无菌气 流中，至少干燥12小时，达到10-20%的相对湿度。所得到的构建体是双层的ICL构建体，该构建体已经被交联，并用一种抗微生 物剂处理以赋予其抗微生物性能，然后经过层压使得在构建体的片层之间掺入更多抗微 生物剂。实施例8 交联和预层压后包被制备交联的单层ICL构建体，并且交联，然后用一种抗微生物剂处理，然后层 压而形成一种双层构建体，从而制备具有抗微生物性能的双层构建体。在用抗微生物剂 处理后，对构建体进行层压处理，在ICL片层之间掺入了更多的抗微生物剂。将ICL薄片覆盖在聚碳酸酯薄片上，除去淋巴附属物，该薄片为约35-40cm 长X9cm宽。将各个薄片用10mM EDC/0.1M MES[2_(N_吗啉代)乙磺酸](Pierce， Rockford, IL)缓冲液交联，每30个薄片使用3升溶液，并在设定值为4的摇台上搅拌 16-20小时，然后在3-5L无菌过滤水中冲洗三次，每次30分钟。将抗微生物剂配制成溶液或分散体。将5.0克纳米晶体银
25(Nanotechnologies(Ag_20)或等价物，Austin，TX)混合在1L分散剂RODI中，来制备 纳米晶体银分散体。将5.0mL Cosmocil CQ (20% PHMB溶液)与1000mL RODI/WFI混 合，制备0.1% PHMB溶液。为了用PHMB试剂包被ICL，将28-30个ICL薄片放在洁净的5LPyrex玻璃瓶
中。加入3000mL0.1%PHMB溶液。将容器在旋转式摇动器平台上搅拌，使ICL保持 浸没3-6小时。为了用纳米晶体银分散体包被ICL，将200mL分散体加入到250mL无菌容器 (Nalgene)中。将四个ICL薄片放入各个容器中并搅拌3-6小时。与纳米晶体银分散体 接触的ICL在250mL RODI洗涤15分钟一次，并在500mL RODI洗涤一次至少5分钟， 直到进行层压处理。对与PHMB溶液接触的ICL不进行洗涤。将经抗微生物处理的ICL叠加来制备双层构建体。将经加工的ICL薄片平铺到 聚碳酸酯薄片上，然后将第二个加工的ICL薄片直接放置在上方，覆盖在第一层上，在 片层之间没有气泡。然后将包括构建体的聚碳酸酯薄片放在生物安全层流室的无菌气流 中，至少干燥12小时，达到10-20%的相对湿度。制备得到的构建体是双层的ICL构建体，该构建体已经被交联，并且被一种抗 微生物剂处理过以赋予其抗微生物性能，经过层压使得在构建体的片层之间掺入了更多 抗微生物剂。棚列9 荆介二#腦物髓X押氧龙■髓■■細贿(MRSA) 在部分厚度伤口樽型中增殖的影响检测三种抗微生物敷料对部分厚度伤口的抗菌活性，该伤口寄居有甲氧苯青霉 素抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。由于猪皮肤与人皮肤在形态学上相似，因此使用猪作为试验动物。猪重约 25-30kg，在开始试验之前将猪在圈中饲养两周。给猪随意饲喂基础饲料，并在猪圈中单 独饲养(遵照USDA的要求)，控制温度(19-21°C )和光照(12h/12h光/暗)。肌肉注 射Telaz0l(5mg/kg)、甲苯噻嗪(2mg/kg)、阿托品(0.05mg/kg)并吸入异荧烷和氧气的混 合气来麻醉猪。用标准的动物剪毛机剪去猪背部的毛发。将猪背部两侧的皮肤用无抗菌 素的肥皂(Ncutrogcna )和无菌水洗涤。用无菌纱布将猪拭干。用专业电动角质切刀 在背部皮肤上造36个部分厚度伤口(10X7X0.3mm)。然后在伤口上接种甲氧苯青霉素 抗性金黄色葡萄球菌ATCC 33593。为了制备细菌接种物，可使用直接从美国典型培养物保藏中心(ATCC)， Rockville, Maryland获得的病原性分离物的新鲜培养物。接种物是甲氧苯青霉素抗性金 黄色葡萄球菌ATCC 33593。通过ATCC标准回收操作，收集冻干细菌培养物。将培养 板上的过夜生长的培养物刮到5ml常规生理盐水中，直到悬浮液的混浊度与MacFariand #8混浊度标准相同，来制备所有的接种物悬浮液。这将获得约108的克隆形成单位/ ml(CFU/ml)的悬浮浓度。将108的悬浮液连续稀释而制得浓度为约106CFU/ml的接种 物悬浮液。将少量接种物悬浮液覆盖到培养液上，量化活生物体的精确浓度。用接种物 悬浮液直接接种各个伤口部位。将0.025ml (25 iU)悬浮液等分试样添加到位于各个伤口 中央的无菌玻璃杯(直径22mm)中。用无菌特氟伦刮刀将悬浮液在各个检测部位上轻轻 涂抹10秒钟，并干燥3分钟。在接种后10分钟内，用聚亚胺酯膜敷料覆盖所有接种伤
