具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1IgV亲和肽D2的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物制药【技术领域】，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1IgV的D-构型亲和肽D2产品及其制备和应用。该亲和肽D2特异性结合于PD-L1IgV区，其氨基酸序列为KHAHHTHNLRLP，分子量为1459.8。亲和肽D2通过Fomc固相多肽合成法制备，在制备抗结肠癌药物中作为主要活性成分发挥作用。本发明所提供的亲和肽D2通过利用镜像噬菌体展示肽库筛选技术，以D-PD-L1IgV为靶点进行高通量筛选获得。发明人通过小鼠体内荷瘤实验，证明了亲和肽D2具有较好的抗肿瘤活性，能明显抑制小鼠体内肿瘤的增长，从而为基于PD-L1的药物研究和开发提供新的思路和理论基础。
【专利说明】具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1 IgV亲和肽D2
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药【技术领域】，具体涉及一种具有抗肿瘤活性多肽产品的筛选、制备及应用，更具体的，本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的靶向ro-Ll IgV的D-构型亲和肽D2产品及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]近年来，肿瘤的防控形势非常严峻。随着临床诊断、手术治疗、化疗和放疗等水平的提高，使得一部分病人能够得到早发现、早治疗，并且获得较好的预后，但是，寻找新的治疗手段和治疗药物一直是全球范围内的研究热点。与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，并且建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移。
[0003]在肿瘤免疫治疗过程中，负性共刺激分子主要介导免疫耐受和逃逸，而前人在肿瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因此，探讨通过抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的对肿瘤细胞的免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。
[0004]T细胞的激活需两个来自细胞外的信号刺激，即淋巴细胞活化的双信号作用。细胞活化的第一信号主要来自细胞抗原识别受体(TCR )与MHC分子抗原肽复合物的特异性结合，此过程为抗原识别。细胞活化的第二信号又称共刺激信号，是由抗原递呈细胞(APC)和细胞表面的粘附分子提供。这些粘附分子被称为共刺激分子，是一类细胞膜表面分子，可为T、B细胞的活化提供辅助信号，从而调节细胞的增殖、活化及分化。根据产生的效应不同，可将共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子。正性共刺激分子包括CD28、IC0S、4-1BB等分子，而负性共刺激分子则包括CTLA-4、PD-U TIM-3等分子。
[0005]PD-1 /PD-Ll作为B7/⑶28家族成员，已被证实通过抑制T细胞的活化和增殖来负调控免疫应答，并在调节免疫耐受、肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。因而利用ro-Li的阻断剂作为肿瘤免疫治疗药物或佐剂具有很好的应用前景和安全性，而现有技术中，尚缺少较好的ro-Li的阻断剂产品。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种具有较好抗肿瘤活性的靶向ro-LlIgV的D-构型亲和肽D2产品，可以特异性利用ro-LlI蛋白IgV区(D-PD-LlIgV)作为结合靶点，从而最终阻断PD-1 /PD-Ll的活化，解除对T细胞的活化和增殖的抑制作用，从而发挥抗肿瘤作用。
[0007]具体而言，本发明采用的技术方案如下:
一种具有抗肿瘤活性靶向ro-LlIgV亲和肽D2，属于D-构型，特异性结合于ro-LlIgV 区，其氨基酸序列为:Lys_His-Ala-His-His-Thr-His-Asn-Leu-Arg-Leu-Pro,即K-H-A-H-H-T-H-N-L-R-L-P，分子量为 1459.8。
[0008]所述具有抗肿瘤活性靶向ro-LlIgV亲和肽D2，添加药学上可接受的载体或/和添加剂后，在制备抗结肠癌(CT26)药物中作为主要活性成分发挥作用。
[0009]所述具有抗肿瘤活性靶向ro-LlIgV亲和肽D2，通过Fomc固相多肽合成法人工合成。
