猪骨骼肌特异性表达基因MyoG启动子的克隆及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于动物基因工程【技术领域】，具体涉及一种猪的骨骼肌特异性表达基因MyoG启动子活性区域的分离鉴定和功能验证。从猪的基因组中克隆了骨骼肌特异表达基因MyoG上游806bp启动子，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。结果表明本发明全长为806bp的启动子片段具有独立的启动活性兼肌肉组织特异性。利用MyoG活性启动子序列驱动外源基因PPARγ的表达，并可用于制备转基因小鼠。本发明还公开了所述启动子片段的制备方法、双荧光素酶活性检测系统、定量PCR和Western?Blot方法对启动子活性分析的应用。
【专利说明】猪骨骼肌特异性表达基因MyoG启动子的克隆及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物基因工程【技术领域】，具体涉及到猪骨骼肌特异性表达基因MyoG启动子区域的分离鉴定及功能验证。
【背景技术】
[0002]真核生物的生存及生长发育有赖于基因组内成千上万个基因的表达以及进行正常的调控作用。经过科研人员多年的努力探索，我们现在认识到每一个基因的表达都受到多种不同机制的调控。而对启动子的分析可以帮助我们了解真核生物转录调控机理里最基本的信息。这些基础知识也是现代分子生物学基础理论重要的组成部分。其次，因为在基因的转录激活过程中发生的一系列级联反应最终都会作用到启动子上，都会对启动子上发生的基础转录调控作用造成直接或间接的影响。
[0003]启动子常常被描述为有两个独立的部分，即核心启动子和扩展的启动子区域，核心启动子一般位于转录起始位点上游50bp之内，是转录起始复合物形成和通用转录因子聚集的位置。而在扩展的启动子区域内包含有特异的调控序列，控制下游基因的时空表达模式(Butler and Kadonaga 2002)。启动子分类方法较多,根据启动子的功能及作用方式可以分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组织特异性启动子能够启动外源基因仅在受体所需要的部位特异表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果(Smith，Sumazin et al 2007)。
[0004]除了非特异性蛋白在不同的组织中非特异表达会带来安全问题和潜在的毒性作用外，由病毒驱动的启动子所控制的重组蛋白表达还会带来免疫反应，而那些以特异性方式表达的产物只会在特定的组织和特定的细胞中表达，不会出现上述问题(Cordier et al2001, Hartigan-O' connor et al 2001, Hauser et al 2000)。组织特异性启动子通常以特定的组织细胞结构和化学、物理信号为基础，可对外源基因进行靶向定位，将基因固定于某一组织或细胞中表达，减少了机体能量和物质的损耗及对机体代谢活动的影响，同时又能够起到定向改善某一组织特性的效果，这在人类疾病治疗方面的前景尤其可观。其次，转基因动物育种研究中，通过组织特异性启动子调控外源目的基因在靶组织中表达，能够有效改善动物的某些性状，如肌内脂肪；或改善动物的消化系统以减少排泄物中的氮磷含量等。鉴于此，组织特异性启动子在基因工程和转基因育种中越来越受到研究者的青睐。
[0005]肌细胞生成素(myogenin, MyoG)是生肌决定因子基因家族中唯一的在所有骨骼肌细胞系均可表达的基因，其功能不可被其它生肌调节因子所代替。肌肉细胞有自己的内在转录程序建立联系，而且这个网络在某种程度上是由MRFs、MEF-2所控制的。
