不依赖信号序列的pIX噬菌体展示的制作方法

专利名称：：不依赖信号序列的pIX噬菌体展示的制作方法不依赖信号序列的plX噬菌体展示
背景技术：
：用于蛋白鉴定、表征和修饰的组合方法的使用已经在学术和商业研发中取得了巨大成功。在这方面，丝状噬菌体或噬菌体展示技术已经铺平了第一个文库平台的道路，并依然占据主导技术的宝座。因此，噬菌体展示广泛应用于基础蛋白和应用蛋白的发现以及基于新蛋白的诊断剂和治疗剂的开发中，基于新蛋白的诊断剂和治疗剂是世界范围内增加最迅速的化合物类别。组合噬菌体展示技术的原理是基于每个病毒粒子将在其表面仅展示由其蛋白外壳包裹的基因组编码的完全相同蛋白的性质所提供的基因型-表型关联。噬菌体粒子本身对许多理化条件高度耐受；因此，噬菌体展示与竞争组合技术相比提供在许多筛选方案中的优越通用性。已经使用丝状噬菌体外壳的全部五种结构蛋白实现了异源多肽的噬菌体展示，但只有PlII展示和一定程度上PVIII展示获得了广泛使用(图1)。当异源融合体仅是短肽时，使用基于噬菌体基因组的载体的多价展示系统是优选的，而对于需要折叠结构域的较大融合体而言，大多数应用将受益于噬菌粒系统。在后一情况下，截至目前，抗体-PiII噬菌体展示主导该领域，但替代支架即将出现，依然需要发展未来的蛋白工程工具。非常希望的应用是简单地通过噬菌体病毒粒子感染细菌从噬菌体展示文库有效获得高亲和力特异性肽或蛋白结合物而同时依然结合其靶。Endemann和Model，1995(PMID:7616570)报道了次要外壳plX对融合至其N末端的另一蛋白无功能性。因此，该报道得出PlX不能用于噬菌体展示的结论。Gao等人(PMID10339535、12239343和W00071694)和Khalil等人(PMID17360403)二者后来显示，当从噬菌粒表达并与信号序列依赖性周质靶向组合使用时，允许N末端plX融合体展示。在这些系统中，由于在噬菌粒拯救时从辅助噬菌体基因组提供wtPlX而发生补充。W00071694图2A(未插入融合蛋白)和TO0071694图2B(插入融合蛋白)中公开的噬菌粒清楚地包含PelB信号序列(图文字在第7页，第2-14行)。如上所述，之前已经表明，PlX对融合至N末端的另一蛋白无功能性，并且Gao等人提出其成功的单独的两个可能原因或两者组合。一个可能的原因是原核前导序列(信号序列)N末端连接至融合蛋白，由此保证重组蛋白靶向周质空间，并从而防止在胞质中的累积。另一个可能的原因是，如根据Endemarm和Model，重组蛋白从噬菌粒而非噬菌体基因组表达，因此，来自噬菌粒拯救所必需的辅助噬菌体的野生型PlX补充重组PlX融合蛋白，由此保留了野生型功能性，否则野生型功能性可能由于重组修饰而丧失。S卩，噬菌体将包含野生型蛋白和融合蛋白的混合物。Khalil等人(PMID:17360403)描述了利用双特异性丝状噬菌体病毒粒子特征的应用，其中外源性肽展示在完全相同的病毒粒子的每个远端。他们通过使用普通PlII噬菌体基因组载体补充原核信号序列依赖性PlX展示噬菌粒的组合来实现该目的。在这种情况下，噬菌体基因组载体用作拯救噬菌粒的辅助噬菌体。发明概述本发明的一个目的是提供用于在丝状噬菌体上展示的肽的替代支架。本发明第一个方面是源自丝状噬菌体的PlX融合蛋白，所述融合蛋白不包含原核N末端信号序列并因此直接融合至外源性肽。本发明另一方面涉及编码本发明融合蛋白的核酸。本发明一个方面涉及包含本发明融合蛋白的丝状噬菌体。本发明另一方面涉及丝状噬菌体文库。本发明另一方面涉及包含噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统，其中所述噬菌粒包含编码本发明PlX融合蛋白的核酸。一个方面涉及包含噬菌体展示系统的试剂盒，所述噬菌体展示系统包含噬菌粒和辅助噬菌体，其中所述噬菌粒包含编码本发明pIX融合蛋白的核酸。附图简述图1丝状噬菌体结构的示意图。病毒粒子由包裹单链DNA分子的五种结构蛋白构成。在野生型(wt)噬菌体中，存在大约2700拷贝的pVIII和大约3-5拷贝的四种蛋白pill、pVI、pVII和pIX的每一种，它们存在于病毒粒子的每个末端。病毒粒子大小取决于基因组大小，每个PVIII外壳蛋白大约2.3个核苷酸，因此粒子长度适应插入的pVIII拷贝的增加或减少。值得注意的是，PlII和pVIII结构已经通过χ射线纤维衍射、结晶学和NMR表征。次要外壳蛋白PlII含有被甘氨酸富集区分隔的三个不同的结构域Al(结合TolA)、N2(结合F菌毛)和CT(整合入病毒粒子并且对于正常的病毒粒子装配是重要的)。图2新型pGALD9(A)和pGALD97ΔL(Β)ρΙΧ展示噬菌粒的示意图。两种噬菌粒的载体主链都基于PlII展示噬菌粒pSEX81(SEQIDNO2)，其序列可以根据GenBank登录号Y14584获得，并且构建细节描述于材料与方法。两种噬菌粒可以分别通过Ncol/Hindlll和MluI/NotI部分的简单盒交换而容纳框内(inframe)外源序列的区段(称为El和E2)。所述盒由合成连接体序列连接，合成连接体在本文描述的不同构建体中不同。缩写laCP0，lac启动子；sd，Shine-Dalgarno序列；pelB，细菌果胶酸裂合酶的信号序列；TP，胰蛋白酶位点；t，T7转录终止子。图3从pGALD9AL、pGALD9、pSEX81展示的(A)scFv抗phOx(SEQIDNO:11)和(C)scFv抗NIP的噬菌粒滴度。所有噬菌粒含有氨苄西林抗性标记；因此，滴度显示为每毫升溶液的氨苄西林抗性菌落形成单位(cfuamp7ml)。从pGALD9ΔL、pGALD9、pSEX81展示的(B)scFv抗phOx(SEQIDNO11)和(D)scFv抗NIP的噬菌粒与辅助噬菌体的比显示为噬菌粒滴度(cfuampE/ml)除以辅助噬菌体滴度(CfukanVml)的比。病毒粒子的包装通过超级感染后在不含IPTG(基础表达)或含有终浓度0.ImM的IPTG(IPTG诱导)下的标准噬菌粒拯救来进行，如材料与方法中所描述。