包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法

专利名称：包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法
包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法发明领域本发明提供了蛋白质工程化的方法和变体蛋白酶。特别地，本发明提供了利用位 点评估文库的方法。本发明还提供了用于多种用途的枯草杆菌蛋白酶变体。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶是糖基水解酶的亚类，包含具有宽范围的特异性和生物学功能的不 同类别的酶。对枯草杆菌蛋白酶已经进行了大量研究，主要是出于其在清洁和饲料应用中 的用途。其他工作则着眼于在各种应用中可以负面影响这些酶的功能的不良环境条件(例 如，暴露于氧化剂、螯合剂、极端的温度和/或PH)。尽管如此，本领域仍然需要这样的酶系 统，所述酶系统能够抵抗这些不良条件，并保留或具有提高的本领域目前已知的活性。多种蛋白质工程化方法是已知的。通常，修饰蛋白质以得到希望的蛋白质性质。 在多数方法中，将克隆的编码蛋白质的基因的核苷酸序列突变并表达修饰基因以产生突变 体，对其筛选目的活性。通常，将突变体性质与野生型蛋白质的性质比较。历史上，蛋白质设计方法接近等同于在所有蛋白质空间发现用于所希望的应用 一种最佳序列的问题。该问题是极端困难并且是“NP难度的”。在复杂性理论中，被定义 为P类的问题被认为是容易和有效的，对于它们的解决方法存在多项式-时间算法。NP 难度问题是这样的问题，对于它们当前不知道有效的多项式时间算法，并且如果可以解 决任何NP难度问题，那么可以解决所有NP难度问题(见例如，Pierce and ffinfree, ProteinEngineer.，15 :779-782 [2002])。当前建立和筛选文库的策略一般涉及在整个序列 随机产生蛋白质序列多样性或者在蛋白质内的确定位置以受控的随机方式产生蛋白质序 列多样性。这些文库通常具有对于主要的目的性质为“消极”的许多成员，并且需要大量筛 选来发现相对少数的积极突变。通常，忽略消极突变，并仅仅得到积极成员的序列信息。饱和诱变(Estell et al.，in World Biotech Report 1984，vol. 2 :USA，Online Publications，London[1984]，181-187 页；和 Wells et al.，Gene 34 :315-323[1985])是 可以用于搜索蛋白质空间以发现优化蛋白质中一些性质的突变的一种技术。一些研究小组 已经开发了通过饱和诱变鉴定待改变位点的策略(Reetz et al.，Agnew. Chem. Int. Edn.， 44 :4192-4196 [2005] ；Kato et al.，J. Mol. Biol.，351 :683-692 [2005]；和 Sandberg et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ,90 :8367-8371 [1993])，但是还没有提出用于位点鉴定的一般 性系统。此外，因为多数蛋白质工程化方法产生了大量的氨基酸突变选择，一般需要筛选 许多变体来产生希望的蛋白质性质。通常，不断重复筛选来产生有益变体。从而，多数方法 是费事费时的。本领域不断需要有效并且产生所希望的结果的蛋白质工程方法。发明概述本发明提供了蛋白质工程方法。特别地，本发明提供了利用位点评估文库的方法。 具体地，本发明提供了利用对许多希望的性质所得的信息，以便理性并且有效设计将优化 那些性质的文库。在一些实施方案中，本发明提供了设计对于至少两种希望的性质改进的 文库。
本发明提供了鉴定蛋白质氨基酸序列中在改进蛋白质的希望性质中相关的位置 的方法。在一些尤其优选的实施方案中，本发明提供了确定哪些突变是所希望的以便产生 具有这些希望性质以及改进的性质的蛋白质的方法。在一些额外尤其优选的实施方案中， 本发明提供了鉴定比野生型蛋白质具有特定百分数改善(例如，对于一种性质比野生型的 110%更好)的氨基酸位置和突变。在仍然进一步优选的实施方案中，本发明提供了鉴定突 变的方法，所述突变提供了比野生型蛋白质至少一种改进许多的性质和至少一种额外的不 比野生型蛋白质显著更差的性质(例如，一种性质比野生型的110%更好，然而另一种性质 不比野生型的90%更差)。在还进一步优选的实施方案中，基于该信息构建了文库。在一 些实施方案中，使用所有鉴定的突变构建文库，而在一些其他实施方案中，使用所鉴定突变 的子集构建文库。实际上，文库不意在局限于任何具体的成员和/或突变类型。本发明提供了蛋白质工程化的方法，其包括步骤提供蛋白质变体文库；在目的 测试中测试蛋白质变体文库的至少一种目的性质；为所述至少一种目的性质鉴定值的范 围；鉴定该值范围内与目的测试中的有利结果相关的最小值；和提供具有高于所述至少一 种目的性质的范围内最小值的至少一种突变的多种蛋白质变体，从而提供包含至少一个突 变的蛋白质变体文库，并且其中该文库富含在目的测试中具有有利结果的成员。在一些 实施方案中，有利的结果对应于大于在上面第一步中给出的测试中观察到的最大值的约 50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约90 %、或约95 %的值。在一些备选实施方案中，在本发 明的方法中使用一个以上的目的测试。在一些优选实施方案中，蛋白质是酶。在一些尤其 优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化 酶、角质酶和脂肪酶。本发明还提供了蛋白质工程化方法，包括步骤提供蛋白质变体文库；在目的测 试中测试蛋白质变体文库的至少两种目的性质；为所述至少两种目的性质鉴定值的范围； 鉴定该值范围内与目的测试中的有利结果相关的最小值；和提供高于所述至少两种目的性 质的范围的最小值的多种蛋白质变体，从而提供富含在目的测试中具有有利结果的成员的 蛋白质变体文库。在一些优选实施方案中，有利的结果对应于在上面第一步中给出的测试 中观察到的最大值的约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、或约95%的值。在一些优 选实施方案中，蛋白质是酶。在一些尤其优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金 属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。本发明还提供了蛋白质工程化方法，包括步骤提供野生型蛋白质和野生型蛋白 质的蛋白质变体的文库；在目的测试中测试蛋白质变体文库和野生型蛋白质的至少一种目 的性质；鉴定所述至少一种目的性质的值范围；鉴定与目的测试中有利结果相关的值范围 中的最小值；鉴定与为野生型所得的结果相比具有有利结果的蛋白质变体，其中有利结果 是改进的目的性质；并提供高于所述至少一种目的性质范围的最小值的多种蛋白质变体， 从而提供富含在目的测试中具有有利结果的成员的改进蛋白质变体的文库。在一些优选 实施方案中，所述方法还包括确定性能指数的步骤，其中通过将为每种改进的蛋白质变体 得到的值和为野生型蛋白质得到的值相除确定性能指数。在一些尤其优选的实施方案中， 方法还包括鉴定改进的蛋白质变体的步骤，其中改进的蛋白质变体在目的测试中实现大于 1.1的性能指数值。在一些额外实施方案中，所述蛋白质是酶。在一些尤其优选的实施方 案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些备选实施方案中，所述蛋白质选自抗体和生长因子。在额外优选的实施方 案中，所述野生型蛋白质是选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化 酶、角质酶和脂肪酶的成熟形式。在一些优选实施方案中，目的性质选自电荷、洗涤性能、 硬表面清洁性能、溶解度、热稳定性、保存稳定性、洗涤剂稳定性、底物结合、酶抑制、表达水 平、反应速率和底物降解。在一些实施方案中，野生型蛋白质和蛋白质变体是至少一种洗涤 剂组合物的组分。在一些优选实施方案中，在配制成具有5到12. 0的pH的粉状或液体洗 涤剂的洗涤剂组合物中测试洗涤性能。本发明还提供了产生在蛋白质折叠内亲本蛋白的改进变体的方法，包括在目的 测试中测定跨越目的性质范围的蛋白质折叠内测试蛋白的多种变体；鉴定与目的测试中有 利结果有关的目的性质范围内的最小值；在目的测试中测试蛋白质折叠的亲本蛋白；并通 过在亲本蛋白质中引入氨基酸突变产生亲本蛋白的改进变体使得改进的变体高于目的性 质范围的最小值。在一些优选实施方案中，亲本蛋白和测试蛋白是不同的。在一些实施方 案中，所述方法还包括确定性能指数的步骤，其中通过将为每种改进的蛋白质变体得到的 值和为亲本蛋白质得到的值相除确定性能指数。在一些实施方案中，测试蛋白和亲本蛋白 是酶。在一些尤其优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉 酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些备选实施方案中，测试和亲本蛋白质选自抗 体和生长因子。在额外优选的实施方案中，所述亲本蛋白质是选自蛋白酶、转移酶、金属蛋 白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶的成熟形式。在一些优选实施方案 中，目的性质选自电荷、洗涤性能、硬表面清洁性能、热稳定性、溶解度、保存稳定性、洗涤剂 稳定性、底物结合、酶抑制、表达水平、反应速率和底物降解。在一些实施方案中，测试蛋白 和亲本蛋白是至少一种洗涤剂组合物的组分。在一些备选实施方案中，改进的蛋白质是洗 涤剂组合物的组分。在一些优选实施方案中，在配制成具有约5到约12. 0的pH的粉状或 液体洗涤剂的洗涤剂组合物中测试洗涤性能。