一种基因工程亚单位二联口服疫苗的制作方法

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种基因工程亚单位二联口服疫苗。

背景技术：

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由尼多病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)的猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种冬季多发的高度接触性肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％，尤其对哺乳仔猪的危害最为严重，病死率平均为50％，给养猪业带来严重危害。

猪传染性胃肠炎(transmissiblegastroenteritis，tge)是由尼多目、冠状病毒科的猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，tgev)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和仔猪高致死率为特征的高度接触性肠道传染病。该病具有高度传染性，猪场一旦暴发此病，而造成出生2周龄以内仔猪近乎100％死亡，损失十分严重，给养猪业带来极大危害。

猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎往往在寒冷季节并发于仔猪，造成仔猪腹泻、脱水、死亡，传染性强，难以治愈，因此研制这两种病毒的二联疫苗对预防猪腹泻和胃肠炎病的爆发，降低猪死亡率，减少猪场经济损失具有极其重要的意义。

疫苗免疫接种是预防这两种病的主要措施，然而现有的疫苗一般需要注射，常规注射疫苗会产生应激及疫苗吸收的问题。以往研究发现，肠道粘膜免疫所产生的分泌型抗体(siga)是抵抗pedv和tgev感染的有效抗体，如igg、igm的免疫保护效果并不理想。因此选择一种能在肠粘膜定居的菌作为宿主菌对于猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎疫苗的研制具有极其重要的意义。

乳酸乳球菌一种易通过黏膜吸收的常在菌，因其在食品工业各个领域中的长期应用已证明不具有致病性，被公认为安全级微生物。利用一些乳酸乳球菌在胃肠道、泌尿、生殖系统中或黏膜部位粘附存活且无病原性等特点，广泛开展了活菌口服后在体内定植及疫苗的研究。

目前，猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎发生率居高不下，发病的原因愈加复杂，且并无特效治疗药物，一般对症治疗效果不佳，所以最好接种疫苗防止暴发。然而，市面上商品化的疫苗主要为灭活苗和弱毒苗。灭活苗虽然安全稳定，但需要大剂量接种或应用浓缩抗原；免疫期短，常需强化接种；产生完全免疫力需要2周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用且灭活苗只能通过注射免疫，仔猪无法获得siga，保护效果不佳。而弱毒苗由于存在着成本高、易返祖、有潜在感染危险等缺陷，很难在实践中推广应用。传统疫苗在防治猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎中暴露出越来越多的问题，已无法提供完全保护，研制一种新型可靠的疫苗迫在眉睫。猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎的免疫机制中，黏膜免疫具有非常重要的作用。传统的非肠道输入的灭活疫苗不产生siga抗体，细胞介导免疫反应弱而且维持时间短。口服免疫突出的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型iga，这尤其适应于肠道粘膜传染病，并且避免了常规注射所引起的应激及疫苗吸收问题。

技术实现要素：

本发明提供一种基因工程亚单位二联口服疫苗，即一种猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒基因工程亚单位二联口服疫苗，口服免疫突出的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型iga，这尤其适应于肠道粘膜传染病，并且避免了常规注射所引起的应激及疫苗吸收问题，解决疫苗免疫应激性强，免疫原性不强、有毒性的问题。

本发明所提供的猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒基因工程亚单位二联口服疫苗，是使用能够重组表达猪流行性腹泻病毒s蛋白和猪传染性胃肠炎病毒sln蛋白的乳酸乳球菌制备的；

其中猪流行性腹泻病毒s蛋白，其氨基酸序列为seqidno:1；其编码基因的核苷酸序列为seqidno:2；

所述的sln蛋白，是将猪传染性胃肠炎病毒的a、d抗原位点基因和n321抗原位点基因连接起来的，

作为优选，所述的sln蛋白编码基因的连接顺序为d抗原位点基因、n321抗原位点基因、a抗原位点基因；

所述的d抗原位点基因、n321抗原位点基因、a抗原位点基因是通过linker连接起来的，

作为实施例的一种具体记载，sln蛋白的氨基酸序列为seqidno:3；其编码基因为seqidno:4。

本发明制备的灭活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保护，免疫后能够产生较强免疫力，接种猪群的发病率和死亡率均明显减少，能够有效预防猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎的流行和传播，降低本病对养猪业造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

附图说明

图1：两种重组菌的pcr鉴定结果图；

图2：两种重组菌的双酶切鉴定结果图；

图3：两种重组菌的western-blotting结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：口服疫苗的制备

