专利名称：对虾流行病病原检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体讲是一种对虾流行病病原检测试剂盒及病原检测方法，其属于生物检测技术领域。
在海洋生物养殖业中，对虾病毒性暴发病给对虾养殖业造成了巨大的损失。为了尽早发现对虾病毒，从而及时采取防治措施，以减少经济损失。现有技术中有采用PCR法，(即聚合酶链式反应，通过引物，延伸核酸的某个区域而进行重复双向DNA合成。)来检测病毒的存在。然而，该PCR法所需PCR仪及其所需试剂比较昂贵，且操作要求相对严格，否则会出现假阳性，造成检测误差，因而PCR法不适于生产上应用。还有一种TE染色法，即用台盼蓝和伊红对细胞核和病毒(WSSV，此病毒为对虾白斑综合症病毒WSSV，也可称为WSBV，HHNBV，SEMBV等)TE染色，经镜检观察细胞核肿大，呈均一的淡蓝色。来检测病毒的存在。可是这种染色法不足之处在于(1)只能用于发病对虾的诊断。(2)对虾病毒感染的初期很难用TE法观察到，只有对虾病毒感染中后期，才能确定病毒感染，因此TE染色法有一定局限性。现有的分子生物学核酸杂交技术未见有对虾病毒检测的。用国际流行的非放射性标记物-地高辛标记含有白斑杆状病毒DNA(HHNBV DNA)也未见报导。然而受地域限制，样品携带不便，送检样品常造成不必要的财力和人员浪费。上述检测方法零乱，不规范，无标准，试剂不集中不配套，不利于基层水产实验使用。
本发明的目的是要提供一种检测灵敏度高且易操作的检测对虾HHNBV病毒的方法，将检测方法标准化，商品化，配套化，将检测试剂集中于规范的试剂盒中，力求使对虾流行病病原检测操作具有准确、灵敏、快速、安全、方便的特点。
本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种对虾流行病病原检测试剂盒及病原检测方法，其盒内包含有泡膜液，样品研磨液，封闭剂，预杂交液，病毒DNA探针，清洗液，抗体试剂，显色剂A、B，阳性病原对照，阴性病原对照，杂交膜片，杂交袋，微型离心管；经以下检测方法进行检测 入抗体→(7)显色→(8)观察记录；其特征在于在(1)采样研磨步骤中，采用的样品研磨液是由以下体积比组份组成的1摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷(Tris·HCl，pH8.0)0.5～5份；0.7摩尔/升的乙二胺四乙酸二钠(EDTA).5～15份；10％的十二烷基磺酸钠(SDS).5～15份；巯基乙醇0.5～1.5份；平衡酚10～50份；双蒸水定容100份；在(4)预杂交步骤中，采用的预杂交液是由以下体积比组份组成的以标准柠檬酸盐缓冲溶液(SSC)定容1000份；20％的十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)2～20份；10％的十二烷基磺酸钠(SDS).1～6份；在(5)杂交步骤中，采用的病毒DNA探针是由非放射性的地高辛(类固醇半抗原)标记的含有白斑综合症病毒DNA(WSSV DNA)的小片断，具有特异性的该探针的模板是1.018～1.6364碱基对(kb)的病毒插入片断。
所述的诸试剂，其配制成剂后，在4℃～6℃的储存条件下，储存备用。
所述的(1)采样研磨步骤是①采取虾样的胃或虾头约0.1～2克；②置于微型离心管中，加入0.3～1ml的研磨液；③用研磨棒将样品充分研磨，至磨碎；④研磨棒用前、用后要用高锰酸钾溶液浸泡消毒，并清洗晾干再用。