本发明还提供了分离的芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体，其中枯 草杆菌蛋白酶变体是成熟形式，具有蛋白水解活性并且在选自以下位置的一个或多个位置 包含取代1,2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24， 25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52， 53，54，55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，72，73，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86， 87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110， 111，112，113，114，115，116，117，118，119，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131， 132，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153， 156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176， 177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196， 197，198，199，200，201，203，204，206，207，209，210，212，213，214，215，216，217，218，219， 220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241， 242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260， 261,262, 263，264，265，267,268, 269，270，271，272，273 和 274，其中所述位置通过与 SEQ ID NO 2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列对应进行编号。在一些实 施方案中，所述一个或多个位置选自1，2，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47， 48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，72，73，77，78，79，81，82， 83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106， 107，109，110，111，112，113，114，115，116，118，119，122，123，124，125，126，127，128，129， 131，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153， 156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176， 177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196， 197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222， 223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243， 244，245，246，247，248，249，250，251，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263， 264，265，267，268，269，270，271，272，273和 274，其中所述位置通过与 SEQ ID NO :2给出的 解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列对应进行编号。在一些其他实施方案 中，所述一个或多个位置选自2，3，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，20，21，21， 22，23，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，44，46，47，48，49，50，51，53，54， 55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，88，89，90，91， 92，93，94，95，96，102，105，106，110，111，112，113，114，115，116，122，123，124，125，126， 128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，145，146，147，148，149，150，151，152， 153，156，157，158，159，160，162，165，166，167，169，170，171，173，174，175，176，177，178， 179，180，181，182，183，184，186，187，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199,200, 201，203，204，206，207，212，214，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230， 231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，249，250， 251，253，254，255，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272， 273，和274，其中所述位置通过与SEQ ID NO :2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶 BPN'的氨基酸序列对应进行编号。在一些实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶变体还包含选 自18，52，72，117，119，127，144，185，209和213的一个或多个位置上的取代，并且其中所述 位置通过与SEQ ID NO :2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列对应进行编号。在-一些优选实施方案中，所述取代包含如下的一个或多个位置:A001C,A001D,A001E,A001F,A001G,A001H,A001I,A001K,A001L,A001M,A001N,A001Q,A001R,A001S,A001V,A001W,Q002A,Q002D,Q002E,Q002G,Q002S,S003A,S003D,S003F,S003G,S003I,S003K,S003L,S003M,S003N,S003P,S003Q,S003R,S003T,S003V,S003W,S003Y,P005C,P005E,P005G,P005N,P005Q,P005T,Y006A,Y006C,Y006E,Y006F,Y006G,Y006K,Y006M,Y006N,Y006P,Y006Q,Y006R,Y006T,Y006V,Y006W,S009A,S009C,S009E,S009F,S009G,S009H,S009K,S009L,S009M,S009P,S009Q,S009R,S009T,S009V,S009W,Q010A,Q010C,Q010E,Q010F,Q010G,Q010H,Q010I,Q010K,Q010L,Q010M,Q010R,Q010S,Q010T,Q010V,Q010W,I011C,I011L,I011T,I011V,I011Y,K012A,K012C,K012D,K012E,K012F,K012G,K012H,K012I,K012N,K012Q,K012S,K012T,K012V,K012W,K012Y,A013C,A013F,A013G,A013H,A013L,A013R,A013S,A013T,A013V,P014A,P014C,P014D,P014E,P014F,P014G,P014I,P014K,P014L,P014M,P014N,P014Q,P014R,P014S,P014T,P014V,P014W,P014Y,A015C,A015D,A015E,A015F,A015G,A015H,A015I,A015K,A015L,A015M,A015P,A015Q,A015R, A015T, A015V, A015Y, L016A, L016C, L016I, L016M, 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P225F, P225G, P225H, P225I, P225K, P225L, P225M, P225R, P225S, P225T, P225V, P225Y, A228P，A228R，A228S,A228T,A228W,G229A,G229H,G229I，G229S，A230C，A230E，A230G ，A230Q, A230R, A230S, A230T, A230V, A231C, A231I, A231P, A231R, I234A, I234C, I234L, I234M, I234N, I234P, I234Q, I234S, I234T, I234V, L235A, L235C, L235G, L235I，L235K, L235M, L235N, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, S236A, S236C, S236D, S236E, S236G, S236H, S236N, S236Q, S236T, S236V, S236Y, K237A, K237E，K237F, K237G,K237H,K237I,K237L,K237M,K237N,K237Q,K237R,K237S,K237T,K237V,K237W,K237Y,H238C,H238D,H238E,H238F,H238M,H238R,H238S,P239C,P239D,P239E,P239F,P239H,P239L,P239M,P239N,P239Q,P239R,P239S,P239T,P239V,P239W,P239Y,N240A,N240C,N240D,N240F,N240G,N240K,N240L,N240Q,N240R,N240S,N240T,N240V,N240W,N240Y,W241A,W241F,W241G,W241H,W241I,W241K,W241M,W241Q,W241T,W241V,T242A,T242C,T242E,T242F,T242G,T242K,T242M,T242N,T242P,T242R,T242S,T242W,T242Y,N243C,N243E,N243F,N243G,N243I,N243Q,N243S,N243T,N243V,N243W,N243Y,T244A,T244D,T244F,T244G,T244H,T244K,T244L,T244M,T244N,T244P,T244Q,T244R,T244S,T244V,T244W,T244Y,Q245A,Q245C,Q245D,Q245E,Q245H,Q245I,Q245K,Q245L,Q245M,Q245R,Q245T,Q245V,Q245Y,R247W,S248A,S248E,S248F,S248G,S248H,S248I,S248L,S248M,S248N,S248Q,S248R,S248T,S248V,S248W,S248Y,S249C,S249D,S249H,S249I,S249K,S249L,S249M,S249N,S249Q,S249R,S249T,S249V,S249W,S249Y,L250D,L250F,L250H,L250I,L250M,L250T,L250V,E251A,E251T,E251W,N252A,N252C,N252E,N252G,N252H,N252I,N252L,N252M,N252Q,N252R,N252S,N252T,N252V,N252Y,T253A,T253C,T253E,T253G,T253H,T253K,T253M,T253S,T253V,T254A,T254C,T254L,T254M,T254R,T254S,T254V,T255A,T255C,T255D,T255E,T255F,T255G,T255H,T255I,T255K,T255L,T255M,T255R,T255S,T255V,K256A,K256C,K256D,K256E,K256F,K256H,K256I,K256L,K256M,K256N,K256P,K256Q,K256R,K256S,K256T,K256V,K256W,K256Y,L257A,L257C,L257F,L257G,L257H,L257I,L257K,L257M,L257N,L257R,L257S,L257T,L257V,L257W,L257Y,G258Q,D259A,D259E,D259F,D259G,D259L,D259N,D259P,D259Q,D259R,D259S,D259T,D259V,D259W,D259Y,S260A,S260C,S260D,S260E,S260F,S260G,S260H,S260L,S260M,S260N,S260P,S260R,S260V,S260W,S260Y,F261H,F261W,Y262A,Y262C,Y262E,Y262F,Y262H,Y262L,Y262M,Y262N,Y263F,Y263M,Y263T,G264F,G264I,G264L,K265A,K265C,K265E,K265G,K265H,K265L,K265M,K265N,K265Q,K265R,K265S,K265W,K265Y,G266C,G266F,G266L,G266M,G266P,G266R,G266V,G266W,G266Y,L267A,L267C,L267E,L267G,L267H,L267I,L267M,L267N,L267Q,L267S,L267T,L267V,I268A,I268C,I268K,I268L,I268M,I268P,I268R,I268V,N269D,N269E,N269K,N269L,N269P,N269Q,N269S,Q271A,Q271C,Q271D,Q271E,Q271F,Q271G,Q271H,Q271I,Q271K,Q271L,Q271M,Q271N,Q271P,Q271R,Q271S,Q271T,Q271V,Q271W,Q271Y,A272E,A272F,A272G,A272H,A272K,A272L,A272M,A272N,A272Q,A272R,A272S,A272T,A272V,A272W,A272Y,A274C,A274D,A274F,A274G, A274H, A274I, A274K, A274L, A274Q, A274S, A274T，和 A274V。 在一些优选实施方案中，所述取代包含选自Y021H-A045V-Y217E，Y02Iff-S10IE-G128R-Y217Q, Y021H-Y217E, YO21H-AO45V-S101 N-Y217Q ,Y021H-A045I-Y217E, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021W-A045I-S101E-Y217E, D036N-S101E-Y217L, YO21H-AO45V-Y217Q , YO2 1H-AO45 I-S 101E-Y217L， Y021H-A045I-Y217E, Y021H-Y217Q, Y021W-S101E-Y217L, Y021W-A045V-S101E-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217E, S101E-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-Y217L, Y021W-A045I-S101N-Y217L, S 101N-K213 I-Y217Q，YO21W-S101 N-Y217L , Y021H-S101E-Y217E, M119F-K213K-Y217Q, Y021W-A045V-Y217E, Y021W-A045I-Y217E, M119F-K213I-Y217Q, Y021W-Y217E-N212S, Ml19F-K213L-Y217E, K213I-Y217Q, A045I-Y217Q, YO21ff-AO45V-S101E-Y217Q , YO21H-AO45V-S101E-Y217L , SlOlS-Ml19F-K213I-Y217Q, K213N-Y217Q, M119F-Y217Q, S024H-A092G-A114G, S101N-M119F-K213I-Y217Q, S101N-K213L-Y217Q, SlOlN-Ml19F-K213K-Y217L, SlOlN-Ml19F-K213I-Y217L, Y021H-A045V-S101E, S101N-K213L-Y217E, A045V-Y217L, S101N-K213I-Y217L, SlOlS-Ml19M-K213K-Y217L, Y021H-Y217L, S101E-K213L-Y217L, K213I-Y217E, S 101N-M119F-Y217E，Y021W-A045V-Y217L, A092G-A114G, S024H-A092G-Q103E, Y021W-S101E, V26Q-K213I, Y021H-S101N, S101E-K213N-Y217E 的组合。在一些实施方案中，所述取代包含选自S024S-V028V-M050M-A092A-Q10 3E-A114G-V246V, S024S-V028V-M050V-A092A-Q 103Q-A114A-V246V, S024S-V028V -M050V-A092A-Q103Q-A114G-V246V， S024H-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114A-V2 46T, S024H-V028V-M050V-A092A-Q103E-A114A-V246V, S024H-V028V-M050V-A092A -Q103Q-A114G-V246V, S024H-V028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246V, S024H-V 028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246T, S024S-V028V-M050M-A092G-Q103Q-A114 A-V246T, S024H-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T, SlOlE-Ml19N-K213N, S101N-K213I, S101N-M119H, Ml19H-K213I-Y217L, SlOlN-Ml19H-K213N-Y217L, S101N-K213L-Y217E, Ml19N-K213N-Y217L, Ml19F-K213L-Y217E, S101P-K213N, S101N-M119H-K213N, S10IN-Ml19F-K2131-Y217L, K213L, M119N-K213N, K213N, K213I-Y217E, SlOlN-Ml19H-Y217Q, S101P-K213N-Y217L, M119N-K213I, K213N-Y217Q, Ml 19H-K213N, S 1 0 1N-K213L-Y217Q，S101P-K213N, S 1 0 1 