[0006]NCBI数据库中已含有人、鼠、猪、鸡、斑马鱼等MyoG基因的序列。研究者可以利用数据库获得MyoG基因的启动子序列。Anne-Sophie Armand等2008年获得小鼠MyoG5'-侧翼序列600bp，构建含有双荧光素报告载体，利用C2C12细胞系，检测其活性，并在RNA水平以及蛋白质水平检测其基因表达量，发现细胞在分化96h时MyoG启动子活性达到最大(Armand et al 2008)。宋兴超等克隆甘肃马鹿MyoG启动子序列685bp，并与人、猪、小鼠启动子序列进行比对，相似性分别为84.9%、88.1 %和82.6% (宋兴超2009)。王秋华等克隆日本和牛MyoG启动子序列，构建一些列启动子缺失片段，利用牛肌源干细胞和牛胎儿成纤维细胞，检测启动子活性，确定转录起始位点上游1039bp的启动子活性最高(王秋华2012)。刘铮铸等扩增波尔山羊MyoG基因的5'-侧翼序列969bp，并对其进行序列分析及结构预测，通过序列比对，此序列与牛、小鼠、马鹿和人物种的序列相似性在37.22% -96.85%之间；但与其它物种不同的是，波尔山羊序列MyoG启动子的GC含量高达50.6% (刘铮铸2012)。
[0007]MyoG基因是骨骼肌分化所必需的因子，在肌细胞分化为肌管的过程中起重要作用。Lucarelli等发现小鼠MyoG5 '-侧翼区-1092bp~_134bp中有一段富含胞嘧卩定的序列，这段序列含有CCGG位点，肌肉细胞分化过程中此位点能够结合与分化相关的转录因子，调节启动子的甲基化模式(Lucarelli et al 2001)。Fuso等发现,在细胞分化时,此段序列的甲基化状态处于动态变化，当细胞处于未分化状态时，此序列的甲基化约为50%，随着细胞分化时间的延长，启动子序列的甲基化百分数出现先降低后增加的现象(Fuso et al2010)。
[0008]到目前为止，未见到研究猪骨骼肌特异性表达基因MyoG启动子应用的相关报道。所以 申请人:对此基因进行了启动子的功能研究和应用，以期能够更好地利用该启动子。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于分离克隆猪的骨骼肌特异性表达基因MyoG启动子区域的活性片段，并对其进行功能验证，以期获得此基因的具备较高启动活性并保持肌肉组织特异性的调控区段，为动物基因工程提供可利用的组织特异性启动子。
[0010]本发明从大白猪的基因组中分离并鉴定出MyoG基因具有肌肉组织特异性的启动子。采用在线软件MEME比对猪、人和小鼠相同区域序列，确定猪MyoG启动子的功能区域位于第一外显子5'端附近。克隆猪MyoG基因5'侧翼806bp序列，TESS和TFSEARCH等分析该片段含有启动子的特征元件TATA box和多个转录因子结合位点，如Spl、E-boX、C/EBP、NF-UMyogenin等。构建含有MyoG启动子的pGL3_MyoG报告质粒，分别转染分化0d、2d、3d、4d、6d的C2C12细胞和3T3-L1细胞。通过双荧光素酶报告系统分析报告基因萤火虫荧光素酶的相对活性，从而获得具有肌肉组织特异性的启动子，进一步构建启动子与猪PPARy基因的重组载体，通过荧光定量PCR和Western Blot检测PPAR Y的表达量。将重组载体线性化，显微注射小鼠受精卵
[0011]本发明通过以下技术实现:
[0012]本发明的技术路线见图1所示。
[0013]利用NCBI数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)查找猪骨骼肌特异性表达基因MyoG的上游调控序列，利用MEME在线软件比较猪、小鼠、人类三个物种MyoG的调控序列，根据MEME分析的结果以及前人研究，预测MyoG启动子的大概区域。利用TFSEARCH及MethPrimer生物信息学软件预测分析核心启动子区域、顺反式作用元件及CpG岛分布情况。设计引物(该引物对的序列见表1所示)，从大白猪的基因组中PCR扩增获得肌肉组织特异性启动子， 申请人:将扩增的启动子片段分别命名MyoG-pro其片段长度分别为806bp，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1。构建报告基因LUC融合载体， 申请人:将其分别命名为pGL3-MyoG-pro。瞬时转染分化0d、2d、3d、4d和6d的C2C12、3T3_L1细胞，双荧光素酶报告系统检测MyoG启动子的活性，不同分化时期的C2C12细胞中，细胞分化3d时MyoG启动子的活性达到最高，是阴性对照的八倍左右；其次，分化2d时MyoG启动子活性比分化3d时启动子活性低，但二者无显著性差别。此外，MyoG-pro的活性在3T3-L1中几乎未被检测到。