9°C下煮1min ;然后冷却至室温，11000r/min离心4min，取上清液置于另一离心管中，加入50 μ L的DNA提取液B，混匀，得到待测模板DNA ;
b)核酸扩增:根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数为n，n为样品数+—管阳性对照DNA+ —管阴性对照DNA，向每一管中加入9 μ L的LAMP预反应液、2 μ L的Bst聚合酶与14 μ L的无核酸酶灭菌水，混合均匀，2000r/min离心13s，然后加入28 μ L的LAMP反应稳定液，混合均勾，2000r/min离心12s ;向上述η个反应管内分别加入待测模板DNA、阳性对照DNA与阴性对照DNA并标记，然后将反应管在65°C下恒温反应1.25h ;其中，LAMP预反应液包括 22mmol/L、pH 为 8.2 的 Tris-HCl、3mmol/L 硫酸镁、I lmmol/L 氯化钾、llmmol/L硫酸铵、1.25% TritonX-100、2.5mmol/L dNTP、0.5 μ mol/L 的引物 WSSV_FIP、0.5 μ mol/L的引物 WSSV-BIP、0.3 ymol/L 的引物 WSSV-F3 与 0.3 ymol/L 的引物 WSSV-B3 ；Bst 聚合酶为每微升含11个活性单位的Bst聚合酶；LAMP反应稳定液为矿物油； 上述的引物的核酸序列如下:WSSV-FIP:5’ -GCTCTTGTTGTTGTTGTTGTCGCTTTTAAATAGGATGTTGTCTCAACC(SEQ ID N0.1) ；WSSV-BIP:
5’ -GCTTTCGCGGATTACCCTGTGGTTTTGAAAGATGTCCTACGACCT(SEQ ID N0.2) ；WSSV-F3:5’ -GACAACACTCTTCTTTCTTGAA(SEQ ID N0.3)；
WSSV-B3:5’ -CCAAGCTTTTACTTCTTCTTGATTTC(SEQ ID N0.4)。
[0018]c)结果检测:反应结果后，取出反应管，冷却至室温，向反应管中各加入2 μ L质量分数为5% SYBR Green I的荧光染料，混匀观察。
[0019]在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下:
a)待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为对虾白斑综合症病毒阳性；
b)待检样品反应管液体呈橙色，则可报告对虾白斑综合症病毒检验结果为阴性； 实施例3
一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒的应用，包括以下步骤:
a)样品制备:取50mg对虾组织，置于离心管中，加入120yL的DNA提取液A，捣碎2min，在100°C下煮12min ;然后冷却至室温，12000r/min离心4min，取上清液置于另一离心管中，加入55 μ L的DNA提取液B，混匀，得到待测模板DNA ;
b)核酸扩增:根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数为n，n为样品数+—管阳性对照DNA+ —管阴性对照DNA，向每一管中加入9 μ L的LAMP预反应液、2 μ L的Bst聚合酶与15 μ L的无核酸酶灭菌水，混合均勾，2000r/min离心15s，然后加入30 μ L的LAMP反应稳定液，混合均勾，2000r/min离心15s ;向上述η个反应管内分别加入待测模板DNA、阳性对照DNA与阴性对照DNA并标记，然后将反应管在65°C下恒温反应1.5h ;其中，LAMP预反应液包括 25mmol/L、pH 为 9 的 Tris-HCl、4mmol/L 硫酸镁、12mmol/L 氯化钾、12mmol/L硫酸铵、1.5% TritonX-100、2.7mmol/L dNTP、0.8 ymol/L 的引物 WSSV_FIP、0.8 ymol/L 的引物 WSSV-BIP、0.5ymol/L 的引物 WSSV-F3 与 0.5 ymol/L 的引物 WSSV-B3 ；Bst 聚合酶为每微升含12个活性单位的Bst聚合酶；LAMP反应稳定液为矿物油；
上述的引物的核酸序列如下:WSSV-FIP:5’ -GCTCTTGTTGTTGTTGTTGTCGCTTTTAAATAGGATGTTGTCTCAACC(SEQ ID N0.1) ；WSSV-BIP:
5’ -GCTTTCGCGGATTACCCTGTGGTTTTGAAAGATGTCCTACGACCT(SEQ ID N0.2) ；WSSV-F3:5’ -GACAACACTCTTCTTTCTTGAA(SEQ ID N0.3)；
WSSV-B3:5’ -CCAAGCTTTTACTTCTTCTTGATTTC(SEQ ID N0.4)。
[0020]c)结果检测:反应结果后，取出反应管，冷却至室温，向反应管中各加入2 μ L质量分数为5% SYBR Green I的荧光染料，混匀观察。
[0021]在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下:
a)待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为对虾白斑综合症病毒阳性；
b)待检样品反应管液体呈橙色，则可报告对虾白斑综合症病毒检验结果为阴性。
【主权项】
1.一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒，其特征在于，所述快速检测试剂盒包括: a)DNA提取液A —份与DNA提取液B —份； b)LAMP预反应液一份； c)Bst聚合酶一份； d)LAMP反应稳定液一份； e)显色液一份； f)阳性对照DNA—份； g)阴性对照DNA—份； 其中，所述组分b)包括2_4mmol/L硫酸镁、10_12mmol/L氯化钾、10_12mmol/L硫酸钱、质量分数 1-1.5% TritonX-100、2.2-2.7mmol/L dNTP、0.2-0.8 ymol/L 的引物 WSSV-FIP、0.2-0.8 ymol/L 的引物 WSSV_BIP、0.2-0.5 ymol/L 的引物 WSSV_F3、0.2-0.5 ymol/L 的引物 WSSV-B3 与 20-25mmol/L、pH 为 8-9 的 Tris-HCl ； 上述的引物的核酸序列如下:WSSV-FIP:5’ -GCTCTTGTTGTTGTTGTTGTCGCTTTTAAATAGGATGTTGTCTCAACC(SEQ ID N0.1) ；WSSV-BIP:5’ -GCTTTCGCGGATTACCCTGTGGTTTTGAAAGATGTCCTACGACCT(SEQ ID N0.2)；WSSV-F3:5’ -GACAACACTCTTCTTTCTTGAA(SEQ ID N0.3)；WSSV-B3:5’ -CCAAGCTTTTACTTCTTCTTGATTTC(SEQ ID N0.4)。2.根据权利要求1所述的一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒，其特征在于，组分a)中DNA提取液A为组织裂解液，DNA提取液B为DNA吸附液。3.根据权利要求1或2的一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒，其特征在于，组分c)Bst聚合酶为每微升含10-12个活性单位的Bst聚合酶。4.根据权利要求3所述的一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒，其特征在于，组分d) LAMP反应稳定液为矿物油。5.根据权利要求4所述的一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒，其特征在于，组分e)显色液为质量分数为5% SYBR Green I的荧光染料。6.一种如权利要求1所述的对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤: a)样品制备:取10-50mg对虾组织，置于离心管中，加入100-120μ L的DNA提取液Α，捣碎 l-2min，在 98-100°C下煮 8_12min ;然后冷却至室温，10000-12000r/min 离心 3_4min，取上清液置于另一离心管中，加入45-55 μ L的DNA提取液B，混匀，得到待测模板DNA ; b)核酸扩增:根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数为η，η为样品数+—管阳性对照DNA+ —管阴性对照DNA，向每一管中加入8-9 μ L的LAMP预反应液、1-2 μ L的Bst聚合酶与12-15 μ L的无核酸酶灭菌水，混合均勾，2000r/min离心10_15s，然后加入25-30 μ L的LAMP反应稳定液，混合均匀，2000r/min离心10_15s ;向上述η个反应管内分别加入待测模板DNA、阳性对照DNA与阴性对照DNA并标记，然后将反应管在65°C下恒温反应 1-1.5h ； c)结果检测:反应结束后，取出反应管，冷却至室温，向反应管中各加入1-2μ L显色液，混匀观察。
【专利摘要】本发明涉及一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒及应用，试剂盒包括a)DNA提取液A与DNA提取液B；b)LAMP预反应液；c)Bst聚合酶；d)LAMP反应稳定液；e)显色液；f)阳性对照DNA；g)阴性对照DNA；本发明特异性强，操作简单方便；较PCR方法有更高的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，降低了成本，尤其适用于基层检验检疫机构；本发明结果检测方法简单直观，可直接用肉眼观察到检测结果。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105039593
【申请号】CN201510329183
【发明人】杨会成, 李瑞雪, 周宇芳, 廖妙飞, 相兴伟
【申请人】浙江省海洋开发研究院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月15日