E_K213N-Y217E， SlOlE-Ml19H-K213I-Y217Q, S101E-M119H-K213N， K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217Q， M119H-Y217Q, SlOIN-MI19N-K213N-Y217Q，Ml19H-K213I-Y217Q，K213I-Y217Q， S101E-M119N-Y217L, M119F-K213L, Ml19H-K213N-Y217E, SlOlN-Ml19N-K213N-Y217Q, SlOlN-Ml19H-K213N-Y217Q, Ml19H-K213I-Y217Q， Y217Q, Ml19H-K213N-Y217Q， S101N-M119F-Y217E, M119F-Y217Q， SlOlN-Ml19F-K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217L， SlOlN-Ml19H-K213N-Y217L, S 101E-K213L-Y217L，S 101N_K213N-Y217Q， S101N-M119H-K213L, S101N-M119H-K213I， S101P-K213N-Y217L， Ml19F-K213I-Y217Q， S101N-K213I-Y217Q, SlOlE-Ml19H-K213I-Y217L, SlOlN-Ml19H-K213I-Y217Q, M119H-K213N-Y217E, S10IN-Ml19N-K213N-Y217L, A048E-K213L, A048H-K213L, V026Q-A048Y-K213L, K213N, V026N-K213L, V026N-K213L, V026Y-K213N, A048D-K213N, V026Q-A048E-K213L, A048H-K213N, V026Q-A048H-K213L, A048H-K213L, K213L, K213N, V147D-K213L, K213I, V026Q-A048E-K213N, V026N-A048E-K213N, A048E-K213L, VO26Y-A048E-K2 1 3 I, A048D-K213N, K213I, A048H-K213N,V147D-K213N, Y021H-A045V-S101E-Y217L, Y021H-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-A045I-S101E-Y217L, Y021H-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, A045V-Y217L, Y021H-A045V-S101N-Y217Q, YO21W-S101 P-Y217L , YO21ff-AO45 I-Y217E , Y021H-A045V-S101E-Y217E, Y021H-A045I-S101E-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, Y021W-S101E-Y217L, S101E-Y217L, Y021H-A045V-Y217Q, Y021H-Y217E, Y021W-Y217E-(N0212S) , A045I-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, Y021W-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-S101E-Y217E, Y021W-S101N-Y217L, S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114A-V246T, Y021H-A045V-S101E, Y021W-A045V-S101E-Y217L, SlOlN-Ml19H-K213K-Y217Q, SlOlS-Ml19N-K213N-Y217Q, Y021H-A045V-S101P-Y217L, S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T, S10 1 S-Ml19F-K2131-Y217Q, SlOlS-Ml19M-K213K-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-S101E-Y217E, Y021H-A045V-S101E, Y021H-Y217L, Y021H-A045I-Y217E, Y021W-A045I-S101E-Y217E, S101N-M119F-K213K-Y217L, SlOlE-Ml19H-K213N-Y217E, Y021H-A045I-Y217E, S101S-M119H-K213L-Y217L, Y021H-Y217E, S101S-M119F-K213K-Y217Q，禾P Y021H-A045I-S101E-Y217L的组合。在一些实施方案中，所述取代包含选自S0MS_ V028T-M050V-A092G-Q103E-A114G-V246T, S101N-M119H, M119N-K213N-Y217L, Y217L, M119N-K213N, K213N, K213N-Y217Q, S101E-K213N-Y217E, SlOlE-Ml19N-Y217L, Y217Q, SlOlN-Ml19N-K213N-Y217E, SlOlN-Ml19N-K213N-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217L, S101E-Y217L, A045I-Y217Q，SlOlS-Ml 19M-K213K-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217L 的组口 O本发明还提供了包括在实施例中提供的表中给出的变体，以及包含这些变体的组 合物。本发明还提供了分离的编码枯草杆菌蛋白酶变体的核酸、包含所述核酸的表达载 体，和包含该表达载体的宿主细胞。此外，本发明提供了包含枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组 合物。在一些实施方案中，清洁组合物是洗衣洗涤剂。在一些实施方案中，洗衣洗涤剂是冷 水洗涤剂、低PH洗涤剂或者浓缩洗涤剂。此外，本发明提供了生产芽孢杆菌枯草杆菌蛋白 酶的枯草杆菌蛋白酶变体的方法，包括用包含编码枯草杆菌蛋白酶变体的核酸的表达载 体转化宿主细胞；并在适于产生该枯草杆菌蛋白酶变体的条件下培养转化的宿主细胞。在 一些实施方案中，所述方法还包括收获产生的枯草杆菌蛋白酶变体的步骤。在一些实施方 案中，宿主细胞是芽孢杆菌物种，在这些实施方案的子集中，所述芽孢杆菌物种是枯草芽孢 杆菌。此外，本发明提供了清洁方法，包括将包含织物的表面和/或物品与包含分离的枯草 杆菌蛋白酶变体的清洁组合物接触。此外，本发明提供了蛋白酶工程化方法，包括步骤a)提供多个位点评估文库 (SEL)，每个文库包含在蛋白酶的相同氨基酸位置具有不同取代的多个蛋白酶变体；b)在 目的性质测试中测试SEL的蛋白酶变体和标准蛋白酶；c)为该测试的蛋白酶变体的每一种 确定性能指数(PI) ；d)将两个或多个氨基酸位置鉴定为非限制性位置；其中两个SEL的每 一个中所述多种蛋白酶变体的至少一种具有大于0.5的PI ；和f)提供多突变文库，其包含 许多多取代的蛋白酶变体，每种变体在两个或更多非限制性位置包含取代。在一些实施方 案中，所述测试包括选自污渍去除测定(微样品)、LAS稳定性测定、洗涤剂稳定性测定和比活性测定的两种或多种不同的测定法。在一些实施方案中，蛋白酶选自细菌丝氨酸蛋白酶、 细菌枯草杆菌蛋白酶和细菌中性金属蛋白酶。在进一步的实施方案中，本发明提供了产生芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的多取代 的枯草杆菌蛋白酶变体的方法，包括在第一种性质的第一种测试和第二种性质的第二种 测试中测试多种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体，其中亲本枯草杆菌蛋白酶的性质在每种测 试中被给予1.0的值，有利的第一种或第二种性质具有大于1. 0的值，并且过分不利的第一 种或第二种性质具有小于约0. 80的值或者在一些优选实施方案中，小于约0. 60 ；鉴定至少 一种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体中与有利的第一种性质相关并且不与过分不利的第二 种性质相关的取代；鉴定至少一种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体中与有利的第二种性质相 关并且不与过分不利的第一种性质相关的取代；并将来自前面步骤的取代引入枯草杆菌蛋 白酶中以产生多取代的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施方案中，方法还包括在第一种测 试和第二种测试中测试多取代的枯草杆菌蛋白酶变体，其中改进的枯草杆菌蛋白酶变体实 现在第一种和第二种中测试中均大于1. 0的值，或者在第一种测试中大于1. 0的值并且在 第二种测试中为0. 80到1. 0的值。在一些实施方案中，方法还包括产生改进的枯草杆菌蛋 白酶变体。在一些实施方案中，第一种和第二种性质负相关。在一些实施方案中，有利的第 一种或第二种性质具有大于约1. 2的值。在一些实施方案中，过分不利的第一种或第二种 性质具有小于约0. 40的值。在一些实施方案中，第一种性质是稳定性，第二种性质是洗涤 性能。在这些性质的子集中，稳定性包括洗涤剂中的稳定性并且洗涤性能包括洗涤剂中的 血奶墨(BMI)洗涤性能。在一些实施方案中，亲本细菌枯草杆菌蛋白酶是具有SEQ ID NO 2给出的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的野生型成熟形式。在其他实 施方案中，亲本细菌枯草杆菌蛋白酶是迟缓芽孢杆菌(B. lentUS)GG36枯草杆菌蛋白酶的 野生型，具有SEQ ID NO :562给出的氨基酸序列，或者是BPN”，包含Y217L取代(SEQ IDNO 565)，单独或者与其他修饰组合。在本发明的一些实施方案中，在具有5到12. 0的pH的粉 状或者液体洗涤剂组合物中测试洗涤性能。所述步骤不意在局限于上面所列的确切顺序， 因为任何合适的顺序可用于本发明。然而，在一些优选实施方案中，所述取代是在亲本枯草 杆菌蛋白酶中具有大于约50%或大于约65%的溶剂可及表面(SAS)的位置中。附图