[?σιο] 现有技术中对ro-1/PD-Li复合物的晶体结构研究认为，与受体ro-1结合的部位主要是ro-Li的胞外段Igv区，因此发明人通过构建人ro-Li igv区的原核表达载体，得到人ro-Li胞外段Igv区蛋白，并以其为靶点来筛选亲和肽，进而对其作为肿瘤免疫治疗药物和佐剂的可能性进行研究。
[0011]在对靶点进行高通量筛选亲和肽过程中，发明人采用了库容量大、操作简便的噬菌体展示肽库技术进行了筛选。噬菌体展示肽库技术是将外源蛋白或多肽序列插入在M13嗤囷体衣壳蛋白P III的N末端，通过蛋白的融合表达将插入的随机多妝序列展不在嗤囷体表面。由于展示多肽位于P III的N末端，这些小肽通常能够保持较为独立的空间结构，从而能够模拟配体与特异性受体靶标相互作用。由于通过噬菌体展示肽库筛选所得到的多肽均为天然氨基酸残基所组成，易被酶降解且体内半衰期较短。镜像噬菌体筛选技术即以筛选靶蛋白的D-构型镜像分子为靶标，通过噬菌体展示肽库技术筛选能够与其结合的多肽配基，再合成这些多肽配基的镜像分子一D-构型多肽配基。由于筛选得到的天然多肽配基能特异性结合D-构型 靶蛋白，根据镜像对称关系，D构型多肽配基也能特异性结合天然构型的靶蛋白，因此该D-构型多肽即为天然靶蛋白的镜像配基。因此，发明人选用由D-构型氨基酸人工合成的I3D-Ll IgV区蛋白作为靶点，通过镜像噬菌体筛选技术得到D-构型的亲和肽，从而大幅度提高其抵抗酶降解的能力以延长体内作用半衰期。
[0012]本发明通过利用镜像噬菌体展示肽库筛选技术，以D-PD-LlIgV为靶点进行高通量的筛选，人工合成了具有抗肿瘤活性的D-构型亲和肽D2。发明人进一步通过小鼠体内荷瘤实验，证明了本发明所提供的靶向I3D-LlIgV亲和肽D2具有较好的抗肿瘤活性，能明显抑制小鼠体内肿瘤的增长，从而为基于ro-Li的药物研究和开发提供新的思路和理论基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是亲和肽D2的质谱鉴定图；
图2是亲和肽D2的瘤旁给药对荷CT26结肠癌小鼠体重变化的影响结果图；
图3是亲和肽D2的瘤旁给药对荷CT26结肠癌小鼠瘤体积变化的影响结果图；
图4是亲和肽D2的瘤旁给药对荷CT26结肠癌小鼠瘤重图；
图5是亲和肽D2的腹腔给药对荷CT26结肠癌小鼠体重变化的影响结果图；
图6是亲和肽D2的腹腔给药对荷CT26结肠癌小鼠瘤体积变化的影响结果图；
图7是亲和肽D2的腹腔给药对荷CT26结肠癌小鼠生存期影响结果图；
图8是亲和肽D2酶降解稳定性结果图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0015]实施例1
本发明所提供的具有抗肿瘤活性的ro-Ll IgV的D-构型亲和肽D2，特异性结合于PD-LlIgV区，是利用镜像噬菌体展示肽库技术筛选得到的，其氨基酸序列为:Lys-His-Ala-His-His-Thr-His-Asn-Leu-Arg-Leu-Pro, 即K-H-A-H-H-T-H-N-L-R-L-P，分子量为 1459.8。
[0016]由于通过常规噬菌体展示肽库筛选所得到的多肽均为天然氨基酸残基所组成，易被酶降解且体内半衰期较短。因此，我们选用由D-构型氨基酸人工合成的ro-Ll IgV区蛋白作为靶点，通过镜像噬菌体展示技术来筛选得到D-构型的拮抗肽，从而大幅度提高其抵抗酶降解的能力以延长体内作用半衰期。为便于本领域技术人员实施本发明，对其筛选过程简要说明如下:
筛选过程中所用培养基和主要溶液的配制说明如下:
LB液体培养基:称取胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠5 g，加超纯水定容至I L，121°C高压蒸汽灭菌20 min，冷却后室温贮存备用。
[0017]LB固体培养基:1 L LB液体培养基中加入15 g琼脂粉，加热使琼脂粉充分溶解，搅拌均匀并分装为100 mL/瓶，121°C灭菌20 min，冷却至室温后贮存备用。
[0018]LB/IPTG/Xgal平板:将100 mL LB固体培养基用微波炉加热溶解，冷却至60°C左右时，加入75 μ L IPTG/Xgal，小心混匀，避免产生气泡，倾倒入六孔板。平板于4°C冰箱避光贮存备用。IPTG/Xga按以下配方制备:称取0.5 g IPTG和0.2g Xgal溶于5 mL DMF(N，N- 二甲基甲酰胺)中，混匀后分装为300 μ L小份，于_20°C避光贮存。
[0019]上层琼脂:称取胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠5 g，MgCl2.6H20 I g，琼脂糖7 g，加超纯水定容至1L，微波炉煮沸3次，使琼脂糖充分溶解，冷却至60°C左右，分装成60mL的小份，121°C高压蒸汽灭菌20 min，冷却后室温存放备用。
[0020]LB-Tet (四环素)平板:微波炉加热溶解IOOmL LB固体培养基，冷却至60°C左右时，加入100 UL Tet贮液，混匀后倾倒六平板，待冷却凝固后4°C避光贮存，一周内使用完。四环素(Tet)贮液按以下配方制备:称取200 mg盐酸四环素，溶于10 mL的无水乙醇中，分装为300 μ L小份，于-20°C避光贮存。