图4比较pIX和pill之间带有和不带有信号序列(AL)的功能性(A)scFv抗phOx(SEQIDNO11)和(B)scFv抗NIP(SEQIDNO3)展示的抗原特异性ELISA。ELISA如材料与方法中所述进行，使用100μ1/孔含有病毒粒子的清澈上清液。抗Μ13胃是病毒粒子检测Mab对抗原非特异性吸附和阻断的阴性对照。(C和D)重复A和B中的ELISA，但是在信号饱和之前停止发展，并使用抗原反应性确定相对展示水平，该相对展示水平为滴度的函数。图5亲和筛选中表观靶-特异性富集取决于衣壳展示支架、感兴趣蛋白(POI)的表达和洗脱条件。第1轮和第2轮筛选之后，通过ELISA评估来自8个phOx-峰文库/NIP-峰文库的每一个的等体积的含有未滴定的病毒粒子的上清液的抗原反应性。第0轮对应于lX1010cfuampE的峰输入。为了估计可能的最大响应，包括入在第0轮中得到的峰浓缩物的克隆上清液，描述的结果通过减去背景的信号作为由圆锥形表示的可能最大应答的分数给出ο发明详述应该注意，本发明一个方面上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。本申请中引用的所有专利和非专利参考文献在此通过引用整体并入。我们在此提出了新的概念，其中丝状噬菌体病毒粒子的结构外壳蛋白pIX被遗传地改变，使得修饰形式编码N末端肽或蛋白结构域。pIX融合蛋白一方面，本发明提供了源自丝状噬菌体的pIX融合蛋白，所述融合蛋白包含外源性肽与Pix的N末端的融合。这种融合蛋白用于例如噬菌体展示环境中。当提及外源性肽时，是指最初不是pIX蛋白部分的肽，带有或不带有在融合蛋白的PlX氨基酸部分N末端的任何连接体氨基酸。在一个优选实施方案中，编码融合蛋白的核酸不包含原核N末端信号序列。本文使用的术语肽涵盖短肽、多肽、蛋白及其片段。术语pIX蛋白指公开于(SEQIDNO1(MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS)的氨基酸序列。在一个实施方案中，pIX蛋白包含与SEQIDNO1具有至少70%序列同一性、例如75%同一性、例如80%同一性、例如81%同一性、例如82%同一性、例如83%同一性、例如84%同一性、例如85%同一性、例如86%同一性、例如87%同一性、例如88%同一性、例如89%同一性、例如90%同一性、例如91%同一性、例如92%同一性、例如93%同一性、例如94%同一性、例如95%同一性、例如96%同一性、例如97%同一性、例如98%同一性、例如99%同一性的氨基酸。序列同一性通常定义的"同一性"在此被定义为基因或蛋白之间分别在核苷酸或氨基酸水平上的序列同一性。因此，在本上下文中，“序列同一性"是蛋白质之间氨基酸水平上同一性的量度和核酸之间核苷酸水平上同一性的量度。蛋白序列同一性可以通过序列比对时比较每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定。类似地，核酸序列同一性可以通过序列比对时比较每5个序列中给定位置的核苷酸序列来确定。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较目的而比对序列(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同一性=相同位置数目/位置(例如，重叠位置)总数目X100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。可以人工比对序列并计数相同氨基酸数目。可选地，为确定同一性百分比的两个序列的比对可以使用数学算法来完成。这种算法并入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人1990)。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行，评分=100，字长=12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序进行，评分=50，字长=3，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了比较目的获得空位比对，可以使用空位BLAST。可选地，可以使用PSI-Blast进行迭代检索，检测分子之间远缘关系。当使用NBLAST、XBLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可选地，序列同一性可以在例如通过EMBL数据库中的BLAST程序(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)比对之后来计算。一般，关于例如"评分矩阵〃和"空位罚分〃的缺省设置可以用于比对。在本发明上下文中，BLASTN和PSIBLAST缺省设置可能是有利的。两个序列之间的同一性百分比可以使用类似于上文描述的那些技术来确定，并允许或不允许空位。在计算同一性百分比时，仅计数精确匹配。折叠蛋白在一个优选实施方案中，术语肽专门指折叠蛋白，例如抗体衍生的结构域。技术人员将理解，折叠蛋白可以是抗体或其片段包括FV、SCFV、Fab，单结构域，蛋白A的Z结构域或其片段(亲和体(AfTibody))，锚蛋白或其片段，DARPin或其片段，T细胞受体或其片段，I类MHC或II类MHC或其片段，纤连蛋白或其片段，Anticalin或其片段，PDZ结构域或其片段，IgNAR或其片段，CTLA4或其片段，ImmE7或其片段，打结素(Knottin)或其片段，avimer或其片段，GFP或其片段，和其他基因编码的生物荧光团。原则上，只要物质被展示，可以制备任何物质的文库，因此以其最简单的形式，可以仅分离与折叠的有序结构相比具有非结构构型的物质。在另一个优选实施方案中，术语肽专门指2至50个氨基酸的短肽。在一定长度上，短的无规卷曲肽长度足以采用确定的二级或三级折叠，并因此进入折叠结构域定义。显然，这将取决于化学组成，因此，一个20氨基酸的肽将依然是无规卷曲，而另一个20氨基酸的肽可以被折叠并落入折叠结构域定义。