简述图IA 提供 了 pHPLT-VAAc 1 的图，而图 IB 提供 了 pHPLT-BPN，的图。图2A描述了北美洗衣洗涤剂中BPN，_Y217L CCL的BMI清洁性能作为电荷改变的 函数。类似地，图2B描绘了在北美洗衣洗涤剂中GG36CCL的BMI清洁性能作为电荷改变的函数。图3A描绘了西欧液体洗衣洗涤剂中BPN，_Y217L CCL的BMI清洁性能作为电荷改 变的函数。类似地，图3B描绘了西欧液体洗衣洗涤剂中GG36CCL的BMI清洁性能作为电荷 改变的函数。图4A描绘了日本粉状洗衣洗涤剂中BPN，-Y217L CCL的BMI清洁性能作为电荷改 变的函数。类似地，图4B描绘了日本粉状洗衣洗涤剂中GG36 CCL的BMI清洁性能作为电 荷改变的函数。图5A描绘了自动餐具洗涤剂中BPN’_Y217L CCL的烘焙蛋黄清洁性能作为电荷改 变的函数。类似地，图5B描绘了自动餐具洗涤剂中GG36CCL的烘焙蛋黄清洁性能作为电荷改变的函数。图6描绘了对于含有80种变体的文库，LAS/EDTA稳定性作为相对于亲本 BPN，-Y217L的净电荷改变的函数。发明描述本发明提供了蛋白质工程化方法。特别地，本发明提供了利用位点评估文库的方法。为了实际目的，通常不必在蛋白质空间中发现最好的序列以便产生对于具体应用 为最优的蛋白质。对于多数应用，待解决的问题是鉴定满足或者超过许多性质所需的最小 值的至少一种蛋白质序列。这需要对于具体性质有益的突变的知识，以及对于任何希望的 性质有害的那些突变的知识。本发明通过鉴定蛋白质中可以被改变以改善主要性质和将对 于其他性质的值保持在希望的范围内的那些位置，提供了满足该目标的方法。本发明提供了通过在每个位点建立“文库评估文库”评估蛋白质中所有位置的所 有目的性质的方法。在优选实施方案中，这些文库在每个位置含有9-19个突变，并且用于 评估每个位置在工程化蛋白质和构建文库中的用途。测量相对于亲本酶的每种性质并且计 算每种突变体相对于野生型的表观自由能差异。然后将这些delta delta G(即，Δ AG”) 表观值用于确定可加性。一种分析变体的理想方法将是通过在目的过程中变体相对于亲本蛋白的自由能 差异。过程的吉布斯自由能代表系统可以做功的最大量。相对于亲本酶的自由能改变 (Δ AG)在如下给出Δ Δ G = -RT In (k 变体 /k 亲本)其中是变体酶的速率常数，并且是亲本酶的速率常数，R是气体常数，T是 绝对温度。多数测定法没有被构建成允许测定真正的自由能，因此我们利用量Δ Δ Gapp = -RT In (P 变体 /P 亲本)其中是变体的性能值，P1^是在相同条件下亲本酶的性能值。可以预期 Δ △ Gapp值对于数据分布和可加性具有与Δ △ G相似的方式。然而，因为Δ Δ G是与亲本酶 相比变体可以做功的最大量，所以量Δ AGapp将通常低估了 Δ AG并且导致似乎协同的结 果，因为两个相加位置的性质可以大于通过将它们Δ AGapp值相加预测的值。本发明的方法用于设计有效文库，该文库用于平行地改造多个性质。尽管在本文 描述了一些酶，但是方法适用于任何用于工程化的目的蛋白质。通过在每个位置引入12到 19个取代，如本文所述的构建位点评估文库(SEL)。使用活性和稳定性测定法分析所得的 突变。将野生型氨基酸列为每个位置的参考点。对于每种性质，用测量结果确定亲本蛋白 的Δ AGapp的平均值和标准差。将亲本平均值(μ 归一化为0，并确定Δ AGapp的标准 差(σ ^J。这些值用作分子的每个位置上每种性质的参考值。检验位点评估数据的性质 之间的相关性证据。将每种性质的△ AGapp值对每种其他性质作图并计算相关系数。蛋白 质底物的两种活性测量结果是相关的。为了分析氨基酸序列内的位置，定义了两种类型的位点。“非生产性”位点没有好 于亲本酶的突变体，而“生产性”位点具有至少一个好于亲本酶的取代。位点将是生产性 的概率通过生产性位点除以位点总数给出。尽管任一突变将好于亲本酶的概率很低(即， 6% )，但是给定位点将具有至少一个向上突变(Up mutation)的概率相当高。
重要的是确定生产性和非生产性位点在结构特征(例如，埋藏的氨基酸、相互作 用的氨基酸、活性位点附近的位置，等等)方面在蛋白酶中是怎样分布的，以及在进化中保 守的或者可改变的序列位点。为了做出该确定，检查结构并将序列与非冗余同源物比对。如实施例中指出，任何性质的有害突变与每个其他性质的有害突变相关，不管性 质的相关性如何。仅仅少数位置(5-10%)具有对所有性质有害的突变。这些位置定义了 “折叠” (fold)并且在进化中保守。其含意是尽管对于任何性质，有益突变的鉴定需要该性 质的真实预测筛选，但是鉴定可能对任一性质有害的突变可以使用ANY筛选完成。一种简 化的蛋白质工程化策略是建立SEL并使用简单的活性和/或稳定性筛选方法进行筛选。鉴 定有害突变并且具有很少有害突变的那些位置用于构建文库和组合突变来改进多种性质。 而且，挑选在蛋白质表面上、有很少的相互作用并且在序列比对中可变的位点提供了高比 例的生产性位点。在分子内部、具有许多接触并且在进化中强烈保守的位点具有有害突变 的概率很高并且应该避免。设想用于分析序列和/或结构信息的任何合适方法将可用于本 发明，包括但不限于计算机和/或电学方法和/或程序。方法提供了对于两种性质的每一种具有大于5% Wt活性和小于5%活性的变体数 目的逐对比较，以及这两种性质的相关系数。文库设计在一些尤其优选的实施方案中，位点评估文库用于组合文库设计。常规的定向进 化建立了随机文库并且为单一性质筛选大量文库，将这些组合并重复该方法。如一些研 究人员已经发现(见例如，Bloom et al.，Curr. Opin. Struct. Biol.，15 :447-452[2005]； Bloom et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 :5869-5874 [2006]；禾口 Guo et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :9205-9210 [2004])，一种性质的积极突变的积累通常导致其他性 质中的降低。任一突变对于任一性质将是向上的概率是小的，并且任一突变将是向下的概 率是高的(> 85% )，并且积累三个(3)以上增加活性的突变将导致一些其他性质的降低 的概率是相当高的。通过使用位点评估数据建立将对于多种性质有益的文库避免了该问 题。在组合文库中不包括非生产性位点，并且通过向上的突变百分比进一步对生产性位点 分类。清洁组合物本发明的清洁组合物有利地用于例如洗涤应用、硬表面清洁、自动洗碟应用，以及 美容应用，如义齿、牙齿、头发和皮肤。然而，由于在较低温度溶液中增加的有效性的独特优 点，本发明的酶理想地适于洗涤应用。此外，本发明的酶可用于粒状和液体组合物中。本发明的变体蛋白酶也可以用于清洁添加剂产品中。在一些实施方案中，可用于 低温溶液清洁应用。添加剂产品在其最简单的形式中可以是一种或多种蛋白酶。在一些实 施方案中，将添加剂以剂型包装用于加入清洁过程中。任何合适的单一剂型也可以用于本 发明，包括但不限于，丸剂、片剂、软胶囊、或者其他单一剂量单位，如预先测量的粉剂或液 体。在一些实施方案中，包括填充剂或载体材料以增加此类组合物的体积。合适的填充剂 或者载体材料包括但不限于，多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石粉、粘土等等。用于液 体组合物的合适填充剂或载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和 二元醇。此类醇的实例包括，但不限于，甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，组 合物含有约5%到约90%的此类物质。酸性填充剂可用于降低pH。备选地，清洁添加剂包括如下文更详细描述的附属成分。本清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的至少一种本文提供的蛋白酶变体，其单 独或者与其他蛋白酶和/或额外酶组合。通过加入一种或多种本发明的蛋白酶变体实现酶 的所需水平。典型的，本清洁组合物将包含至少约0.0001重量百分比，约0. 0001到约1、约 0. 001到约0. 5、或甚至约0. 01到约0. 1重量百分比的至少一种本发明的变体蛋白酶。典型地配制本文的清洁组合物使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有约 5. 0到约11. 5或甚至约7. 5到约10. 5的pH。典型地配制液体产品制剂以具有约3. 0到约 9. 0或甚至约3到约5的净pH。典型地配制粒状洗衣产品以具有约9到约11的pH。用于 将PH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等等，并且是本领域技术人员 公知的。合适的低pH清洁组合物通常具有约3到约5的净pH，并且通常没有在这种pH环 境中水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括烷基硫酸钠表面活性剂，其包含至少一个环 氧乙烷部分或者甚至约1到约16摩尔的环氧乙烷。此类清洁组合物通常包含足够量的pH 修饰剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或者氢氯酸，以提供具有约3到约5的净pH的此类清洁组合 物。此类组合物通常包含至少一种酸稳定的酶。在一些实施方案中，组合物是液体，而在其 他实施方案中，它们是固体。此类液体组合物的PH通常测量为净pH。此类固体组合物的 PH作为所述组合物的10%固体溶液测量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施方案中，在20°C 进行所有PH测量。