一、合成和扩增目的基因

根据全病毒rna序列，对抗原位点进行优化后，选用两个柔性的linker((ggggs)3)将tgev的a、d抗原位点基因和n321抗原位点基因连接起来(顺序为：d抗原位点基因-linker-n321抗原位点基因-linker-a抗原位点基因)，把该序列命名为sln，并送往生物公司合成。

设计特异性引物分别从获得的pedv变异株中提取rna,反转录后扩增pedv的s1基因和tgev的sln基因并连接pmd18-t载体，转化至dh5α感受中，挑阳性单克隆，菌液pcr鉴定、提取质粒酶切鉴定以及测序鉴定正确。

1、表达载体构建

将鉴定正确的s1基因和sln基因分别和pmg36e表达载体用限制酶xbai和hindiii双酶切，并进行胶回收纯化。将两者16℃过夜连接，转化入大肠杆菌jm109中培养16小时。挑取单克隆菌落进行pcr鉴定、质粒双酶切鉴定以及测序鉴定正确。

3、构建重组乳酸乳球菌

将鉴定正确的两种阳性质粒分别与感受态细胞mg1363轻柔混匀后，冰上放置5min，将其转入2mm的预冷电转化杯中，迅速电击，电击参数为电压2.5kv，电击时间为5ms，电击后加入900μl冰预冷的sgm17恢复培养基，混匀，将菌液转移至1.5ml离心管中，冰上放置10min，28℃复苏培养2h，取适量菌液涂布于含有5μg/ml红霉素的gm17琼脂培养基上，28℃厌氧培养2-3d。于平板上挑取单个菌落，分别接种于含有5μg/ml红霉素的gm17液体培养基中，28℃厌氧培养过夜后，从乳酸乳球菌中分别提取质粒，并分别对质粒进行pcr鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定正确。两种重组乳酸乳球菌种分别命名为：mg1363/pmg36e-s1和mg1363/pmg36e-sln。

4、重组蛋白的诱导表达

分别取50μl的两种菌种接种于5ml含有红霉素的新配gm17液体培养基中，于28℃过夜培养，至od600达到1.0时，加入nisin至终浓度为10ng/ml，继续培养，于10小时后终止诱导。

然后进行sds-page蛋白检测试验：结果显示所表达的目的蛋白大约为86kd和15kd；western鉴定重组蛋白具有与抗ped和抗tge的多抗发生反应的能力，证明重组菌表达的外源蛋白具有良好的反应原性。

5、冻存重组菌

从表达两种重组蛋白菌株的培养液中分别取100微升，分别接种于含红霉素的50毫升gm17培养基中。28℃非震荡培养至od600＝1.0时，将两种菌液混合，并与100毫升含3％蔗糖的10％脱脂牛奶混合液混合均匀，分装为2毫升每管，冻干。

6、冻存菌的稳定性试验

(1)菌种保存温度：将两种菌种混合物的冻干培养物分别于-20℃、4℃、和25℃保存3个月，然后各取5支同上述方法复苏计数，比较不同保存温度对细菌数量的影响。结果显示以-20℃保存为最好。

表1不同保存温度对保存三个月的混合重组菌种菌数的影响

(2)菌种保存时间：将两种菌种混合物的冻干培养物冻存3、6、12、18个月各取5支，以同样的方法复苏计数，比较不同保存时间对细菌数量的影响。结果显示菌种在-20℃条件下经过冻干保存18个月对菌种数量的影响差异不显著，表明冻存菌种很稳定。

表2不同保存时间对混合重组菌种菌数的影响

(3)pcr鉴定：挑取冻存3、6、12、18个月的菌种的在mrs固体培养基上复苏后，取mrs固体平板上单菌落，加100μl灭菌双蒸水，在沸水浴中加热5分钟后，用自备两个基因的pcr引物扩增s1和sln基因显示两条阳性目的条带，表明冻存菌稳定。

7、疫苗的制备

取冻干好的菌粉，加入1ml的生理盐水，混合均匀，直接口服。

实施例2：

(一)口服疫苗的效力试验

1材料

1.1药品

青岛农业大学实验室制备的重组口服疫苗。

1.2试验场所及试验动物

试验场所为山东省青岛市城阳区海伟养猪场，试验动物为20头30日龄的仔猪。

2试验方法

2.1免疫疫苗并检测抗体

将20头30日龄的仔猪平均分为对照组和免疫组。免疫组每头仔猪灌服组合口服疫苗1头份，对照组灌服等剂量的无菌生理盐水。分别于免疫前及免疫后的7d、14d、21d、28d对每头猪进行采血，测血液中抗体含量。