在另一优选实施方案中，本发明的pIX融合蛋白包括选自由SEQIDNO=I的位置1-32、2-32、3-32、4-32、5-32、6-32、7-32、8-32、9-32、10-32、11-32和12-32组成的组的序列。原则上，在噬菌粒上下文中，考虑到保留跨膜部分并允许正常的病毒粒子并入和装配，可以设想PlX的任何N末端修饰。SEQIDNO:1(MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSQ是丝状噬菌体的结构外壳蛋白pix(野生型pix)的氨基酸序列。最优选地，PlX融合蛋白包括SEQIDN0:1的位置1-32。SEQIDNO=I不应与下文描述的信号序列/前导序列相混淆。信号序列优选地，外源性肽用或不用任何连接体氨基酸而直接融合至融合蛋白的pIX序列的N末端。而在另一个优选实施方案中，pIX融合蛋白不包括原核N末端前导序列。术语"前导序列"与术语"信号肽"和"信号序列"可互换使用，并且指使蛋白(前导序列是其部分)靶向革兰氏阴性细菌周质膜空间的氨基酸序列。常使用的前导序列的实例是pelBss、OmpAss>TorAss>malEss、phoAss、IamBss>Blass、禾口DspAss、mglBss、sfmCss,tolBss和TorTss。已知此类信号序列使完整蛋白靶向大肠杆菌的分泌装置，已知所述分泌装置至少包括从胞质到周质空间的SRP依赖性、SEC依赖性、TatABC依赖性或YidC依赖性易位(Baneyx等人PMID155^165)。因此，术语N末端信号序列指在蛋白的N末端部分的信号序列。具有使蛋白(信号序列是其部分)靶向大肠杆菌分泌装置并从而使之从胞质区室易位至周质区室的性质的信号序列，可以部分地通过其氨基酸组成的化学性质定义的特征序列或基序来鉴定。然而，目前而言，存在的功能性信号序列的多样性超出了鉴定它们的现有知识，因此，目前将肽定义为相关信号序列的技术水平通常使用基于数据的知识作为模板，通过例如神经网络或启发式方法通过数据挖掘来进行。迄今存在几种通过开放访问渠道公众可获得的此类工具，例如SignalP、PR0SITE的PPSEARCH(EMBLjBI)、SecretomeP^TatP0对于分泌蛋白类别来说挑战甚至更大，因为它们从胞质区室输出，这背离了规则，使得没有信号序列基序可以被鉴定，但是通过数据挖掘，也可以在此确定信号序列特征或获得关注的真核蛋白的分泌能力的可能性。目前，对于原核类群来说还不存在这样的工具。因此，目前可用的不可改变地将肽鉴定为信号序列的唯一方法是通过实验手段来验证肽的性质以确定它是否是真正的信号序列。还清楚，工程化可以在此类肽中进行，使得信号序列中给定氨基酸位置可以被改变，而通过天然功能性或者通过改变的功能性例如增加的转运能力保留其作为信号肽的功能。也可以采用氨基酸的缺失或添加。实际上已经对FfpVIII信号序列、靶向Sec途径的g8pss和靶向Tat途径的"TorAss进行了此类分析和工程化。特别地，Sien等人的结果可以用作用于工程化PlII信号序列和细菌果胶酸裂合酶信号序列的功能性但改变的突变体的有充分根据的指导原则。信号序列的功能性可以进一步分解为以下两种性质1.使蛋白(信号序列是其部分)靶向大肠杆菌的分泌装置并从而使之从胞质区室易位至周质区室，并在此过程期间，通过特定蛋白酶例如脂蛋白信号肽酶或前导肽酶与其余蛋白(remainingprotein)蛋白水解地分离。2.使蛋白(信号序列是其部分)靶向大肠杆菌的分泌装置并从而使之从胞质区室易位至周质区室，并在易位之后依然保留作为蛋白的一部分。虽然绝大多数的信号序列符合上述情况1)，但显然，这些蛋白可以容易地被工程化为情况2)。因此，任何目前已知的信号序列，例如突变体pelBss和最初属于情况1)但被改变成情况幻的其他信号序列依然被视为相关的信号序列。而且，可以设想将情况1)的信号序列改变为情况幻，或者直接选择符合情况2)的信号序列，然后在易位之后除去信号序列。这可以通过宿主的内源性蛋白酶来进行，和/或在例如噬菌体展示的情况下蛋白被融合至衣壳蛋白来进行。随后可以将人工蛋白酶位点工程化入信号序列或信号序列是其部分的蛋白的适当区域，使得可以进行确定的切割。在此可以设想两种不同类型的蛋白酶位点被选择A.蛋白酶位点不切割感兴趣的蛋白，仅切割预测的位点，例如与抗体或其他感兴趣的支架例如主要组织相容性复合物分子或T细胞受体组合的羧肽酶A或3C鼻病毒蛋白酶位点。通过使用该方法，可以设想例如通过使用符合上述情况幻的信号序列将感兴趣蛋白进行噬菌体展示，并且在用于筛选等之前，人工除去信号肽以获得功能性和与衣壳融合体的均一性。B.除了工程化位点外，蛋白酶位点切割感兴趣的蛋白，例如胰蛋白酶。这两种情况依然被视为信号序列依赖性噬菌体展示。外源性肽在一个优选实施方案中，PlX融合蛋白的外源性肽选自由以下组成的组抗体或其片段包括FV、SCFV、Fab，单结构域，蛋白A的Z结构域或其片段(亲和体)，锚蛋白或其片段，DARPin或其片段，T细胞受体或其片段，I类MHC或II类MHC或其片段，纤连蛋白或其片段，Anticalin或其片段，PDZ结构域或其片段，IgNAR或其片段，CTLA4或其片段，ImmE7或其片段，打结素或其片段，avimer或其片段，GFP或其片段，和其他基因编码的生物荧光团。在一个优选实施方案中，PlX融合蛋白的外源性肽是文库成员。本上下文中使用的文库指不同肽的集合。所述肽可以是折叠结构域或例如2-50个氨基酸的短肽。此类文库是有意义的，因为它们可以用于鉴定与给定靶结合的新配体。使用pIX展示文库与使用pill或pVIII展示文库相比具有几个优点。pIX展示在定向性和效价方面具有与PlII展示相同的优点，但不影响感染性，感染性是已知发生于PiII展示的现象，该现象例如在亲和筛选之后拯救时将不受控制和不想要的异质性引入系统。而且，pIX展示可以无需原核N末端信号序列而实现，原核N末端信号序列是pill展示和pVIII展示的先决条件。最后，pill展示中任何靶固定化的物类通常需要该靶-噬菌体键的破坏(通常通过竞争性洗脱、或高或低PH洗脱)。