在一些实施方案中，当变体蛋白酶用于粒状组合物或液体中时，希望变体蛋白酶 为经封装颗粒形式以保护该变体蛋白酶免于保存期间粒状组合物的其他组分的作用。此 外，封装也是在清洁过程中控制变体蛋白酶可用性的一种手段。在一些实施方案中，封装增 强了变体蛋白酶和/或额外酶的性能。在这方面，用本领域已知的任何合适的封装材料封 装本发明的变体蛋白酶。在一些实施方案中，封装材料通常封装本发明变体蛋白酶的至少 部分催化剂。通常，封装材料是水溶性的和/或水可分散的。在一些实施方案中，封装材料 具有0°C或更高的玻璃转化温度(Tg)。玻璃转化温度在WO 97/11151中更详细描述。封装材 料选自糖类、天然或合成的树胶、壳多糖、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、 硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡和其组合。当封装材料是糖类时，其通常选自单糖、寡糖、 多糖和其组合。通常，封装材料是淀粉。合适的淀粉描述于EP 0 922 499 ；US 4,977, 252 ； US 5，354，559，和US 5，935，826。在一些实施方案中，封装材料是塑料如热塑塑料、丙烯腈、 甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和其混合物制成的微球体；可使用的可商购微球体包 括以 EXPANCEL (Stockviksverken，Sweden) JPPM 6545，PM 6550，PM 7220，PM 7228， EXTENDOSPHERES ，LUXSIL Q-CEL ⑧，和 SPHERICEL (PQ Corp. ,Valley Forge, PA)提 供的微球体。如本文所述，本发明的变体蛋白酶可尤其用于清洁工业，包括，但不限于洗衣和洗 碟洗涤剂。这些应用将酶置于多种环境胁迫下。本发明的变体蛋白酶由于在多种条件下的 稳定性相对于许多当前使用的酶提供了益处。实际上，有多种洗涤条件，包括参与洗涤的蛋白酶所暴露的不同的洗涤剂制剂、 洗涤水体积、洗涤水温度、和洗涤时间长度。此外，用于不同的地理区域的洗涤剂制剂 存在于洗涤水中的相关组分具有不同浓度。例如，欧洲洗涤剂通常在洗涤水中具有约4500-5000ppm的洗涤剂组分，而日本洗涤剂通常在洗涤水中具有约667ppm的洗涤剂组分。 在北美，尤其在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。低洗涤剂浓度系统包括其中在洗涤水中存在少于约SOOppm洗涤剂组分的洗涤 剂。日本洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在约667ppm 的洗涤剂组分。中洗涤剂浓度包括其中在洗涤水中存在约800ppm到约2000ppm洗涤剂组分的洗 涤剂。北美洗涤剂通常被认为是中等洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在约 975ppm的洗涤剂组分。巴西洗涤剂通常具有存在于洗涤水中约1500ppm的洗涤剂组分。高洗涤剂浓度系统包括洗涤剂，其中洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组 分。通常认为欧洲洗涤剂是高洗涤剂浓度系统，其通常在洗涤水中含有约4500-5000ppm的 洗涤剂组分。拉丁美洲洗涤剂通常是高泡磷酸增洁洗涤剂，拉丁美洲使用的洗涤剂范围可落入 中洗涤剂浓度和高洗涤剂浓度之间，因为它们在洗涤水中的洗涤剂组分范围在1500ppm至 6000ppmo如上所述，巴西洗涤剂通常在洗涤水中含有约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其 他高泡磷酸增洁洗涤剂地区，不限于其他拉丁美洲国家，可具有高洗涤剂浓度系统，在洗涤 水中存在高达约6000ppm的洗涤剂组分。鉴于上述内容，很显然，典型的洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度在世界范围内变 动，从低于约SOOppm的洗涤剂组合物(“低洗涤剂浓度系统”)，例如日本的约667ppm，到在 约800ppm至约2000ppm之间(“中洗涤剂浓度系统”)，例如美国的约975ppm和巴西的约 1500ppm,到大于约2000ppm( “高洗涤剂浓度系统”)，例如欧洲的约4500ppm至约5000ppm， 以及高泡磷酸增洁洗涤剂地区的约6000ppm。根据经验确定典型洗涤溶液的浓度。例如，在美国，典型的洗衣机容纳体积约 64. 4L的洗涤溶液。因此，为了获得洗涤溶液中约975ppm的洗涤剂浓度，应该向64. 4L洗涤 溶液中添加62. 79g的洗涤剂组合物。该量是消费者利用洗涤剂提供的量杯量入洗涤水中 的典型量。在另一实例中，不同地区使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水的温度通常低于欧 洲使用的温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常在10至30°C (如，约20°C )，而欧洲洗 涤水温度一般在30至60°C (如，约40°C )。在另一实例中，不同地区通常具有不同的水硬度。水硬度一般通过每加仑混合的 Ca2+/Mg2+的格令(grain)数来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的度量。美国的 多数水是硬水，但硬度值不同。中等硬度水(60-120ppm)至硬水(121-181ppm)具有60至 ISlppm的硬度矿物(ppm转换成格令/美制加仑是ppm数除以17. 1等于格令/加仑)。
权利要求
1.芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋 白酶变体是成熟形式，具有蛋白水解活性并且包含在一个或多个位置上的取代，所述位置 选自:1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26， 27，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54， 55，56，57，58，59，60，64，65，66，67，71，72，73，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88， 89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112， 113，114，115，116，117，118，119，122，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134， 135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158， 159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179， 180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199， 200，201，203，204，206，207，209，210，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223， 224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244， 245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263， 264，265，267，268，269，270，271，272，273和 274，其中所述位置对应于SEQ ID NO :2给出的 解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述一个或多个位置选自1，2，5， 6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，28，29，30，31，33， 35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60， 64，65，66，67，71，72，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95， 96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112，113，114，115，116，118， 119，122，124，125，126，127，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145， 146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167， 169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187， 188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，213， 214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235， 236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，253，254，255， 256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273 和 274，其 中所述位置对应于SEQ ID NO :2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序 列。