所述的清洗液，其包括清洗液A和清洗液B；其中，清洗液A是由以下体积比组份组成的20倍的标准柠檬酸盐溶液(SSC)2.5～5份；10％的十二烷基磺酸钠(SDS)0.2～0.5份；其中，清洗液B是由以下体积比组份组成的；20倍的标准柠檬酸盐溶液(SSC)0.5～1.5份；10％的十二烷基磺酸钠(SDS)1～3份；双蒸馏水定容至200份。
所述的缓冲液，其包括，缓冲液A，缓冲液B，缓冲液C和缓冲液D；其中，缓冲液A是由以下重量体积比组份组成的，三羟甲基氨基甲烷(Tris)100～150重量份；氯化钠60～90重量份；双蒸馏水溶解至800体积份；用浓盐酸调节pH6～8；加双蒸馏水定容至1000体积份；缓冲液B是缓冲液A的稀释10倍溶液；缓冲液C是由以下重量体积比组成的三羟甲基氨基甲烷(Tris)100～150重量份；氯化钠40～60重量份；双蒸馏水溶解至800体积份；用浓盐酸调节pH9.5；带六个结晶水的氯化镁(MgCl2.6H20)100～200重量份；加双蒸馏水定容至1000体积份；缓冲液D是缓冲液C的稀释10倍溶液。
所述的阳性病原对照，其是由含有对虾暴发性流行病病原-白斑综合症病毒(WSSV)的病虾胃组织，经研磨，离心后，取上清液10～30μl。
所述的阴性病原对照，其是由健康的对虾未含有白斑综合症病毒(WSSV)的胃组织，经研磨，离心后，取上清液10～30μl。
所述的试剂盒，其为长方体形的外盒盖和滑配合包容的内底盒组成，即，在内底盒中设有占盒长度1/2～3/5的试剂瓶、管孔支架，该支架的架平面设在低于内底盒盒口适当位置处，并在该面上设有排列有序的大小瓶、管孔洞，该支架塞紧在内底盒的一端，在该支架的另一端立架壁与内底盒的另一端宽度立面之间的空间内设有袋装平皿和预备瓶、管；在罩扣在内底盒上的外盒盖顶平面上设有排列有序的瓶、管孔洞，该孔洞上覆设有盒贴薄膜。
所述的瓶、管孔支架，其架平面处的适当位置在内底盒高的3/5～4/5位置处，该面上所设计的大小瓶、管孔洞分别为①分别装有泡膜液和研磨液的闪烁瓶的两个大孔洞；②分别装有预杂交液，清洗液A和缓冲液B的血清瓶的三个中上孔洞；③分别装有两个封闭剂，清洗液B，三个缓冲液A，两个缓冲液D和缓冲液C的离心管的九个中下孔洞；④分别装有地高辛探针，两个抗体试剂，显色剂A，显色剂B，阳性病原对照和阴性病原对照的小离心管的七个小孔洞。
所述的外盒盖，其顶平面上设置的瓶、管孔洞为两排或三排有序排列覆盖盒贴薄膜的隐形孔洞；所述的内底盒，其盒内中还装有袋装的杂交膜，杂交袋，点样毛细管和操作手套。
本发明的积极效果在于由于在试剂盒中汇集了泡膜液，试样研磨液等十六种试剂的有序排列，使得检测步骤有序地进行，实现检测过程标准化，程序化，不易出错，操作规范，进而使检测结果标准、灵敏、快速、安全。由于设计了研磨液的优良配方，使得试样中的WSSV，DNA有效释放出来，而且由于研磨液中的各种有效成分的综合协同作用，还可使释放出来的WSSV，DNA，具有良好的特异性反应性质，从而避免非特异反应的发生。设计的预杂交液中十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)和十二烷基磺酸钠溶解于标准柠檬酸盐溶液中，再配合封闭剂(Blocking ReagentII)的作用，可使杂交膜上的除DNA单链以外的其它部分被封闭住，确保杂交特异反应正常进行。由于采用了非放射性物质-地高辛系统标记WSSV DNA、制成WSSV DNA探针，可使8pg病毒DNA可以检出，而对2ng的健康对虾DNA无反应，而确保随后的显色顺利进行。
