一种噬菌体展示随机肽库的构建方法
【专利摘要】一种噬菌体展示随机肽库的构建方法，所述方法采用NNK编码方式，将编码随机肽库的两条链经退火、延伸补平、双酶切后，与经同样双酶切的5’去磷酸化载体连接，电转TG1感受态细胞。扩增菌液后进行库容和多样性检验。利用该肽库筛选获得的肽段序列，通过测序分析即可得到与药物特异性结合的外源蛋白或多肽。该技术广泛应用于抗原表位的模拟和蛋白、核酸结合特性的研究，同时在药物筛选和疫苗研制方面也有广泛的应用。
【专利说明】一种噬菌体展示随机肽库的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学及生物制药技术范畴，特别涉及一种噬菌体展示随机肽库的构建方法。
【背景技术】
[0002]卩遼菌体展不技术(phagedisplay technology)是由Smith于1985年创建，于20世纪90年代发展起来并得到广泛应用的新技术。基本原理是噬菌体作为一种表达载体，可以将外源蛋白或多肽呈现在噬菌体表面，利用外源蛋白或多肽与待筛选药物的特异性亲和作用，通过吸附-洗脱-扩增的筛选富集过程，将表达与药物特异性结合的外源蛋白或多肽的噬菌体大量富集，然后通过测序分析即可得到与药物特异性结合的外源蛋白或多肽。目前该技术已经广泛应用于抗原表位的模拟和蛋白、核酸结合特性的研究，同时在药物筛选和疫苗研制方面也有广泛的应用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种噬菌体展示随机肽库的构建方法。其特征在于，所述噬菌体展示随机十五肽库的构建方法为:
[0004]I 载体(图1)
[0005]采用噬菌粒pCANTAB5E (见图1)，pCANTAB5E含有SfiI和NotI两个酶切位点，可以将外源目的基因通过酶连反应重组进入噬菌粒载体。
[0006]2文库构建
`[0007]构建文库多为6~16肽，我们选择构建15肽库，采用NNK编码方式，N代表任意核苷酸，K代表G或T，可指导合成全部20种氨基酸。将编码随机肽库的两条链经退火、延伸补平、双酶切后，与经同样双酶切的5’去磷酸化载体连接，电转TGl感受态细胞。
[0008]3随机肽库库容和多样性检验
[0009]取I μ I从平板上刮下来的TGl肽库菌液，梯度稀释后涂布SOB平板，计算库容。随机挑取20个克隆进行测序，对其多样性进行检验。
[0010]本发明的有益效果是所构建的肽库为噬菌体展示随机肽库，噬菌体展示技术研发模式更高效，耗成本更低，并能定向设计出结构更优化的新药。对于药物与蛋白作用的研究，在病理学、药理学等诸多方面具有重要意义。利用噬菌体表面展示技术构建相应的蛋白质或多肽文库，以此导向、跟踪，从复杂提取物中找出有效部位或成分，再进行动物试验，可收到事半功倍的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为PCANTAB5E载体的限制图谱和多克隆位点。
[0012]图2为PCR扩增的编码15肽的双链DNA片段，图中M为DL2000，I为目的DNA片段。[0013]图3为PCR扩增的重组载体中的目的片段，图中M为DL2000，I~10为PCR扩增
的结果。
【具体实施方式】
[0014]本发明提供一种噬菌体展示随机肽库的构建方法，所述肽库的构建方法结合附图和实施过程以说明。
[0015]I实验材料:
[0016]E.coli TGl:由中国药科大学生物制药教研室保存，Ε.coli TGl:supEhsdΔ5thiΔ (lac-proAB)F， [traD36proAB+lacIq IacZΔΜ15]。
[0017]噬菌粒PCANTAB5E，由中国药科大学生物制药教研室保存。
[0018]DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自Fermentas公司；碱性磷酸酶CIAP购自TaKaRa公司;限制性内切酶Sfi1、NotI购自NEB公司。
[0019]Plasmid Miniprep kit I, Gel/PCR Extraction kit 购自 Biomiga 公司。
[0020]2噬菌体展示随机十五肽库的构建
[0021]2.1线性化载体的制备
[0022]提取pCANTAN5E质粒，Sfi1、NotI进行双酶切，利用Biomiga胶回收试剂盒回收酶切产物，CIAP酶进行去磷酸化处理。在Eppendorf管中加入适量酶切产物，缓冲液及CIAP酶，去离子水补充至50 μ 1，`混匀后37°C水浴30min，再50°C水浴30min，去磷酸化产物用PCR产物回收试剂盒进行纯化，去离子水洗脱后，-200C。
[0023]2.2编码15肽的随机DNA片段的制备
[0024]根据载体上Sfil、NotI酶切位点情况及构建随机肽库的要求，设计两条寡核苷酸片段，
[0025]链1:5, -GCTGGCCCAGCCGGCC(SfiI)(NNK) 15TAAGCGGCCGC
[0026](NotI)AGGTGCATT-3丨，其中N代表A、T、C、G四种碱基，K代表T、G两种碱基。在Y和:V端引入Sf i 1、NotI酶切位点，用下划线表示。链2:5' -AATGCACCTGCGGCCGCTTA-3'与链I的3'端互补，寡核苷酸链由上海生工生物工程有限公司合成。
