一种同时检测三种引起马铃薯块茎坏死的病毒的三重rt-pcr方法及其引物组合的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测能引起马铃薯块茎 发生坏死的马铃薯Y病毒块茎坏死株系（PVY N?)、番茄斑萎病毒（TSWV)、马铃薯帚顶病毒 (PMTV)三种病毒的方法及其引物组合。
【背景技术】
[0002] 马铃薯又称土豆、洋芋等，是人们日常生活中常见的粮食及蔬菜作物，作为粮食作 物来说，是世界上仅次于小麦、玉米和水稻的第四大粮食作物。中国是世界马铃薯第一生产 大国，2011年播种面积约542. 5万公顷、总产约8829万吨，均居世界首位，分别约占世界的 1/4和1/5。虽然我国马铃薯的栽培面积和总产量居世界首位，但是单产远不及马铃薯生产 先进国家，低于世界平均水平。马铃薯通过块茎进行无性繁殖，生产过程中易受到病毒的侵 染，侵染马铃薯的病毒种类达40种。马铃薯受病毒侵染后，能通过种薯进行传播，造成马铃 薯种性退化，而且危害程度逐代加重，严重影响马铃薯的产量及品质；目前世界上防治马铃 薯病毒病最好的方法是使用脱毒种薯，达到提高马铃薯产量和品质的目的，因此，脱毒种薯 普及率低及马铃薯病毒病危害严重是制约我国马铃薯单产提高主要因素。
[0003] 马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY)是马铃薯病毒属的典型成员之一，全球危害 马铃薯最为严重的病毒之一，最高可使马铃薯减产80% ;PVYN?是PVY的一种株系，除造成马 铃薯减产外，还能诱导马铃薯块茎发生环状坏死，是我国马铃薯Y病毒的主要株系（Hu X，He C，Xiao Y，Xiong X，Nie X. Molecular characterization and detection of recombinant isolates of potato virus Y from China. Arch Virol，2009,154:1303 - 1312)]。番 前斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV)，是番前斑萎病毒属的代 表成员，广泛分布于世界各地，能侵染80多科1000多种植物；TSWV已在我国云南、广州、 浙江等多个地区存在，并呈扩散趋势；TSWV感染马铃薯后，通常造成块茎变小，产量降低， 还可造成马铃薯块莖出现坏死症状，影响马铃薯的品质（Abad JA, Moyer JW, Kennedy GG , Holmes GA, and Cubeta MA. Tomato spotted wilt virus on Potato in Eastern North Carolina. Amer J of Potato Res 2005,82:255_261)。马铃薯帚顶病毒 a/OjO-tojO PMTV)是马铃薯帚顶病毒属的典型成员之一，已在欧洲、北 美洲、南美洲、亚洲流行，在我国也有发现；PMTV主要通过土壤中或者块茎上的粉痂菌传 播，马铃薯感染PMTV后可造成马铃薯块茎表皮和薯肉出现环状或弧状坏死症状（Xu H， DeHaan T L, DeBoer S H. Detection and Confirmation of Potato mop-top virus in Potatoes Produced in the United States and Canada[J]. Plant Disease, 2004, 88(4): 363-367);因此，这3种病毒在引起马铃薯减产的同时，都能引起块茎发生坏死症状，使其失 去商品性，比一般的病毒危害更为严重。
[0004] 一般而言，病毒引起块茎坏死的症状是马铃薯品种对病毒的过敏性抗性反应；根 据已有研究发现，pvyn?、tswv、pmtv这三种病毒都能诱导马铃薯块茎产生坏死症状，根据块 茎坏死症状难以辨别出是哪种病毒危害所致，因为PVY是马铃薯主要危害病毒，在生产上 容易将TSWV、PMTV病毒病诱导的症状误认为是PVYN?诱导产生的症状，从而无法及时做出 正确的防治措施，给农民带来一定的经济损失。
[0005] 应用茎尖脱毒技术培育马铃薯脱毒试管苗，并在此技术上生产马铃薯脱毒原原 种、原种和良种，防治马铃薯病毒病、提高马铃薯单产和品质的最好措施是使用和推广脱毒 种薯；在脱毒种薯繁育过程中，需要对试管苗、各级种薯进行检测，以确定病毒是否脱除， 种薯是否带毒。目前常用的植物病毒检测方法有生物学方法(又叫指示植物法)、血清学方 法、电子显微镜法、反转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT- PCR)。生物学方法测定耗时长、工作量大、灵敏度较差，不同病毒侵染后也 常常表现出相似症状，显症反应也会受到复合侵染的影响；血清学检测方法在一定范围内 可能出现假阴性和假阳性的现象，且对于检测样本较小的试验来说，试剂盒的成本较高；而 且生物学方法和血清学方法的每一次检测只能针对单种病毒，检测效率低。电镜法对于病 毒科或属以下的分类不能判定，且设备昂贵，样本数量不宜过大。而RT-PCR因其特异性 最强、灵敏度最高，已成为当前病原检测的首选方法，并广泛应用于植物病毒检测，而且多 重RT-PCR方法同时检测多种病毒，可在短时间内检测大量样本，提高了检测效率，降低了 检测成本，而且检测成本低，是其他检测方法所不能比拟的。