本发明的实施例结合
一部分，通过实验过程步骤再进步展现如下。本发明实施例不仅局限以下实施例中。
图1为对虾流行病病原检测试剂盒的结构剖视图(图2的A-A剖视图)；图2为对虾流行病病原检测试剂盒的内底盒中的支孔架结构俯视图；图3为对虾流行病病原检测试剂盒的外盒盖中的支孔架结构仰视图。
参见图1-3，制成纸制的对虾病原检测试剂盒，其外形尺寸250×80×60mm，其长方体形的外盒盖1滑配合包容在内底盒2上。在内底盒2中设有试剂瓶、管孔支架3，该支架3的的尺寸140×79×40mm。该支架3的架平面设在低于内底盒2的盒口处，并在该面上设有排列有序的大小瓶、管孔洞6～21。该支架3塞紧在内底盒2的一端，在该支架3的另一端立架壁与内底盒2的另一端宽度立面之间的空间内设有袋装平皿4和预备瓶、管5。在罩扣在内底盒2上的外盒盖1顶平面上设有排列有序的瓶、管孔洞22，该孔洞22上覆设有盒贴薄膜(图中未画出)。
本试剂盒所设计的试剂瓶、管孔支架3，其架平面处在内底盒2高(60mm)的2/3位置处(40mm)。该面上所设计的大小瓶、管孔洞分别为①装有10ml泡膜液的闪烁瓶(20ml容积)的大孔洞6和装有12ml研磨剂的闪烁瓶(20ml容积)的大孔洞7。②装有4ml预杂交液的血清瓶(4ml容积)的中上孔洞8。装有4ml清洗液A的血清瓶(4ml容积)的中上孔洞9。装有3ml稀释缓冲液B的血清瓶(4ml容积)的中上孔洞10。③分别装有40mg封闭剂的两个离心管(1.5ml容积)的两个中下孔洞11。装有1.5ml清洗液B的离心管(1.5ml容积)的中下孔洞12。分别装有1ml缓冲液A的三个离心管(1.5ml容积)的三个中下孔洞13。分别装有1.5ml缓冲液D的两个离心管(1.5ml容积)的两个中下孔洞14。装有1ml缓冲液C的离心管(1.5ml容积)的中下孔洞15。④装有40μl地高辛标记的WSSV DNA探针的小离心管(0.2ml容积)的小孔洞16。分别装有40μl抗体的两个小离心管(0.2ml容积)的两个小孔洞17。装有13.5μl显色剂A的小离心管(0.2ml容积)的小孔洞18。装有10.5μl显色剂B的小离心管(0.2ml容积)的小孔洞19。装有20μl阳性病原对照的小离心管(0.2ml容积)的小孔洞20。装有20μl阴性病原对照的小离心管(0.2ml容积)的小孔洞21。
本试剂所设计的外盒盖1，其顶平面上设置的瓶、管孔洞为两排有序排列覆盖盒贴薄膜(图中未画出)的隐形孔洞22，以备实际操作时，作为试剂管架用。
本试剂盒所设计的内底盒2，其盒2内中还装有袋装的杂交膜片23和杂交袋24，以及点样毛细管和操作手套(图中未画出)。
本发明的实际检测操作过程是(一)泡膜、点样和交联(1)首先将杂交膜片23，23′于蒸馏水中湿润，而后浸泡于泡膜液中5分钟后，将该膜捞起晾干。
(2)其次，取样品-虾样的胃约0.1g置于微型离心管中，加入0.3ml研磨液，用研磨棒将样品充分磨碎。
(3)将研磨好的样品稍离心，取约0.1ml上清于微型离心管中，连同阳性病原对照和阴性病原对照一起于100℃沸水中煮沸10分钟，其目的是让DNA双链充分解链，然后再迅速置于碎冰块中2分钟以上，直到点样。目的是保持DNA呈两条单链。将每个样品包括上述三样品中的阳、阴性病原对照分别点于测试膜片23和参照模片23′的相应方格内。此步使DNA单链吸附于杂交膜片23、23′上，有利于最后结果的判断。