[0027]在一Eppendorf 管中加入 10X 退火 Buffer5 μ I, 20mmol/ml 的 DNA 单链各 2 μ I,
2.5mmol/ml 的 dNTPl μ 1，Taq 酶 I μ 1，ddH20 加至 50 μ I。
[0028]PCR扩增条件:94°C预变性 4min ；94°C,lmin ；55°C,30s ;72°C，lmin，共 30 个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0029]将退火延伸的随机片段经Sfil、NotI双酶切，用PCR回收试剂盒回收目的条带。
[0030]2.3连接及连接产物的回收处理
[0031]对酶切回收的载体与插入片段进行紫外定量，线性化载体与插入片段按1: 3，I: 5,1: 7,1: 10进行连接，确定最佳连接比例为1: 7。用不同浓度的连接产物进行转化以确定最佳转化产物量为0.1 μ g(5 μ I)。利用PCR产物回收试剂盒纯化连接产物以除去连接酶和离子。
[0032]2.4电转化
[0033]有关电转化感受态细胞的制备见分子克隆实验指南(第三版)，取5 μ I精制的连接产物与50 μ I电转感受态细胞轻柔混匀，冰浴I~2min，置于预冷的孔隙为0.1cm的电转杯，进行电转。电转仪参数为1.3KV，25yF，200Q。电击后，加入Iml SOC培养基，37°C，200rpm振摇45~50min。取少量菌体适量稀释后涂布SOB (含50 μ g/ml Amp)小平板(直径IOcm)，其余8000rpm离心3min后涂布SOB (含100 μ g/ml Amp)大平板(直径15cm)，37°C倒置培养12~16h，以小平板进行计数，大平板上的菌落用LB培养基溶解，并用涂布棒均匀刮下来，加甘油至终浓度20%，分装成小管，-70°C冻存。
[0034]2.5序列测定及分析
[0035]随机挑取若干原始细菌克隆，各提取重组质粒，并对重组质粒进行PCR验证，设计PCR 验证引物:上游引物 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3' (M13R)，下游引物 5' -GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3丨(S6)(上海生工生物技术服务有限公司)。PCR阳性的重组质粒，将其测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，并对构建的随机肽库的寡核苷酸的随机性、库容及丰度进行评价。
[0036]3文库的库容及多样性评价
[0037]载体与插入片段摩尔比为1: 7，取5μ1精制的连接产物进行电转，原库容为1*106,转化效率为l*107cfu/y g DNA。将多次转化合并后,库容为5*108,满足用于筛选的需要。
[0038]从肽库中随机挑取20个克隆，进行序列测定(表1)。结果显示(表2)，四种核苷酸的出现情况与预先设计的NNK相符，第一、第二核苷酸分别为A/T/G/C中的任一种，其中每一种核苷酸和出现的频率的理论值为25%，第三位核苷酸为G/T中的任一种，G或T的出现频率为50%。实际值与理论值存在一定的偏差，可能是由于样本较小的缘故，随着测序样本的增加，这种差异将逐渐减小。
[0039]上述结果表明，所构建的噬菌体随机肽库不论从基本框架，还是从库容及多样性方面均满足设计要求。
[0040]表1 15肽库随机挑选克隆核苷酸的插入与对应的氨基酸序
[0041]序号序列
【权利要求】
1.一种曬菌体展不随机肽库的构建方法,包括: (1)采用NNK编码方式，其中N代表任意核苷酸，K代表G或T，可指导合成全部20种氨基酸。将编码随机肽库的两条链经退火、延伸后进行双酶切； (2)将载体经与(I)同样的双酶切后，进行5’去磷酸化； (3)将(I)获得的随机序列与(2)获得的脱磷酸载体进行连接，电转TGl感受态细胞构建随机肽库； (4)取扩增后的TGl肽库菌液，梯度稀释后涂布SOB平板，计算库容。随机挑取克隆进行测序，对其多样性进行检验。
2.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述文库构建为噬菌体展示随机6-16肽库。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤(1)中所采用的载体为噬菌粒PCANTAB5E。
4.根据权利要求1-3所述方法构建的噬菌体展示随机肽库。
5.权利要求4所述噬菌体展示随机肽库的用途，其特征在于:利用该肽库筛选获得的肽段序列，通过测序分析即可得到与药物特异性结合的外源蛋白或多肽。该技术广泛应用于抗原表位的模拟 和蛋白、核酸结合特性的研究，同时在药物筛选和疫苗研制方面也有广泛的应用。
【文档编号】C40B50/06GK103806112SQ201310244662
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】张芳, 王筱蒙, 邱郑, 王旻, 徐春蕾 申请人:南京中医药大学