结果表明806bp的MyoG-pro片段具备独立的启动报告基因表达的功能并同时保持着肌肉组织的表达特异性。之后，构建与脂肪沉积相关的猪PPAR Y基因的重组表达载体， 申请人:将构建好的载体命名为pGL3-MyoG-PPAR Y。将pGL3-MyoG_PPAR Y转染C2C12细胞，荧光定量PCR和Western Blot检测猪PPAR Y基因的表达。结果发现，RNA水平，MyoG启动子能够提高02(:12细胞中？?41?￥基因的表达量是空白对照的2.17±0.14倍左右，蛋白质水平，PPARy基因的表达量与空白对照有显著性差异。证明分离出的启动子MyoG-pix)兼备启动突光素酶报告基因和脂肪相关基因的能力。
[0014]本发明的具体步骤如下:
[0015]基于进化印记理论，利用软件MEME比对猪、小鼠、人类三个物种MyoG基因的mRNA5/端上游调控序列。MEME分析发现，MyoG调控序列在不同的物种间存在着相同的规律。生物的进化历程必定会在分子序列上留下相应的进化印记，即家族特异模块和直系同源簇特异模块组成的功能特异模块。因此，推测猪MyoG启动子的功能区域应该位于Motif富集的片段内。通过美国国立生物研究所网站NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上查找猪MyoG基因，扩增806bp的启动子序列(如SEQ ID NO:1所示)，以此序列作为研究对象。再根据TFSEARCH及MethPrimer预测顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据网络预测的结果设计引物，以约克夏猪基因组DNA为模板，PCR扩增MyoG启动子区域，并连接到pGL3-Basic报告基因LUC上游多克隆位点(载体图及多克隆位点等信息见图2)处，构建得到融合表达载体(图3)。通过Lipofectamine2000转染试剂将融合表达载体瞬时转入不同分化时期的小成纤维细胞C2C12(简称C2C12)细胞和小鼠前脂肪细胞系3T3-L1细胞(简称3T3-L1)，同时转入海肾荧光素酶报告基因pRL-TK为内参质粒。本发明设置阴性对照pGL3-Basic (图2),阳性对照pGL3_control。转染48h后通过双突光素酶报告系统对报告基因LUC进行定量分析，进而分析MyoG启动子在不同来源细胞中的启动功能。进一步，将猪PPAR Y的CDS区域替换载体的LUC基因，连接在MyoG启动子的下游，构建重组表达载体，猪PPAR Y的⑶S区域序列如SEQ IDNO:2所示。重组载体转染C2C12细胞48h后，提取细胞RNA和蛋白质，通过荧光定量PCR和Western Blot检测PPAR Y在C2C12细胞中的表达量，以此来证明骨骼肌特异性的启动子不仅能够启动报告基因表达，同时也具备启动脂肪相关基因表达的能力。之后将重组载体线性化，显微注射小鼠受精卵，制作转基因小鼠，PCR鉴定出四只阳性小鼠(图)。
[0016]本发明的优点在于:
[0017]1.本发明详尽的验证了猪MyoG启动子不同来源细胞中启动基因表达的能力，为MyoG基因的表达调控带来了更深层次的认知。
[0018]2.本发明鉴定了肌肉组织特异表达的启动子猪MyoG的活性区段，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。
[0019]3.本发明利用PCR技术鉴定了四只转基因小鼠，为构建转基因猪模型提供一定的
理论基础。[0020]更详细的技术方案参见《【具体实施方式】》的内容。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的猪骨骼肌特异表达基因MyoG的上游调控核苷酸序列，拟确定为启动子序列MyoG-pix)，长度为806bp。
[0022]序列表SEQ ID NO:2是本发明克隆的猪PPAR Y基因⑶S序列(猪PPAR Y基因的Genebank登录号为397671)，长度为1515bp，编码504个氨基酸。
[0023]序列表SEQ ID NO:3是猪PPAR Y基因的蛋白质序列。
[0024]图1:本发明的总体技术路线图。 [0025]图2:构建好的以pGL3-basic为骨架的融合载体结构图。其中:位点5_53为多克隆位点，用于插入目的序列；Amp为氨节抗性筛选基因；luc+为报告基因萤火虫荧光素酶。