3.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述一个或多个位置选自2，3，5，6，7，8， 9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，20，21，21，22，23，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39， 40，41，42，44，46，47，48，49，50，51，53，54，55，56，57，58，59，60，64，65，66，67，71，73，77， 78，79，81，82，83，84，85，86，88，89，90，91，92，93，94，95，96，102，105，106，110，111，112， 113，114，115，116，122，124，125，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，145， 146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，165，166，167，169，170， 171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，186，187，189，190，191，192， 194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，214，216，217，218，219，220， 222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242， 243，244，245，246，247，249，250，251，253，254，255，257，258，259，260，261，262，263，264，-265，267，268，269，270，271，272，273，和 274，其中所述位置对应于 SEQ ID NO :2 给出的解 淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
4.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体还包含在选自 18，52，72，117，119，127，144，185，209和213的一个或多个位置上的取代，其中所述位置对 应于SEQ ID NO :2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
5.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述取代包含如下的一个或多个:A001C,A001D,A001E,A001F,A001G,A001H,A001I,A001K,A001L,A001M,A001N,A001Q,A001R,A001S,A001V,A001W,Q002A,Q002D,Q002E,Q002G,Q002S,S003A,S003D,S003F,S003G,S003I,S003K,S003L,S003M,S003N,S003P,S003Q,S003R,S003T,S003V,S003W,S003Y,P005C,P005E,P005G,P005N,P005Q,P005T,Y006A,Y006C,Y006E,Y006F,Y006G,Y006K,Y006M,Y006N,Y006P,Y006Q,Y006R,Y006T,Y006V,Y006W,S009A,S009C,S009E,S009F,S009G,S009H,S009K,S009L,S009M,S009P,S009Q,S009R,S009T,S009V,S009W,Q010A,Q010C,Q010E,Q010F,Q010G,Q010H,Q010I,Q010K,Q010L,Q010M,Q010R,Q010S,Q010T,Q010V,Q010W,I011C,I011L,I011T,I011V,I011Y,K012A,K012C,K012D,K012E,K012F,K012G,K012H,K012I,K012N,K012Q,K012S,K012T,K012V,K012W,K012Y,A013C,A013F,A013G,A013H,A013L,A013R,A013S,A013T,A013V,P014A,P014C,P014D,P014E,P014F,P014G,P014I,P014K,P014L,P014M,P014N,P014Q,P014R,P014S,P014T,P014V,P014W,P014Y,A015C,A015D,A015E,A015F,A015G,A015H,A015I,A015K,A015L,A015M,A015P,A015Q,A015R,A015T,A015V,A015Y,L016A,L016C,L016I,L016M,L016Q,L016S,L016T,H017F,H017I,H017L,H017M,H017V,H017W,H017Y,S018A,S018E,S018F,S018G,S018H,S018I,S018K,S018L,S018M,S018N,S018P,S018Q,S018R,S018T,S018V,S018W,S018Y,Q019A,Q019C,Q019D,Q019E,Q019G,Q019I,Q019K,Q019M,Q019R,Q019T,Q019V,G020A,G020C,G020D,G020E,G020F,G020H,G020K,G020M,G020N,G020P,G020Q,G020R,G020S,G020W,Y021A,Y021C,Y021D,Y021E,Y021F,Y021G,Y021H,Y021K,Y021M,Y021R,Y021S,Y021T,Y021V,Y021W,T022A,T022C,T022E,T022F,T022G,T022H,T022I,T022K,T022L,T022M,T022N,T022Q,T022S,T022V,T022W,T022Y,S024C,S024F,S024G,S024H,S024I，S024K ，S024L, S024M, S024N, S024Q, S024R, S024T, S024W, S024Y, N025C, N025E, N025F, N025G, N025H, N025I, N025K, N025L, N025M, N025P, N025R, N025S, N025T, N025V, N025W, K027A, K027D, K027E, K027F, K027G, K027H, K027L, K027M, K027P, K027R, K027S, K027W, K027Y, D032A, D032C, D032E, D032G, D032I, D032K, D032L, D032M, D032N, D032R, D032S, D032T, D032V, D032Y, S033A, S033F, S033G, S033H, S033P, S033T, S033W, I035A, I035C, I035D, I035R, I035S, I035T, I035V, D036A, D036C, D036E, D036Q, D036S, D036W, S037A, S037C, S037E, S037F, S037G ， S037H, S037K, S037L, S037M, S037P, S037Q, S037R, S037T, S037W, H039C, H039Q, H039T, H039V, P040A, P040C, P040E, P040F, P040G, P040G, P040H, P040I, P040K, P040L，P040M, P040N, P040Q, P040R, P040S, P040T, P040V, P040W, D041E, L042I, L042M, L042V, K043A, K043C, K043D, K043E, K043F, K043G, K043I, K043L, K043M, K043N, K043R, K043S, K043T, K043V, K043W, K043Y, V044A, V044C, V044I, V044L, V044M, V044P, V044S, V044T, A045C, A045E, A045F, A045H, A045I, A045K, A045L, A045M, A045N, A045P, A045Q, A045S, A045T, A045V, A045Y, G046A, G046C, G046E, G046H, G046K, G046M, G046N,G046Q,G046T,G046W, G046YA048C,A048D,A048E,A048F,A048H,A048I, A048K,A048L,A048M,A048Q,A048R, A048SA048T,A048V,A048W,A048Y,M050A,M050C, M050F,M050H,M050I,M050K,M050L, M050QM050R,M050S,M050T,M050V,M050W,M050Y, V051A,V051C,V051D,V051E,V051H,V051I，V051L, V051PV051QP052C,P052D,P052E, 