(4)将点样后晾干的杂交膜片23、23′分别夹于两层吸水纸中间，在80℃恒温箱中烘烤2小时。目的是使DNA单链充分地结合在杂交膜片23、23′上。
二、预杂交和杂交(1)取一只封闭剂，完全溶解于预杂交液中。将两张杂交膜片23、23′分别置于两个杂交袋24，分别加入配制好的上述混合溶液(2ml/袋)，赶尽气泡，用塑料封口机封口，在65℃水浴中孵育0.5小时。其目的是将杂交膜片23、23′上除DNA单链以外的其它部分封闭住。
(2)将病毒DNA探针于100℃沸水中煮沸10分钟，立即置于冰水中，2分钟后，将该探针加入测试膜片23的杂交袋24中封口，两杂交袋24在65℃水浴中继续孵育过夜。该探针是已知WSSV DNA的部分序列由地高辛标记而合成的，具有特异性。若样品中含有病毒DNA，该探针便会与其发生特异性反应，结合成一条DNA双链，因杂交是一个较缓慢的过程，需孵育过夜。
三、加入抗体(1)将2只缓冲液A混合，取1支封闭剂置于65℃水浴锅完全溶解于该缓冲液A中。以蒸馏水稀释10倍的清洗液A至终体积40ml，因其中有SDS沉淀，可置于水浴锅中稍加热使其完全溶解。
(2)剪开杂交袋24，取出杂交膜片23、23′，分别置于两个洗涤皿中，用稀释好的清洗液A；在室温下洗涤5分钟两次。此步的目的是洗去多余的该探针。
用蒸馏水稀释10倍的清洗液B将两张杂交膜片23、23′置于两个杂交袋24中用稀释好的清洗液B在65℃水浴中孵育15分钟两次。进行更充分的洗涤。
(3)稀释1支10倍的缓冲液A于洗涤皿中室温洗涤2分钟，将两张杂交膜片23、23′分别置于两个新的杂交袋24中，加入此步骤的第一步配制的稀释好的缓冲液A溶液室温放置30分钟，封闭。
(4)每杂交袋24加入一支地高辛抗体，室温振荡30分钟。使抗原抗体充分结合。
四、显色、观察和记录结果(1)分别稀释2支10倍的缓冲液A(BufferI)，将杂交膜23、23′置于洗涤皿中室温洗涤15分钟两次。目的是充分洗去多余的抗体。便于显色时本底的清晰。
(2)稀释2支10倍的缓冲液B(BufferIII)室温洗涤2分钟。
(3)配制显色液将显色剂A、B转移至缓冲液B中混匀，分别加入经上述步骤的杂交膜片23、23′的两个杂交袋24中。避光显色15分钟-2小时。
当测试膜片23、23′上阳性对照样品明显出现颜色而该杂交膜片23、23′本底刚有所变色时，取出膜，在蒸馏水中漂洗15-30分钟，终止显色。
结果判断依据测试膜片23、23′上阳性病原对照样品的显色应为淡蓝褐色，阴性病原对照样品无色，参照杂交膜片23′上两个样品均为无色。该膜片23′上的黄色、红色等颜色都不是病毒的显色结果。检测结果的判定要将测试膜片23与参照膜片23′对照进行。测试膜片23上斑点显蓝褐色而参照膜片23′对应斑点不显色或颜色比测试膜片23上浅得多时，该样品为带毒阳性；测试膜23斑点不显色，该样品为阴性；测试膜片23与参照膜片23′均有明显的颜色，且深浅区别不明显，则该样品由于样品处理的问题，存在明显的非特异性反应干扰，测试结果无法判断。
本试剂盒的检测方法所使用试剂和材料有NaCl、柠檬酸三钠、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、MgCl2.6H2O购自上海市化学试剂公司。十二烷基磺酸钠、十二烷基肌氨酸钠、杂交袋(Hybridization Bags)购自GIBCO BRL公司。抗地高辛抗体Anti-Digxigenin-APFab fragments、NBT、X-phos、地高辛DNA标记试剂盒和限制性内切酶BamHI购自BOEHRINGER MANNHEIM公司。