[0021]包被液-0.1 M NaHCO3缓冲液(pH 8.6):称取NaHCO3 0.84g用80mL三蒸水溶解后用NaOH调PH至8.6，定容至lOOmL，121°C高压蒸汽灭菌20 min，冷却后4°C存放备用。
[0022]封闭液-0.1M NaHCO3 (pH8.6)、5 mg/mL BSA:称取 NaHCO3 0.84 g、BSA 0.5 g 用80mL三蒸水溶解后用NaOH调pH至8.6，定容至IOOmL,过滤除菌，分装为5 mL小份，4°C贮
存备用。
[0023]洗脱液-0.2 M 甘氨酸-HCl 缓冲液(pH 2.2)、I mg/mL BSA:量取 50mL 0.2M 甘氨酸溶液和44 mL 0.2M HCl溶液，加入200 mg BSA，加水定容至200 mL，过滤除菌，4°C备用。
[0024]中和液-1M Tris-HCl缓冲液(pH 9.1):称取12.114 g Tris碱，适量超纯水溶解，HCl调pH至9.1，定容、过滤除菌，分装备用。
[0025]TBS缓冲液-50 mM Tris-HCL(PH7.5)、150mM NaCl:按以下步骤制备，第一步先称取6.055 g Trisbase，用少量双蒸水(30(T500ml)溶解，再用浓HCl将pH调至7.5，最后加双蒸水至1000 ml，此步骤制备得Tris缓冲液(50 mM, PH7.5);第二步称取NaCl 8.766g，先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入第一步所制备的Tris缓冲液(50 mM,pH7.5)100ml，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀，高压灭菌即得。
[0026]洗涤液(TBST):0.1% (v/v) Tween-20 TBS, TBS 即前述 TBS 缓冲液。
[0027] PEG/NaCl:称取 PEG-8000 20 g，NaCl 14.61 g，加超纯水定容至 100 mL，121°C 高压蒸汽灭菌30 min，冷却至室温，4°C贮存备用。
[0028]筛选步骤:
(1)包被:采用片段拼接技术用D-构型的氨基酸化学合成ro-Ll蛋白的IgV区，经过尿素浓度梯度复性后得到目的蛋白D-PD-LlIgV (溶于0.1M pH 8.6的NaHCO3溶液)。用目的蛋白包被96孔板，15 48/孔(150^，100^/1^)，密闭湿盒41:孵育过夜;
(2)封闭:弃去包被液，用枪头吸出剩余残液并迅速加满封闭液，密闭湿盒4°C孵育3
h ；
(3)洗涤:TBST洗涤6次，每次不少于2min，注意无菌操作，动作要快以免微孔板干
燥；
(4)结合:快速加入预先用TBST稀释至滴度为2XIO11的文库的噬菌体100 μ L/孔，室温温和摇动Ih ;在这个过程中，与靶蛋白具有亲和力的噬菌体会结合在蛋白上；
(5)洗涤:TBST洗涤10次，洗去未结合的噬菌体；
(6)洗脱:每孔加入100μ L洗脱液，室温温和摇动20min ；
(7)中和:用移液枪小心吸出洗脱的噬菌体，转移至预先已加好15μ L中和液的灭菌离心管中，温和吹打混匀；
(8)扩增:把第一轮筛选得到的噬菌体与大肠杆菌ER2738加入LB液体培养基(Tet+)中共同培养，进行扩增和纯化，得到次级肽库；
(9)滴度测定:分别对各轮筛选得到的噬菌体以及扩增后的次级肽库在LB/IPTG/Xgal平板上进行噬菌体滴度测定，并进行回收率计算，噬菌体回收率=[洗脱噬菌体数/投入噬菌体数]X 100% ；
(10)重复筛选:将扩增得到的噬菌体投入下一轮筛选，重复上述筛选过程。经5轮亲和筛选，即可使得含目的多肽的噬菌体得到高度富集；
(11)测序:挑取第五轮筛选后的滴度测定平板上的噬菌斑进行扩增，取200μ L新鲜扩增的噬菌体贮存液送往金唯智测序公司进行全自动测序，测序引物为-96 gill测序引物:5’ -CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。
[0029]多肽序列分析:根据DNA测序结果推导其所编码的氨基酸序列，得到拮抗肽的氨基酸序列。
[0030]筛选结果:
(I)分别对各轮筛选得到的噬菌体洗脱液进行滴度测定，并计算投入噬菌体回收率，结果见下表。
【权利要求】
1.一种具有抗肿瘤活性靶向ro-Ll IgV亲和肽D2，其特征在于，该亲和肽D2属于D-构型，特异性结合于 F1D-Ll IgV 区，其氛基酸序列为:Lys-His-Ala-His-His-Thr-His-Asn_Leu-Arg-Leu-Pro,即 K-H-A-H-H-T-H-N-L-R-L-P，分子量为 1459.8。
2.权利要求1所述具有抗肿瘤活性靶向I3D-LlIgV亲和肽D2在制备抗结肠癌药物中的应用。
3.权利要求1所述具有抗肿瘤活性靶向ro-LlIgV亲和肽D2的制备方法，其特征在于，通过Fomc固相 多肽合成法制备。
【文档编号】A61K38/10GK103936836SQ201410177417
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】高艳锋, 刘蓓媛, 祁元明, 李国栋 申请人:郑州大学