[0026]图3:pGL3-MyoG载体的构建图。在多克隆位点插入MyoG启动子序列。
[0027]图4:融合载体的Nhe I和Xho I双酶切鉴定图。M表示DL marker 2000，上面较大的条带为载体条带，下端为启动子条带。
[0028]图5:骨骼肌特异表达基因MyoG启动子驱动LUC基因在不同来源的细胞中的表达情况。其中:图5A为MyoG启动子在不同分化时期C2C12细胞中的活性分析；图5B为MyoG启动子在3T3-L1细胞中的活性分析，pGL3-Basic质粒为阴性对照，pGL3-C0ntix)l质粒为阳性对照。
[0029]图6:为pcDNA3.1-PPAR Y质粒图谱和猪PPARy基因PCR扩增图。其中:图6A为pcDNA3.1-PPAR Y质粒图谱；图6B为猪PPAR Y基因PCR扩增图。
[0030]图1:重组表达质粒pGL3-MyoG_PPAR Y的结构示意图。
[0031]图8:重组质粒酶切鉴定图。其中:图8A为重组表达质粒pGL3-MyoG_PPAR Y的酶切鉴定图；图8B为阴性对照质粒PGL3-PPARY的酶切鉴定图，图中标记说明:M表示DLmarker 10000。
[0032]图9:利用定量PCR检测PPARy基因在C2C12细胞中的表达量以及利用WesternBlot测定PPAR Y蛋白质在C2C12细胞中的表达量。其中:图94为？?八1?￥基因在C2C12细胞中的表达量；图9B为PPAR Y蛋白质在C2C12细胞中的表达量。
[0033]图10:重组表达质粒pGL3-MyoG_PPAR Y线性化图。图中标记说明:M表示DLmarker 10000，2612bp片段包含MyoG启动子，PPARy基因的CDS区域，Flag标签以及SV401ate poly (A) signal。
[0034]图11:转基因小鼠以及阳性小鼠PCR鉴定结果。其中:图1lA为四只转基因阳性小鼠(从上至下和从左至右依次编号为a、b、c、d);图1lB为阳性小鼠PCR鉴定结果，琼脂糖凝胶电泳图中的标记说明:M表示DL10000 ;泳道1:pGL3-MyoG-PPAR Y质粒；泳道2-5:M1、M2、M3、M4转基因小鼠;泳道6:野生型小鼠;泳道7:水。
【具体实施方式】
[0035]实施例1:猪的骨骼肌特异性表达基因MyoG启动子片段及相应获得
[0036]基于进化印记理论，利用软件MEME比对猪、小鼠、人类三个物种MyoG基因的mRNA5/端上游调控序列。MEME分析发现，MyoG调控序列在不同的物种间存在着相同的规律。生物的进化历程必定会在分子序列上留下相应的进化印记，即家族特异模块和直系同源簇特异模块组成的功能特异模块。因此，推测猪MyoG启动子的功能区域应该位于Motif富集的片段内。通过美国国立生物研究所网站NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上查找猪MyoG基因(Gene ID:497618)，扩增806bp的启动子序列，如SEQ IDNO:1所示，以此序列作为研究对象。再根据TFSEARCH及MethPrimer预测顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据网络预测的结果设计引物(引物序列如表1所示)，以大白猪基因组DNA为模板，PCR扩增MyoG启动子区域。扩增产物经过1.5%琼脂糖电泳检测及Omega公司回收试剂盒纯化回收，放至_20°C备用。
[0037]表1 MyoG启动子片段的扩增引物(引物的下划线部分为酶切位点)
[0038]
【权利要求】
1.调控猪骨骼肌基因MyoG的特异性表达的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQID NO:I所示。
2.权利要求 1所述的启动子在猪骨骼肌组织表达中的应用。
【文档编号】C12N15/85GK104017807SQ201410263464
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】蒋思文, 李倩倩, 彭健, 柴进, 李凤娥 申请人:华中农业大学