2.2疫苗免疫后重组菌在猪体内的表达水平及消长规律

口服免疫组在免疫后7天、14天、28天分别采集直肠棉拭，样品处理后涂布于5μg/ml红霉素的mrs平板，经28℃培养24h，每组随机挑取10个菌落，经扩大培养后用碱裂解法提取质粒，并进行酶切分析，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后片段大小，验证粪检菌是否为重组菌mg1363(pmg36e)。

3结果与分析

3.1口服免疫后抗体水平结果

对照组和免疫组对s1和sln的siga母源抗体水平都较高。免疫组首免14天后，由于母源抗体的衰减及疫苗可能的部分中和作用，抗体滴度有所下降，但仍显著高于对照组；免疫28天后，对照组针对上述抗原的抗体水平继续下降，而免疫组的抗体水平则继续升高，至免疫后60天，仍能检测到较高水平抗体。如下表所示：

猪血清中针对s1和sln抗原特异性siga抗体水平

3.2重组菌在猪体内的表达水平及消长规律结果

重组菌口服免疫组在免疫后14天、28天分别采集直肠棉拭进行检测，均未检测到重组质粒；重组菌灭活油乳剂苗肌肉注射组在上述时间段亦未能检出重组质粒。根据抗体检测结果，重组菌油乳剂灭活苗主要通过其免疫保护性抗原的缓慢释放，刺激机体产生抗体；与对照组相比，免疫后14、28天抗体水平显著升高；而重组菌活菌口服免疫组在上述阶段产生抗体的水平较低，也与活菌口服后在体内存活时间较短的检测结果相吻合。

4结论

通过对免疫后猪体产生的抗体水平的追踪可以看出重组菌有很好的免疫原性，能够刺激机体产生针对pedvs1和tgevsln的特异性siga抗体，并能长时间持续较高水平。结果表明本实验室研究的疫苗免疫效力良好。

实施例3：口服疫苗的安全性试验

1材料

1.1药品

青岛农业大学实验室制备的重组口服疫苗。

1.2试验场所及试验动物

试验场所为山东省青岛市城阳区海伟养猪场，试验动物为20头30日龄的仔猪。

2试验方法

2.1、单剂量安全性试验

30日龄仔猪80头，分为2组，分别为试验组和对照组，每组40头猪。试验组每头灌服重组乳酸菌1ml，对照组灌服等剂量无菌生理盐水，灌服一次后，连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻、采食量下降等不良症状出现，并对成活率、增重、饲料利用率等生产性能进行统计。

2.2、单剂量重复安全性试验

30日龄仔猪80头，分为2组，分别为试验组和生理盐水对照组，每组40头猪。试验组每头灌服重组乳酸菌1ml，对照组灌服等剂量无菌生理盐水，连续灌服七天，用药后连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻、采食量下降等不良症状出现，并对成活率、增重、饲料利用率等生产性能进行统计。

2.3、超剂量安全性试验

30日龄仔猪80头，分为2组，分别为试验组和生理盐水对照组，每组40头猪。试验组每头灌服重组乳酸菌2ml，对照组灌服等剂量无菌生理盐水，灌服1次后，连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻、采食量下降等不良症状出现，并对成活率、增重、饲料利用率等生产性能进行统计。

3、试验结果

疫苗对30日龄仔猪单剂量使用的安全性试验结果

疫苗对30日龄仔猪单剂量重复使用的安全性试验结果

疫苗对30日龄仔猪超剂量使用的安全性试验结果

各试验组仔猪在灌服疫苗后，连续14天观察仔猪的反应，仔猪无腹泻、采食量下降等不良症状，所有试验仔猪均健康存活，体重增加。试验结束后随机挑选5头剖杀，观察剖检变化，各组仔猪剖检的组织和器官与生理盐水对照组基本无差别。

本发明制备的基因工程亚单位口服疫苗安全可靠，可有效引起肠道粘膜免疫反应，免疫后能够产生较强免疫力，免疫仔猪的发病率和死亡率均明显减少，能够有效预防猪流行性腹泻病和猪传染性胃肠炎，降低本病对养猪业造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

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