例如，已知这严重妨碍pill展示中高亲和力或稳定结合物的回收。由于感染所需的PlII不改变并且容易获得用于PlX展示中替代的相互作用，即使是在噬菌体-靶相互作用之后，这完全消除了对键破坏例如酸洗脱的需要，因为固定化的噬菌体保留了完整的感染性并因此可以简单地通过感染而被回收同时结合至靶。核酸本发明第二方面是编码本发明融合蛋白的核酸。本发明的核酸可以是质粒、载体、噬菌体基因组、噬菌粒或噬粒的部分。术语核酸指由单体核苷酸的链构成的大分子。在生物化学中，这些分子携带遗传信息或者在细胞内形成结构。最常见的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。此外，术语核酸包括人工核酸，例如肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些中的每一种与天然存在的DNA或RNA的区别在于分子主链的改变。噬菌粒或噬粒是一类克隆载体，开发为丝状噬菌体Ff和质粒的杂合体，产生可作为质粒繁殖并且还可以被包装为病毒粒子中的单链DNA的载体。类似于质粒，噬菌粒可用于克隆DNA片段并且可通过一系列技术(转化、电穿孔)被引入细菌宿主。然而，含有噬菌粒的细菌宿主被‘辅助’噬菌体例如VCSM13或M1I07感染提供了实现单链DNA复制和噬菌粒DNA包装入噬菌体颗粒的必要病毒成分。因此，本发明一个方面涉及包含编码源自丝状噬菌体的pIX融合蛋白的核酸的噬菌体基因组或噬菌粒，其中所述融合蛋白不包含原核N末端信号序列。在本发明的一个实施方案中，噬菌体基因组或噬菌粒包含编码源自丝状噬菌体的PlX融合蛋白的核酸，其中所述融合蛋白不包含原核N末端信号序列并且其中所述pIX融合蛋白包含选自由SEQIDNO1(MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS)的位置1_32、2_32、3-32,4-32和5-32组成的组的序列。在本发明另一实施方案中，外源性肽与PlX序列的N末端直接融合。本发明一个实施方案涉及本发明的噬菌体基因组或噬菌粒，其中与pIX融合的外源性肽选自由以下组成的组抗体或其片段包括Fv、scFv、Fab,单结构域，蛋白A的Z结构域或其片段(亲和体)，锚蛋白或其片段，DARPin或其片段，T细胞受体或其片段，I类MHC或II类MHC或其片段，纤连蛋白或其片段，Anticalin或其片段，PDZ结构域或其片段，IgNAR或其片段，CTLA4或其片段，ImmE7或其片段，打结素或其片段，avimer或其片段，GFP或其片段，和其他基因编码的生物荧光团。在本发明另一实施方案中，与pIX融合的外源性肽是文库成员。丝状噬菌体本发明第三方面是包含本发明融合蛋白的丝状噬菌体。丝状噬菌体病毒粒子可以包含噬菌粒。噬菌体常被称为细菌噬菌体，在本文意思是感染、复制并且从细菌分泌的病毒。丝状细菌噬菌体或丝状噬菌体是具有单链DNA分子(ssDNA)的噬菌体，单链DNA分子被噬菌体外壳蛋白包裹。分泌的丝状噬菌体颗粒表型上具有丝状结构。本文使用的术语丝状噬菌体涵盖噬菌体基因组衍生的病毒粒子和噬菌粒衍生的病毒粒子。术语辅助噬菌体指这样的病毒，该病毒通过感染相同宿主细胞而帮助单独和不相关的缺陷型病毒繁殖，所述相同宿主细胞已经被该缺陷型病毒占据并提供该缺陷型病毒丢失并需要以形成含有噬菌粒的病毒粒子的蛋白，所述单独和不相关的缺陷型病毒被定义为例如本身不是噬菌体基因组也不是功能性病毒而只是含有一个或几个衍生自噬菌体基因组的元件的质粒的噬菌粒。在一个实施方案中，丝状噬菌体确实包含编码本发明融合蛋白的核酸。特别优选的是包括含有编码本发明融合蛋白的核酸的噬菌粒的噬菌体。噬菌体文库是展示作为丝状噬菌体外壳蛋白的一个或多个的部分的肽或蛋白的丝状噬菌体集合。此类文库可以包括两种或多种展示不同肽或蛋白的噬菌体。因此，在本发明的一个实施方案中，丝状噬菌体展示作为丝状噬菌体外壳蛋白的一个或多个的部分的肽或蛋白。在一个实施方案中，丝状噬菌体还包含pill融合蛋白、pVII融合蛋白或pVIII融合蛋白ο本发明一个方面是本发明丝状噬菌体文库，所述丝状噬菌体展示作为与pill、pVII、pVIII或pIX的一个或多个的融合体的外源性肽或蛋白。文库是展示作为丝状噬菌体外壳蛋白的一个或多个的部分的肽或蛋白的丝状噬菌体集合。此类文库可以包括两种或多种展示不同肽或蛋白的噬菌体。本发明一个方面涉及包含两种或多种展示不同蛋白的丝状噬菌体的噬菌体文库，其中这些蛋白的至少一种是从本发明的噬菌体基因组或噬菌粒表达的PlX融合蛋白。本发明一个实施方案涉及包含两种或多种展示不同肽或蛋白的丝状噬菌体的噬菌体文库。在一个具体实施方案中，这些肽或蛋白的至少一种是本发明的PlX融合蛋白。在一个实施方案中，肽同时展示在pIX与pIII、pVII或pVIII。在另一个实施方案中，肽同时展示在pIX与选自由pill、pVII或pVIII组成的组的两种或三种。术语野生型(wildtype)，有时写为野生型(wildtype)、野生-型(wild-type)或wt，是生物体、菌株、基因或特性天然存在的通常形式。野生型指天然群体中最常见的表型。野生型还指产生野生型表型所需的每个基因座的等位基因。野生型是基因型和表型的参考标准。在生物学中，它尤其涉及天然存在的生物体和被有意突变的生物体之间的差异。定点诱变是允许野生型基因的基因序列中特定核苷酸突变的研究技术。野生型蛋白书写为wt(蛋白名称)，例如，野生型pIX蛋白书写为wtpIX、wt-pIX或野生型pIX.因此，本发明的一个方面涉及不包含编码wtpIX的基因和/或wtpIX蛋白的本发明的丝状噬菌体。本发明另一方面涉及还包含编码wtpIX的基因和/或wtpIX蛋白的本发明的丝状噬菌体。本发明另一方面涉及包含本发明的噬菌体基因组或噬菌粒的丝状噬菌体。在本发明的一个实施方案中，包含本发明的噬菌体基因组或噬菌粒的丝状噬菌体还包含编码wtpIX的基因和/或wtpIX蛋白。在本发明另一实施方案中，包含本发明的噬菌体基因组或噬菌粒的丝状噬菌体不包含编码WtPlX的基因和/或wtPlX蛋白。