26口，24小时后开始处理，给予细菌以定居伤口的时间。再造三个伤口，进行接种以在开始处理之前获得基线CFU/ml:接种物Log 4.24CFU/mL ；基线计数Log 5.38CFU/mL。按照如下试验设计，对六个伤口进行各种 处理。每日监控动物受试者是否存在任何可观察到的疼痛或不适的迹象。为了有助于使 可能的不适最小化，在整个试验过程中使用一种止痛剂(duragesic-芬酞尼经皮系统，其 以25i!g/hr洗提)1)敷料A是按照实施例8制备的经PHMB处理的双层构建体2)敷料B是按照实施例8制备的经双层纳米晶体银处理的构建体3)敷料C是按照实施例8制备的经纳米晶体银处理的单层构建体4)对照(石油纱布或聚亚胺酯膜)5)阳性对照(竞争性抗微生物的敷料或者抑菌油膏)6)未经加工的、暴露于空气的对照将除了未经处理组外的其他所有处理组用聚亚胺酯膜覆盖(与sponsor —致)。 将处理组随机分为1、2、3、4、5或6区。每天总共对每个处理组的三个伤口进行评价。在处理后的24小时和72小时，对各个处理组的三个伤口进行培育。在各个取 样时间点，对部位进行定量地培育。每个部位仅培育一次。该区域被无菌玻璃杯(外 径22mm)包围，将玻璃杯用两个手柄固定在适当位置上。用移液枪将1ml涂抹液加到 玻璃杯中，用无菌特氟伦刮刀涂抹该部位30秒钟。制备一系列稀释液，用Spiral Plater System对涂抹液进行量化，该系统将少量确定量的(40 iU)悬浮液滴加到旋转琼脂平板的 表面上。让MRSA在选择性培养液中生长，该培养液用Mueller Hinton琼脂、4%NaCl和 eyg/ml苯唑西林配制。由于苯唑西林配制更为稳定，用它替代甲氧苯青霉素。在培育 期(24小时)后，对平板上的菌落进行计数，计算每毫升的菌落形成单位(CFU/ml)。将该试验结果提供在表1中。结果表明双层PHMB、双层纳米晶体银，以及单
层纳米晶体银能够有效地从伤口中根除细菌。
权利要求
1. 一种生物工程化的胶原构建体，其包括一层源于小肠粘膜下层的纯化的胶原组 织基质，所述纯化的胶原组织基质已经被一种抗微生物剂处理过，其中该构建体是生物 相容的，并且当被应用于创面床时促进组织生长。
2.权利要求1的生物工程化的胶原构建体，其中所述构建体是有网孔的、有窗的或 者被穿孔的。
3.权利要求2的生物工程化的胶原构建体，其中网孔的网孔比例是1 1.5。
4.权利要求1的生物工程化的胶原构建体，其中所述抗微生物剂选自纳米晶体银和 PHMB。
5.权利要求1的生物工程化的胶原构建体，其中采用交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨 基丙基)碳化二亚胺盐酸盐将所述构建体化学粘合。
6.权利要求1的生物工程化的胶原构建体，其中所述构建体具有在约0.05mm到约 0.07mm之间的厚度。
7.权利要求1的生物工程化的胶原构建体，其中构建体是可生物重塑的。
8.生物工程化的胶原构建体，包括双层或多层经化学粘合的用抗微生物剂处理的 加工的组织材料层，其中当将构建体植入哺乳动物患者的创面床时，构建体发生受控的 生物降解，伴随发生足够的活细胞替换，使得构建体被患者的活细胞重塑。
9.权利要求8的生物工程化的胶原构建体，其中构建体有网孔的、有窗的或者被穿 孔的。
10.权利要求9的生物工程化的胶原构建体，其中网孔的网孔比例是1 1.5。
11.权利要求8的生物工程化的胶原构建体，其中抗微生物剂选自纳米晶体银和 PHMB。
12.权利要求8的生物工程化的胶原构建体，其中采用交联剂1-乙基-3-(3-二甲基 氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐将所述构建体化学粘合。
13.权利要求8的生物工程化的胶原构建体，其中构建体是生物相容的。
14.权利要求8的生物工程化的胶原构建体，其中加工的组织材料是小肠粘膜下层。
15.制备抗微生物的可生物重塑的假体的方法，该假体具有双层或多层叠加的、粘合 的加工的组织基质层，该方法包括步骤(a)层叠两片或多片水合的加工的组织基质层；(b)使所述的组织层脱水以将所述层粘连在一起；(C)用交联剂交联所述组织层以将所述层粘合在一起；(d)漂洗所述层以除去交联剂；和(e)用一种抗微生物剂处理粘合的层；其中当将假体植入到哺乳动物患者中时，假体发生受控的生物降解，伴随发生足够 的活细胞替换，使得假体被患者的活细胞重塑。
