SPKP‑XI在制备Kv4.1钾通道抑制剂中的应用的制作方法

本发明涉及一种活性多肽在离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-xi（简写为spkp-xi）在制备电压门控钾通道亚型工具试剂-kv4.1通道抑制剂中的用途。

背景技术：

电压门控钾通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钾离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。kv4钾通道属于瞬时外向钾通道，在大脑、心脏、肺和平滑肌中高表达，它是动作电位复极化早期外向电流的主要成分，在调节神经元放电频率和心肌兴奋收缩耦联等方面起重要作用。kv4钾通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。很显然，借助kv4钾通道的特异性调制剂对这些研究的深入开展是非常必要的。通过阐述这些特异性调制剂作用于钾通道的分子机制，除了在理论上可深入推测kv4钾通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。

技术实现要素：

本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-xi在制备电压门控钾通道亚型工具试剂-kv4.1通道抑制剂的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-xi（简写为spkp-xi），其氨基酸序列为：

nh2-glucysarglysmetpheglyglycysservalaspseraspcyscysalahisleuglycyslysprothrleulystyrcysalatrpaspglythrphe-nh2，其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-xi作为单一有效活性组份用于制备kv4.1通道抑制剂。

所述的蜘蛛抑钾肽-xi的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，n端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

该蜘蛛抑钾肽-xi作为单一有效活性组分用于制备kv4.1通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成kv4.1通道工具试剂。

蜘蛛抑钾肽-xi在制备kv4.1通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为5μmol/l。

蜘蛛抑钾肽-xi对kv4.1通道的抑制呈现时间依从性和可逆性，是一种较好的kv4.1钾通道工具试剂。

附图说明

图1是spkp-xi对表达于爪蟾卵母细胞的kv4.1钾通道亚型的影响。

图2是spkp-xi对表达于爪蟾卵母细胞的kv1.3钾通道亚型的影响。

具体实施方式

为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过细胞外给药途径，采用非洲爪蟾卵母细胞模型来说明蜘蛛抑钾肽-xi的kv4.1通道抑制作用。

1、实验材料和方法

1.1通道质粒的扩增和提取

采用promega公司的质粒提取试剂盒（wizard®plussvminiprepsdnapurificationsystem）。

溶液的配方如下：

细胞重悬液细胞裂解液

tris-hcl(ph7.5)50mmnaoh0.2m

edta10mm1%sds

rnasea100µg/ml

中和液洗脱液

盐酸胍4.09m乙酸钾60mm

乙酸钾0.759mtris-hcl(ph7.5)8.3mm

冰醋酸2.12medta0.04mm

ph为4.2加入95%乙醇,终浓度为60%乙醇

操作步骤：

ø收集菌液（4℃，12000r/min，离心1min）

ø弃上清，用滤纸吸干残留在管壁的溶液，加入250μl细胞重悬液，充分混匀

ø加入250μl细胞裂解液，温和上下颠倒4次混匀，放置5min

ø加入350μl中和液，温和颠倒4次混匀

ø12000r/min离心10min

ø吸上清至离心柱中，12000r/min离心1min，弃下清

ø往离心柱中加入750μl洗脱液，静置2min，12000r/min离心

1min，弃下清

ø重复第七步，加入250μl洗脱液，12000r/min离心1min弃下

清

ø离心柱风干后转移到干净灭菌的1.5mlep管上，加入50μl去

核酸酶水

ø10000r/min离心30s，所得的质粒dna可进行实验或-20℃保

存

1.2质粒的线性化及回收

kv1.3，kv4.1基因的质粒pci-neo用限制性内切酶noti线性化。

1.3cdna的体外转录和mrna的纯化

kv1.3和rkv4.1cdna的体外转录均采用ambion公司的mmessagemmachinet7transcriptionkit试剂盒进行。

1.4电压钳实验活性检测

取成年雌性非洲爪蟾，放入碎冰内麻醉约30min。或者在爪蟾周围溶液（约400ml）中加入0.5g麻醉剂（3-氨基苯酸乙烷基酯），爪蟾1hr后会处于麻醉状态。将处于麻醉状态的爪蟾放在冰上，腹部朝上，用镊子和手术刀在其腹部划开一长约1.0～1.5cm的口，拉出子宫瓣，剪取2-3叶放入无钙nd96溶液中。将子宫放回腹部，分层缝合伤口后，将爪蟾放在冰上恢复，待其苏醒后放回池中。将取出的卵叶用系线镊初步分散成10－20个细胞一团。然后转入50ml离心管中，加入含有胶原酶的无钙nd96溶液，胶原酶终浓度为1mg/ml。在25℃,60rpm下酶解大约50min，直至80%以上的细胞已经去除滤泡膜及微血管后则可停止酶解。酶解完毕，用无钙的nd96多次洗涤细胞，洗去残留的胶原酶。然后，挑选个体比较大、动植物极分明的细胞转入or2溶液在18℃培养。溶液配方：nd96（inmm）：nacl96、kcl2、cacl2-2h2o1.8、mgcl2-6h2o1、hepes-naoh5。用naoh调ph至7.5。or2(inmm):nacl82.5、kcl2.5、cacl2-2h2o1、mgcl2-6h2o1、na2hpo4-12h2o1、hepes5。用naoh调ph至7.5。使用前加入青霉素（10万单位/l）。

电压钳实验：通过显微注射系统（wpi，german）将mrna注入挑选好的卵母细胞，每次注射体积约为20-50nl，从黑色的动物极一侧注入。之后，放入18℃低温振荡培养箱中培养1～4天，每天更换一次新鲜的or2培养液。双电极杆电压钳记录在室温（18～22℃）下进行。玻璃电极经一步拉制而成，灌注3mkcl后电阻为0.5-1.5mω。将细胞放入细胞槽中，用or2溶液灌流。然后将两个玻璃电极分别插入细胞。将细胞钳制在-80mv，给予去极化脉冲刺激。所用放大器为turbotec-03x（npielectronic,germany）。数据采集滤波为2khz。参比电极用ag/agcl电极与浴槽相连。刺激脉冲控制和电流信号记录采用cellworks数据采集系统（npi公司，germany）。线性漏电流和电容电流不予删除。数据分析采用sigmaplot软件进行。所有毒素直接用or2溶液溶解并配制成目的浓度。

2、实验结果与分析

2.1spkp-xi对电压门控钾通道的作用

我们采用双电极电压钳技术研究了spkp-xi对钾离子通道亚型的影响，其中延迟整流钾通道kv1.3电流以同一种去极化方式诱导：将细胞膜电位钳制在-90mv，以400ms的时程给予一测试电压0mv，每隔5s重复一次；瞬时外向钾通道kv4.1电流以另一种去极化方式诱导：将细胞膜电位钳制在-90mv，以200ms的时程给予一测试电压+20mv，每隔5s重复一次。5mmspkp-xi能抑制36%的kv4.1电流（见图1）。5mmspkp-xi对kv1.3电流的抑制率为4.1%（见图2），几乎没有抑制作用。因此我们可以得出spkp-xi是作用于kv4.1通道的抑制剂。

spkp-xi对kv4.1通道的抑制也呈现时间依从性，当spkp-xi的浓度为5mm时，可在不到3min的时间内达到最大抑制程度，而且spkp-xi对kv4.1通道的抑制作用是可以恢复的，即是可逆的。

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<110>长沙沁才生物科技有限公司

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<213>广西缨毛蛛

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glucysarglysmetpheglyglycysservalaspseraspcys

151015

cysalahisleuglycyslysprothrleulystyrcysalatrp

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aspglythrphe

31