本发明另一方面涉及在无WtPlX蛋白补充的噬菌体展示中是功能性的PlX融合蛋白。本发明一个方面涉及包含本发明噬菌体基因组或噬菌粒的丝状噬菌体，还包含选自PiII融合蛋白、pVII融合蛋白和pVIII融合蛋白的组的一种或多种。噬菌体展示系统本发明第五方面是包含噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统，其中所述辅助噬菌体包含编码本发明PlX融合蛋白的核酸。噬菌体展示系统、噬菌体展示技术、噬菌体展示工艺或简单地噬菌体展示指发现和研究蛋白-蛋白、蛋白-肽和蛋白-DNA相互作用的方法，其利用细菌噬菌体来关联蛋白与编码它们的遗传信息。展示蛋白或展示的蛋白指为了检测或配体固定，与可接近的噬菌体外壳蛋白融合的蛋白。本发明第六方面是包含噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统，其中所述噬菌粒包含编码本发明PlX融合蛋白的核酸。本发明一个方面涉及包含本发明噬菌体基因组或噬菌粒的噬菌体展示系统。本发明另一方面涉及包含本发明噬菌体基因组或噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统。本发明一个方面涉及包含两种或多种展示不同蛋白的丝状噬菌体的噬菌体文库，其中这些蛋白的至少一种是从本发明的噬菌体基因组或噬菌粒表达的PlX融合蛋白。本发明的一个实施方案中，本发明的噬菌体文库包括一种或多种选自pill融合蛋白、PVII融合蛋白和PVIII融合蛋白的其他融合蛋白。试剂盒本发明第七方面是包含由噬菌粒和辅助噬菌体构成的噬菌体展示系统的试剂盒，其中所述噬菌粒包含编码本发明PlX融合蛋白的核酸。所述试剂盒应该包括噬菌粒和辅助噬菌体(例如M13K07、VCSM13或其他)，所述噬菌粒具有pIX编码基因，所述基因在编码区N末端具有多克隆位点。所述试剂盒应该配有感染、表达、固定、筛选和检测噬菌体克隆的技术手册。所述试剂盒还应该具有进行具体测定所必要的缓冲液和培养基的配方。试剂盒在此指用于产生具有单或双特异性融合蛋白的噬菌体颗粒作为噬菌体展示文库或作为单噬菌体颗粒的试剂集合。试剂盒可包括噬菌粒、辅助噬菌体、细菌菌株和试剂配方和测定描述的技术手册。试剂盒可以用于研究试剂、诊断试剂和治疗试剂的开发。本发明一个方面涉及包括噬菌体展示的试剂盒，所述噬菌体展示包含本发明的噬菌体基因组或噬菌粒和辅助噬菌体。本发明另一方面涉及包含本发明噬菌体基因组或噬菌粒的试剂盒。本发明另一方面涉及包含丝状噬菌体的试剂盒，所述丝状噬菌体包含本发明的噬菌体基因组或噬菌粒。现在，本发明在下述非限制性实施例中更详细描述。实施例实施例1:pIX上的噬菌粒展示试剂所有培养基和缓冲液基本上如Sambrook等人(2001)MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)·ColdSpringHarbor，NYCoIdSpringHarborLaboratoryPress^M13—HR自GEHealthcareBio-SciencesAB(Uppsala,Sweden)。限制酶(RE)购自NewEnglandBiolabs(Ipswich,MA,USA)，除了DpnI获自Stratagene(LaJoIIa，CA,USA)。DNA寡聚体购自MWGBiotechAG(Ebersberg,Germany)。牛血清白蛋白(BSA)和Tween20购自Sigma-Aldrich(Oslo，Norway)PfuTurboDNA聚合酶购自Stratagene(LaJoIIa,CA,USA)。与BSA轭合的半抗原2-苯基噁唑-5-酮(PhOx)和5-硝基苯乙酰基(NlP)基本上如其他地方所述制备(Nakela等人，PMID；722243和Michaelsen等人，PMID:2125362)。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自Fermentas(Burlington，Canada)。三乙胺(TEA)和胰蛋白酶/EDTA分别购自Sigma-Aldrich(Oslo,Norway)禾口BioWhittaker(LonzaGroupLtd.,Visp,Switzerland)。大肠杆菌菌株XLl-Blue购自Stratagene(LaJoIIa，CA,USA)。M13K07辅助噬菌体购自GEHealthcareBio-SciencesAB(Uppsala,Sweden)。含有对phOx-BSA特异性的单链Fv(scFv)的pSEX81(SEQIDNO:2)噬菌粒(pill展示)由AffitechAS(Oslo,Norway)惠赠。含有scFv抗NIP(SEQIDNO3)的原核表达载体pSGl(未公开)基于pH0G21(Kiprianov等人，PMID=9005945)并且已经从衍生自pLN0H2和pLNOK的抗体可变基因内部制备(Norderhaug等人，PMID:9202712)。新型PlX展示噬菌粒载体PGALD9和pGALD9ΔL的构建选择上述pSEX81(SEQIDNO2)噬菌粒(GenBank登录号Y14584)作为载体主链的起始模板。首先，为去除该载体中的原核PelB信号序列(N-MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA-C)(SEQIDNO4)编码段，使用引物对a41g-正向引物/a41g-反向引物(5‘-AGAGGAGAAATTMCCATGGAATACCTATTGCCTACGGC-3‘/5-GCCGTAGGCMTAGGTATTCCATGGTTAATTTCTCCTCT-3‘)(分别为SEQIDNO5和SEQIDNO6)通过QuikChange体外诱变在最N末端引入NcoIRE位点，从而使pelBORF的第二密码子的第一核苷酸从A变为G。