16.制备抗微生物的可生物重塑的假体的方法，该假体具有双层或多层叠加的、粘合 的源于小肠粘膜下层的加工的组织基质层，该方法包括步骤(a)层叠两片或多片水合的加工的组织基质层；(b)使所述的组织层脱水以将所述层粘贴在一起；(c)用交联剂交联所述组织层以将所述层粘合在一起；(d)漂洗涤所述层以去除交联剂；和(e)用一种抗微生物剂处理粘合的层；其中当将假体植入到哺乳动物患者中时，假体发生受控的生物降解，伴随发生足够 的活细胞替换，使得假体被患者的活细胞重塑。
17.制备抗微生物的创伤敷料的方法，该敷料具有单层源于小肠粘膜下层的加工的组 织基质，该方法包括步骤(a)从所述粘膜下层中纯化组织基质；(b)用一种抗微生物剂处理所述组织基质，其中当创伤敷料被应用于伤口时，它维持 湿润的伤口环境以促进伤口中的皮肤组织再生。
18.权利要求15、16或17的方法，其中创伤敷料是有网孔的、有窗的或者被穿孔的。
19.一种处理伤口的方法，包括步骤(a)清洁伤口和伤口周围的区域；(b)应用抗微生物的创伤敷料，该敷料包括用一种抗微生物剂处理的源于小肠粘膜下 层的纯化的胶原组织基质。
20.权利要求19的方法，其中抗微生物的创伤敷料是有网孔的、有窗的或者被穿孔的。
21.—种处理伤口的方法，包括步骤(a)清洁伤口和伤口周围的区域；(b)将选自自体移植物、同种异体移植物或者培养的皮肤构建体的皮肤替换物应用到 皮肤；和(C)将包括用一种抗微生物剂处理的源于小肠粘膜下层的纯化的胶原组织基质的抗微 生物的创伤敷料应用到所述的皮肤替换物。
22.权利要求21的方法，其中所述的皮肤替换物是有网孔的、有窗的或者被穿孔的。
23.权利要求21的方法，其中所述的抗微生物的创伤敷料在应用于伤口之前被网状化。
24.权利要求21的方法，其中所述伤口选自由部分或完全厚度伤口、压迫溃疡、静 脉溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道伤口、地雷伤口、外科手术伤口、用于自体 移植的供体部位伤口、Moh氏手术后伤口、激光手术后伤口、伤口开裂、外伤伤口、擦 伤、破口、二度烧伤、皮肤撕裂以及流液型伤口组成的组。
25.修复或替换受损组织的方法，包括下列步骤在患者中植入假体，所述方法包括 双层或多层叠加的粘合的采用一种抗微生物剂处理的胶原材料层，其中当将假体植入到 哺乳动物患者中时，假体发生受控的生物降解，伴随发生足够的活细胞替换，使得被植 入的假体被患者的活细胞重塑。
26.权利要求25的方法，其中所述假体包括2 5个源于小肠粘膜下层的加工的肠道 胶原薄片，所述薄片被用浓度为0.1 IOOmM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化 二亚胺盐酸盐粘合和交联在一起。
27.权利要求25的方法，其中所述假体是疝气修复补片、股疝修复塞子、心包补片、膀胱吊索、子宫吊索、心脏内补片、心脏瓣膜替换物、血管补片、纤维环板层修复 塞子、修复纤维环板层补片、轴转肌修复假体、硬脑膜修复补片、膀胱膨出修复装置、 后肠腔修复装置、阴道拱顶下垂修复吊索、整形手术植入物。
28.权利要求21的方法，其中需要修复的受损的或患病的软组织用于处理腹壁和胸 壁的缺陷、肌肉翻转加固、直肠和阴道下垂、骨盆底重构、疝气、缝合线加固和重构操 作。
29.改性的肠道胶原层，其包括源于小肠粘膜下层的肠道胶原层，所述胶原层已经被 一种抗微生物剂处理过。
30.权利要求29的改性的肠道胶原层，其中所述抗微生物剂是纳米晶体银。
31.权利要求30的改性的肠道胶原层，其中纳米晶体银没有原子杂乱。
32.权利要求29的改进的肠道胶原层，其中所述抗微生物剂是PHMB。
33.经加工的组织基质，其包括基本上不含有非胶原成分的哺乳动物细胞组织，所述 经加工的组织基质已经被一种抗微生物剂处理过。
34.权利要求33的经加工的组织基质，其中所述抗微生物剂是纳米晶体银。
35.权利要求34的经加工的组织基质，其中纳米晶体银没有原子杂乱。
36.权利要求33的经加工的组织基质，其中所述抗微生物剂是PHMB。
全文摘要
本发明提供具有抗微生物性能的生物工程化的胶原构建体。该生物工程化的胶原构建体包含片状的源于组织如小肠组织粘膜下层的纯化的胶原组织基质层或源于小肠组织粘膜下层的加工的肠道胶原层，它们被抗微生物剂处理过。该构建体是生物相容的。本发明具有多种用途，包括创伤敷料和外科修复装置。本发明还提供用于处理受损或患病的软组织的方法。本发明还公开了对需要护理和治疗的创伤进行处理的方法。
文档编号A61F2/00GK102014790SQ200680047281
公开日2011年4月13日 申请日期2006年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者A·J·尼克松, G·A·阿布拉汉 申请人:器官发生有限公司