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M124T, M124V,M124W,S125A,S125C,S125E,S125F,S125I,S125K,S125M,S125N,S125P, S125Q, S125R,S125T,S125W,L126A,L126C,L126I,L126K,L126N,L126R,L126S,L126T, L126V, L126W,L126Y,G127A,G127C,G127E,G127F,G127I,G127K,G127M,G127N,G127P, G127Q, G127S,G127T,G127V,G127W,G127Y,G128A,G128D,G128F,G128H,G128L,G128N, G128P, G128S,G128T,G128V,G128W,G128Y,P129A,P129C,P129D,P129E,P129F,P129G, P129I, P129K,P129L,P129M,P129N,P129Q,P129S,P129T,P129V,P129Y,G131A,G131C, G131E, G131F,G131K,G131L,G131M,G131N,G131P,G131Q,G131R,G131S,G131T,G131V, G131W, G131Y,A133C,A133D,A133E,A133F,A133G,A133I,A133K,A133L,A133M,A133P, A133R, A133S,A133T,A133V,A133W,A133Y,A134D,A134E,A134F,A134G,A134I,A134K, A134L, A134M,A134P,A134Q,A134R,A134S,A134T,A134V,A134W,L135D,L135E,L135M, L135R, L135W,L135Y,K136E,K136H,K136L,K136M,K136N,K136R,K136S,K136T,K136V, K136W, K136Y,A137C,A137E,A137F,A137H,A137K,A137L,A137M,A137N,A137P,A137Q, A137R, A137S,A137T,A137V,A137W,A137Y,V139C,V139I,V139L,V139N,V139S,V139T, K141A, 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A274K, A274L, A274Q, A274S,A274T，和A274V，其中所述位置对应于SEQ IDNO 2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
6.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述取代包含选自Y021H-Y217E， Y021H-Y217Q, S101E-Y217L, Y021H-Y217L, K213I-Y217Q, A045I-Y217Q, M119F-Y217Q, A045V-Y217L, Y021H-Y217L， K213I-Y217E， A092G-A114G， Y021W-S101E, V26Q-K213I,和 Y021H-S101N的取代组合，其中所述位置对应于SEQ ID NO :2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草 杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
7.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述取代包含选自S101N-K213I， S101N-M119H, K213L, M119N-K213N， K213N, K213I-Y217E， M119N-K213I， K213N-Y217Q， M119H-K213N, S101P-K213N, M119H-Y217Q, K213I-Y217Q, M119F-K213L, Y217Q, M119F-Y217Q, A048E-K213L, A048H-K213L, K213N, V026N-K213L, V026N-K213L, V026Y-K213N, A048D-K213N, A048H-K213N, A048H-K213L, K213L, K213N, V147D-K213L, K213I, A048E-K213L, A048D-K213N, K213I, A048H-K213N, V147D-K213N, Y021H-Y217L, Y021H-Y217Q, A045V-Y217L, S101E-Y217L, Y021H-Y217E, A045I-Y217Q, Y021H-Y217L, Y021H-Y217E的组合，其中所述位置对应于SEQ ID NO :2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌 蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
8.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述取代包含选自S101N-M119H，Y217L， M119N-K213N, S101E-Y217L, A045I-Y217Q 的组合，其中所述位置对应于 SEQ ID NO 2 给出 的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
9.编码权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体的分离的核酸。
10.包含权利要求9的核酸的表达载体。
11.包含权利要求10的表达载体的宿主细胞。
12.包含权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物。
13.其中所述清洁组合物是洗衣洗涤剂。
14.其中所述洗衣洗涤剂是冷水洗涤剂、低PH洗涤剂，或者浓缩洗涤剂。
15.产生芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体的方法，包括步骤a)用包含编码权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；和b)在适于产生枯草杆菌蛋白酶变体的条件下培养转化的宿主细胞，以产生枯草杆菌蛋 白酶变体。
16.权利要求15的方法，还包括收获所产生的枯草杆菌蛋白酶变体的步骤。
17.权利要求15的方法，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属物种。
18.权利要求17的方法，其中所述芽孢杆菌属物种是枯草芽孢杆菌。
19.清洁方法，包括将表面和/或包含织物的物品与包含权利要求1-8任一项的分离的 枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物接触的步骤。
20.蛋白酶工程化方法，包括a)提供多个位点评估文库(SEL)，每个文库包含在所述蛋白酶的相同氨基酸位置具有 不同取代的多个蛋白酶变体；b)在目的性质测试中测试所述SEL的所述蛋白酶变体和标准蛋白酶；c)为所述测试确定所述蛋白酶变体的每一种的性能指数(PI)；d)鉴定两个或更多所述氨基酸位置为非限制性位置，其中两个所述SEL的每一个中所 述多个蛋白酶变体的至少一个具有大于0. 5的PI ；和f)提供多突变文库，其包含多个多取代的蛋白酶变体，每个变体在所述两个或更多非 限制性位置中包含取代。
21.权利要求20的方法，其中所述测试包括选自污物去除测定法(微样品)、LAS稳定 性、EDTA稳定性、洗涤剂稳定性测定法和比活性测定法的两种或多种不同的测定法。
22.权利要求20和21任一项的方法，其中所述蛋白酶是细菌枯草杆菌蛋白酶。
23.产生芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的多取代的枯草杆菌蛋白酶变体的方法，包括a)在第一种性质的第一种测试和第二种性质的第二种测试中测试多个单取代的枯草 杆菌蛋白酶变体，其中在每个测试中给予亲本枯草杆菌蛋白酶的性质1.0的值，有利的第 一种或第二种性质具有大于1.0的值，并且过度不利的第一种或第二种性质具有小于约0.80或在一些优选实施方案中小于约0. 60的值；b)鉴定至少一种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体中与有利的第一种性质相关并且不与 过度不利的第二种性质相关的取代；c)鉴定至少一种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体中与有利的第二种性质相关并且不与 过度不利的第一种性质相关的取代；d)将来自前面步骤的取代引入枯草杆菌蛋白酶以产生多取代的枯草杆菌蛋白酶变体。
24.权利要求23的方法，还包括在第一种测试和第二种测试中测试所述多取代的枯草 杆菌蛋白酶变体，其中改进的枯草杆菌蛋白酶变体在所述第一种和第二种测试中实现大于1.0的值，或者在第一种测试中大于1. 0的值并且在第二种测试中0. 80到1. 0的值。
25.权利要求对的方法，还包括产生所述改进的枯草杆菌蛋白酶变体。
26.权利要求25的方法，其中所述第一种和第二种性质负相关。
27.权利要求沈的方法，其中有利的第一种或第二种性质具有大于约1.2的值。
28.权利要求M的方法，其中过度不利的第一种或第二种性质具有小于约0.40的值。
29.权利要求M的方法，其中所述第一种性质是稳定性，并且第二种性质是洗涤性能。
30.权利要求四的方法，其中所述稳定性包括在洗涤剂中的稳定性并且所述洗涤性能 包括在洗涤剂中的血奶墨(BMI)洗涤性能。
31.权利要求M的方法，其中在具有5到12.0的pH的粉末或液体洗涤剂组合物中测 试洗涤性能。
32.权利要求M的方法，其中所述亲本细菌枯草杆菌蛋白酶是具有如SEQID N0:2给 出氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的野生型成熟形式。
33.权利要求M的方法，其中所述位置在亲本枯草杆菌蛋白酶中具有大于约50%的溶 剂可及表面(SAS)。
34.权利要求33的方法，其中所述亲本枯草杆菌蛋白酶中所述一个或多个位置是具有 大于约65%的溶剂可及表面(SAS)的位置。
全文摘要
本发明提供了蛋白质工程化的方法。特别地，本发明提供了利用位点评估文库设计优化蛋白质的两种或多种性质的文库的方法。本发明还提供了适于多种用途的变体枯草杆菌蛋白酶。
文档编号C12N9/54GK102046783SQ200980120416
公开日2011年5月4日 申请日期2009年6月3日 优先权日2008年6月6日
发明者D·A·伊斯泰尔, F·齐德戈伯, J·T·小凯利斯, L·G·卡斯康-佩雷拉 申请人:丹尼斯科美国公司