诱变后，载体用NcoI消化，再连接，并用作使用弓丨物对pH0G_EcoRI_正向引物/scTCR_反向引物(5‘-TAGCTCACTCATTAGGCACCC-3‘/5'-TTTGGATCCAGCGGCCGC-3‘)(分别为SEQIDNO:7和SEQIDNO8)回收载体相关部分的第二PCR的模板。然后使用标准技术将该PCR片段移入最初pSEX81(SEQIDNO2)的相容的EcoRI/HindlllRE位点并通过DNA测序证实。该步骤完全去除了pelB信号序列编码部分，但是保留了对正常转录和翻译重要的起始密码子及其与IacPO和Shine-Dalgarno序列(SD)的相对位置，并且在最初pSEX81(SEQIDNO2)中存在的NcoI/NotIRE位点确定的外源序列之前加入仅一个Ala残基。新构建体称为PSEX81ΔL0其次，ρΧΙ编码序列使用5‘-末端加RE标签的引物对pIX_EcoRV/pIX_NheI(5'-ATATGATATCAGMTGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCC-3'/5'-ATATGCTAGCTTATCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGG-3‘)(SEQIDNO9和SEQIDNO10)从M13K07扩增。然后将该PCR片段移入pSEX81(SEQIDNO2)和pSEX81ΔL噬菌粒上相容的RE位点，从而交换两者的pill编码区并导致最初pSEX81(SEQIDNO2)中NcoI/NotI确定的盒的N末端框内pIX融合。新构建体通过DNA测序证实并分别称为PGALD9和pGALD9ΔL。为了将上述各种噬菌粒中scFv抗phOx(SEQIDNO:11)单元转换为来自pSGl的scFv抗NIP(SEQIDNO3)单元，这使用标准技术以NcoI/NotIRE确定的盒交换来进行。本文描述的所有噬菌粒使用标准技术通过电穿孔被引入大肠杆菌XLl-Blue。噬菌体颗粒的制备使用M1I07辅助噬菌体和病毒粒子装配从大肠杆菌XLl-Blue的噬菌粒拯救通过所描述的斑点滴定来监测(Welschof等人，PMID=9050877和Koch等人，PMID=11126120)。噬菌体捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)将phOx-BSA或NIP-BSA吸附至MaxiSorp微量滴定板孔(Nunc，Roskilde,Denmark)，5μg/ml于PBS中，pH7.4，4°C过夜。孔用2%(w/v)BSA的PBS溶液室温封闭1小时，然后添加病毒粒子制品，并允许在室温反应1至2小时，然后用抗M13-HR(15,000)在室温检测捕获的病毒粒子1小时。每步之间，孔用PBST(PBS/0.05%Tween20)洗涤3X。孔用TMB可溶性底物显色，30分钟后用IMHCl终止，在A45tlnm读取吸光度。为了定量作为每个病毒粒子展示的融合蛋白的函数的抗原反应性，在对任何样品观察到信号饱和之前通过添加IMHCl来终止ELISA显色，根据下式转换吸光度读数相对展示水平=(A45tlnm/噬菌粒滴度)X1012。峰phOx-BSA/NIP-BSA筛选制备新鲜病毒粒子样品，有或没有ImMIPTG诱导，PEG沉淀，并如上所述滴定。然后将靶特异性实体以1IO7的水平加入无关背景，得到IO7的已知多样性，对应于中等大小的组合文库。对于NIP-BSA筛选，将scFv抗NIP加入scFv抗phOx对应物，反之亦然。最初输入量是IX101(lCfUampK，对于所有12个模型文库，得到第1轮淘选中IO3的复杂度水平。简言之，将靶固定在MaxiSorp微量滴定板孔(NunC，R0Skilde，Denmark)，相同板上一式三份，第ι轮和第2轮淘选分别使用100μ1体积的1μg/ml和0.1μg/ml。在淘选之前，孔用PBSTM在室温封闭1-2小时，然后添加100μ1各自的预先封闭(在PBSTM中)的病毒粒子制品，并允许在室温伴随搅拌下反应1.5小时。孔用微量滴定洗涤器在PBST中洗涤9Χ，然后在(IH2O中洗涤5Χ，然后通过以下洗脱靶结合的病毒粒子(在三份孔中):1)添加100μ1/孔的IOOmMΤΕΑ(ρΗ12)，在室温持续5分钟，随后通过转移至含有100μ1/孔的Tris-HCl，ρΗ6.8的新孔来中和；2)添加100μ1/孔的胰蛋白酶/EDTA，在室温持续10分钟，随后转移至新孔；3)添加200μ1/孔的对数期(A6tltlnm0.5，对应于彡5XIO7细胞)大肠杆菌XLl-Blue，在37°C持续30分钟，伴随搅拌，随后转移至以MOI10补充了M1I07辅助噬菌体的IOml预热的YT-TAGQXYT，含有30μg/ml四环素、100μg/ml氨苄西林和0.IM葡萄糖)。孵育在低搅拌下37°C持续15分钟，随后高搅拌下37°C30分钟。平行地，TEA和胰蛋白酶洗脱样品被用来感染9mlYT-TAG中的对数期大肠杆菌XLl-Blue培养物，该培养物在37°C低搅拌孵育15分钟，然后添加以MOI10补充了M1I07辅助噬菌体的ImlYT-TAG0孵育在低搅拌下37°C持续15分钟，随后剧烈搅拌下37°C30分钟。然后所有样品以3000g/10分钟/室温离心，弃掉上清液，将沉淀温和重悬于含有100μg/ml氨苄西林和50μg/ml卡那霉素的IOml预热的2XYT。适当的样品被补充ImMIPTG，并且所有样品在30°C剧烈搅拌下孵育过夜。第二天，培养物以4000g/10分钟/室温离心，上清液通过0.2μm滤器无菌过滤入新的15ml管。然后，这些上清液进入下一轮所描述的淘选，使用50μ1体积/样品，对应于至少109cfiTP7样品的输入。在第二轮筛选之后，含有病毒粒子的上清液进入如上所述的抗原特异性ELISA。结果已知丝状噬菌体(fd、M13和fl)的所有五种结构外壳蛋白在被并入突出的病毒粒子之前是革兰氏阴性宿主内膜中发现的膜内在蛋白(Endeman和Model，PMID:7616570)。该报道还得出结论即使PlX不允许任何N末端融合修饰，衣壳蛋白本身在完整病毒粒子中是溶剂可及的(solventaccessible)。