针对PVY N?、TSWV、PMTV这三 种病毒，国内外建立了单重 RT-PCR 方法（Hu X，He C，Xiao Y，Xiong X，Nie X. Molecular characterization and detection of recombinant isolates of potato virus Y from China. Arch Virol,2009,154:1303 - 1312 ；Abad JA, Moyer Jff, Kennedy GG , Holmes GA, and Cubeta MA. Tomato spotted wilt virus on Potato in Eastern North Carolina. Amer J of Potato Res 2005,82:255-261 ；Xu H, DeHaan T L, DeBoer S H. Detection and Confirmation of Potato mop-top virus in Potatoes Produced in the United States and Canada[J]. Plant Disease, 2004, 88(4): 363-367.)，还没有建立起 两重和三重RT-PCR检测方法，一次RT-PCR只能检测一种病毒，三种病毒需要三次RT-PCR 才能完成，耗时长，成本高，为提高RT-PCR检测效率，降低检测成本，本发明根据Genbank 发布的这三种病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计通用引物，旨在建立一种简单、高 效、灵敏的三重RT-PCR检测技术，同时检测能引起马铃薯块茎发生坏死的PVY N?、TSWV和 PMTV三种病毒。为研究国内马铃薯病毒病流行情况及脱毒马铃薯病毒检测提供技术支撑。
【发明内容】
[0006] 本发明针对国内外发现的能引起马铃薯块茎坏死的PVYN?、TSWV、PMTV三种病毒， 根据Genbank发布的这些病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计通用引物，发明一种 三重RT-PCR检测方法，同时检测这三种病毒。
[0007] 因而，本发明所要解决的技术问题是：针对TSWV、PVYN?、PMTV这三种病毒能同时 引起马铃薯块茎发生坏死，病毒症状难以区分、现有单重RT-PCR检测方法的不足，建立一 种高效的三重RT-PCR病毒检测方法，同时检测TSWV、PVY N?、PMTV这三种病毒。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种三重RT-PCR同时检测 TSWV、PVY N?、PMTV三种病毒的方法，针对国内外这三种病毒的基因组保守序列设计3对通 用引物，并建立三重RT-PCR反应体系和程序，同时检测能够引起马铃薯块茎坏的马铃薯Y 病毒块茎坏死株系（PVYN?)、番茄斑萎病毒（TSWV)和马铃薯帚顶病毒（PMTV)。
[0009] 根据Gene Bank中已报道的这些病毒全基因组或部分序列的保守序列，通过 primer 5软件设计了三对引物(表1)。这三对引物具有高度的特异性，三者之间互无干扰， 并且具有相似的退火温度，扩增产物的大小亦不同，保证了后面三重RT-PCR最优体系的建 立。
[0010] 表1同时检测TSWV、PVYN?、PMTV三种病毒的三重RT-PCR引物及其检测的病毒
本发明检测方法具体包括以下步骤： 1) 马铃薯块茎RNA的获得：取田间具有坏死症状的马铃薯块茎或植株叶片，带回实验 室，采取Trizol方法提取RNA ; 2) 以步骤1)得到的RNA为模板，以6碱基随机引物Random Primers为反向引物，通 过反转录，得到cDNA ; 3) 以步骤2)得到的cDNA为模板，用表1中的三对引物对其进行PCR扩增；本发明中 三重PCR的条件为： PCR 反应体系（50 yl):10XPCR Buffer (+Mg) 5uL、dNTP Mixture 4uL、模板 4uL、 三对引物的正向引物和反向引物各luL、Taq酶luL、补足ddH20至50uL ; PCR程序：92°C预变性2min ;92°C变性30s ;60°C退火30s ;72°C延伸lmin ;共40个循 环；最后72°C延伸lOmin。
[0011] 4) PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病 毒感染情况。
[0012] 本发明具有以下有益效果：本发明设计的TSWV、PVYN?、PMTV各对引物扩增的片段 大小分别为251 bp、448 bp和587 bp，片段大小差异较大，不会出现重叠，能清晰的分开，设 计引物时排除了各对引物和其他几种病毒之间的错配以及各引物之间的互补，具有高度的 特异性，并且具有相似的退火温度。目的片段经克隆测序，均为各病毒的特异片段。用三重 RT-PCR同时检测TSWV、PVY N?、PMTV三种病毒，与目前单重RT-PCR相比，用一个RT-PCR即 可检测这3种病毒，检测的病毒种类增多，病毒检出率及检测效率提高，检测的成本显著降 低。而且本发明检测灵敏度非常高，如实验所表明的，在初始RNA稀释10-100倍时，还能扩 增出4个目的片段，说明此RT-PCR检测技术的灵敏度高。