Gao等人(PMID:10339535和12239343)和Khalil等人(PMID:17360403)后来都表明，当从噬菌粒表达并与信号序列依赖性周质靶向组合使用时允许N末端pIX融合体展示。在这些系统中，因为wtPlX在噬菌粒拯救时由辅助噬菌体基因组提供而发生补充。为了测试此类展示是否在没有任何信号序列依赖性靶向周质时也被允许，我们构建了称为PGALD9和pGALD9ΔL的两种新型噬菌粒，分别在有或没有此类信号序列时允许N末端pIX展示(图2)。选择使用这些新噬菌粒的两种不同的pIX融合体进行分析并与使用标准pill展示的其对应物比较。两种融合体是抗体片段scFv，基于对半抗原轭合物phOx-BSA特异性的人抗体可变基因区段(scFv抗phOx)，或者基于对半抗原轭合物NIP-BSA特异性的鼠抗体可变基因区段(scFv抗NIP)。值得注意的是，已经从人抗体scFv文库选择了scFv抗phOx(SEQIDNO11)，并且已知在大肠杆菌中表达非常好(Marks等人，PMID:1748994)。相比之下，公知许多鼠杂交瘤可变基因在大肠杆菌中以及在噬菌体展示时表达不是很好(Krebber等人，PMID:9032408)。scFv的pIX展示不应该干扰正常的病毒粒子装配。因此，我们使用材料与方法中所述的标准噬菌粒拯救和滴定，比较了有和没有信号序列的这些scFv展示噬菌粒的性能并与标准pill展示(其绝对需要信号序列依赖性周质靶向)比较(图3)。滴定结果实际显示了含有噬菌粒的病毒粒子在所有情况下生成(图3A和C)。当scFv融合体从lacPO表达而无需启动子诱导(基础表达)时，pIX展示形式和pill对照对于scFv抗phOx产生相当的滴度(图2A)。相比之下，不依赖信号序列的scFv抗NIPpIX展示分别与PlII和信号序列依赖性PlX展示相比滴度高5至10倍(图3C)。当IPTG诱导IacPO强迫scFv融合体表达增加时，信号序列依赖性pIX展示和pill展示的滴度约10倍减少。相比之下，对两种不依赖信号序列的PlX展示变体只有较小影响(图3A和C)。由于在该系统中存在来自辅助噬菌体的wtpIX的补充，该发现是惊人且重要的，因为这显示信号序列依赖性PlX和PlII展示干扰病毒粒子组装过程，而这一作用在不依赖信号序列的PlX展示的情况下只是轻微的，即使在IPTG诱导时。所述作用在比较有或没有信号序列的PlX上展示的scFv抗OTP结果时最突出，其中前者表现出滴度的100倍减少。还值得注意的是，对于两种scFv，当以不依赖信号序列的pIX形式进行时，病毒粒子装配与pill—样好或者更好。任何组合筛选平台的核心是能够实现通过表型筛选来检索基因型的物理表型-基因型偶联。如果这一物理关联被损害或丧失，则系统失去功能。对于噬菌粒展示，这意味着对于任何筛选关键的是在辅助噬菌体拯救时被包裹入病毒粒子的是噬菌粒而非辅助噬菌体基因组。因为噬菌粒和辅助噬菌体具有不同的抗生素选择标记，这一观点可以容易地在感染滴定中评估，该评估通过基于其各自的从适当选择生长(氨苄西林(ampR)或卡那霉素(kanR)得到的菌落形成单位(cfu)计算噬菌粒与辅助噬菌体之比。对于任何可行的有效下游筛选而言，所述比应该高于1。当评估上述病毒粒子制品的噬菌粒与辅助噬菌体之比时(图:3B和D)，揭示了三种展示途径之间的显著差异。使用标准病毒粒子包装而无启动子诱导(基础表达)，所有三种途径对于scFv抗phOx(图2B)是可行的，而对于scFv抗NIP(图3D)，这仅对不依赖序列的PlX变体可行。在启动子诱导(IPTG诱导)时，pill和信号依赖性pIX变体表现出表型-基因型关联的严重丧失，并且该作用对于scFv抗NIP融合体最突出。相比之下，该作用对于不依赖信号序列的PlX变体而言不存在(scFv抗phOx)或微弱(scFv抗NIP)。因此，结果清楚表明，不依赖信号序列的PlX展示与两种标准的PlII和信号序列依赖性PlX展示相比具有较好的表型-基因型关联表型。基于上述样品，我们在抗原特异性ELISA中评估了这些病毒粒子上的功能性scFv展示(图4)。结果清楚显示了来自所有三种展示途径的功能性scFv展示(图4A和B)。由于样品未根据噬菌粒滴度标准化，信号强度不可直接比较。而且，在几个样品中观察到了信号饱和。为了充分评估三种展示途径之间的功能性差异，如材料与方法中所描述的，在新抗原特异性ELISA中确定了相对展示水平(每个病毒粒子的功能性展示单位)(图4C和D)。展示水平在PlII和信号序列依赖性PlX变体之间相当，而不依赖信号序列的PlX展示显著较低。这对于两种scFv在基础表达和IPTG诱导时都是如此。如预期的，所有三种展示途径和两种scFv在IPTG诱导时表现出较高的展示。然而，最重要的是根据图:3B和D中给出的比观察图4C和D的结果。例如，显然，scFv抗NIP单元的pill和信号序列依赖性ρIX展示与不依赖信号序列的PlX对应物相比表现出10至20倍(基础表达)和25倍(IPTG诱导)更高的展示。然而，前两种途径具有非常弱的或丧失的表型-基因关联，这在组合筛选方案中将使它们没有功能性，因为它们的基因型对表型筛选不起作用。这种情况对于scFv抗phOx单元也是如此，但仅对IPTG诱导。而且，IPTG诱导的不依赖信号序列的ρΙΧ变体中scFv抗phOx单元的展示水平与基础表达的pill和信号序列依赖性PlX变体相当。鉴于这些数据，有趣地发现利用PlX(信号序列依赖性)进行scFv展示的唯一报道(fe0，PMID12239343)总是在病毒粒子包装时利用IPTG诱导，但未报道噬菌粒与辅助噬菌体之比。尽管scFv形式因为在大肠杆菌中有利的表达特征而被经常使用(Bradbury和Marks,PMID15^1570)，几个报道指出较低水平展示形式例如抗体Fab片段在亲和筛选时回收高亲和力结合物的优点(deHaard,等人，PMID:10373423和Hoogenboom，PMID16151404)和Rothe等人(PMID:18191144)。因此，即使不依赖信号序列的scFv-pIX展示表现为产生低水平展示，但这可能实际上在应用于高亲和筛选时变得非常有利。因此，为了评估亲和筛选中不依赖信号序列的ρΙΧ展示如何进行，我们与常规PiII展示进行比较。病毒粒子在IPTG诱导存在或不存在下产生，并且感兴趣的蛋白是scFv抗phOx或scFv抗NIP。因此，分别针对两个靶phOx-BSA和NIP-BSA评价了总共4个噬菌体群体。在每种情况下，靶特异性scFv以1IO7的比与特异性无关scFv混合。重要的是，两种scFv不交叉反应。然后进行两轮亲和筛选。采用了三种不同的洗脱策略；高pH、蛋白水解或直接感染。在第二轮筛选之后通过抗原特异性多克隆噬菌体ELISA证实了富集(图5)。当感兴趣的蛋白展示在ρΙΧ上时，筛选与POI在pill上展示时相比大约等同有效，并且在大多数情况下更有效。特别地，采用高PH(TEA)或蛋白水解(胰蛋白酶)洗脱的标准pill展示途径与ρΙΧ相比表现出差的富集。独立于展示途径和洗脱条件，筛选在无IPTG诱导时比有IPTG诱导时更有效，并且pin展示途径的副作用表现得最严重。因此，不依赖信号序列的PlX的低展示倾向不转化为差的筛选。通过使pill不改变并且完全暴露于溶剂，文库筛选步骤之后的病毒粒子拯救可以有效进行，而不破坏病毒粒子-靶结合，使得洗脱步骤多余并加速高通量方案。后者还可以促进高亲和力结合物的分离，高亲和力结合物的洗脱可耐受多种策略(Balass等人，PMID:8954559)。参考文献1.Endemann,H.&Model,P.LocationofFilamentousPhageMinorCoatProteinsinPhageandinInfectedCells(丝状噬菌体次要外壳蛋白在噬菌体中和感染细胞中的定位).JournalofMolecularBiology250，496-506(1995)(PMID:7616570)·2.Gao,C.等人·Makingartificialantibodies:Aformatforphagedisplayofcombinatorialheterodimericarrays(制备人工抗体用于组合异二聚体阵列的噬菌体展示形式)·PNAS96，6025-6030(1999)(PMID10339535)·3.Gao,C.等人·AmethodforthegenerationofcombinatorialantibodylibrariesusingpIXphagedisplay(使用pIX噬菌体展示产生组合抗体文库的方法).PNAS2002年10月1日；99Q0):12612-6.2002年9月18日电子出版(PMID12239343).4.W0/2000/071694.Janda,Kim,D.5.KhalilAS,FerrerJM,BrauRR,KottmannST,NorenCJ,LangMJ,BelcherAM.SingleM13bacteriophagetetheringandstretching(单M13细菌噬菌体系留和延伸).ProcNatlAcadSciUSA.2007年3月20日；104(12):4892-7.2007年3月13日电子出版(PMID:17360403).6.AltschulSF,GishW,MillerW,MyersEW，LipmanDJ.Basiclocalalignmentsearchtool(基本的局部比对检索工具)·JMolBiol.1990年10月5日；2I5(3)403-10(PMID:2231712).7.BaneyxF,MujacicΜ.RecombinantproteinfoldingandmisfoldinginEscherichiacoli(大肠杆菌中的重组蛋白折叠和错误折叠).NatBiotechnol.2004年11月；22(11):1399-408(PMID:15529165).8.Sambrook入.，Molecularcloning-.alaboratorymanual(^^!实验室手册)·ColdSpringHarborLaboratoryPress.9.MichaelsenTE,AaseA,WestbyC,SandlieI.EnhancementofcomplementactivationandcytolysisofhumanIgG3bydeletionofhingeexons(通过缺失1链外显子而增强人IgG3的补体激活和细胞溶解).kandJImmunol.1990年11月；32(5)517-28(PMID:2125362).10.Nakela0，KaartinenΜ,PelkonenJL,KarjalainenK.InheritanceofantibodyspecificityV.Anti-2-phenyloxazoloneinthemouse(抗体特异性遗传性V.小鼠中抗2-苯基噁唑酮).JExpMed.1978年12月1日；148(6)1644-60(PMID722243).11.KipriyanovSM,MoldenhauerG,LittleΜ.Highlevelproductionofsolublesinglechainantibodiesinsmall-scaleEscherichiacolicultures(小规CN模大肠杆菌培养物中可溶性单链抗体的高水平生产).JImmunolMethods.1997年1月15日；200(1-2):69-77(PMID:9005945).12.NorderhaugL,OlafsenT,MichaelsenTE,SandlieI.Versatilevectorsfortransientandstableexpressionofrecombinantantibodymoleculesinmammaliancells(哺乳动物细胞中重组抗体分子的瞬时和稳定表达的通用载体).JImmunolMethods.1997年5月12日；204(1)77-87(PMID:9202712).13.WelschofM,TernessP,KipriyanovSM,StanescuD,B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