硝酸纤维杂交膜片Hybond-C购自Gelman公司。
权利要求
1.一种对虾流行病病原检测试剂盒及病原检测方法，其盒内包含有泡膜液，样品研磨液，封闭剂，预杂交液，病毒DNA探针，清洗液，抗体试剂，显色剂A、B，阳性病原对照，阴性病原对照，杂交膜片，杂交袋，微型离心管；经以下检测方法进行检测 交→(5)杂交→(6)加入抗体→(7)显色→(8)观察记录；其特征在于在(1)采样研磨步骤中，采用的样品研磨液是由以下体积比组份组成的1摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷(Tris·HCl，pH8.0)0.5～5份；0.7摩尔/升的乙二胺四乙酸二钠(EDTA).5～15份；10％的十二烷基磺酸钠(SDS).5～15份；巯基乙醇0.5～1.5份；平衡酚10～50份；双蒸水定容100份；在(4)预杂交步骤中，采用的预杂交液是由以下体积比组份组成的以标准柠檬酸盐溶液(SSC)定容1000份；20％的十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)2～20份；10％的十二烷基磺酸钠(SDS).1～6份；在(5)杂交步骤中，采用的病毒DNA探针是由非放射性的地高辛(类固醇半抗原)标记而合成的含有白斑综合症病毒DNA(WSSV DNA)的小片断，具有特异性的该探针的模板是1.018～1.6364碱基对(kb)的病毒插入片断。
2.根据权利要求1所述的对虾流行病病原检测试剂盒及病原检测方法，其特征在于所述的诸试剂，其配制成剂后，在4℃～6℃的储存条件下，储存备用。
3.根据权利要求1所述的对虾流行病病原检测试剂盒及病原检测方法，其特征在于所述的(1)采样研磨步骤是①采取虾样的胃或虾头约0.1～2克；②置于微型离心管中，加入0.3～1ml的研磨液；③用研磨棒将样品充分研磨，至磨碎；④研磨棒用前、用后要用高锰酸钾溶液浸泡消毒，并清洗晾干再用。
4.根据权利要求1所述的对虾流行病病原检测试剂盒及病原检测方法，其特征在于所述的清洗液，其包括清洗液A和清洗液B；其中，清洗液A是由以下体积比组份组成的20倍的标准柠檬酸盐溶液(SSC)2.5～5份；10％的十二烷基磺酸钠(SDS)0.2～0.5份；其中，清洗液B是由以下体积比组份组成的；20倍的标准柠檬酸盐溶液(SSC)0.5～1.5份；10％的十二烷基磺酸钠(SDS)1～3份；双蒸馏水定容至200份。
5.根据权利要求1所述的对虾流行病病原检测试剂盒及病原检测方法，其特征在于所述的缓冲液，其包括，缓冲液A，缓冲液B，缓冲液C和缓冲液D；其中，缓冲液A是由以下重量体积比组份组成的，三羟甲基氨基甲烷(Tris)100～150重量份；氯化钠60～90重量份；双蒸馏水溶解至800体积份；用浓盐酸调节pH6～8；加双蒸馏水定容至1000体积份；缓冲液B是缓冲液A的稀释10倍溶液；缓冲液C是由以下重量体积比组份组成的三羟甲基氨基甲烷(Tris)100～150重量份；氯化钠40～60重量份；双蒸馏水溶解至800体积份；用浓盐酸调节pH9.5；带六个结晶水的氯化镁(MgCl2·6H2O)100～200重量份；加双蒸馏水定容至1000体积份；缓冲液D是缓冲液C的稀释10倍溶液。
6.根据权利要求1所述的对虾流行病病原检测试剂盒及病原检测方法，其特征在于所述的阳性病原对照，其是由含有对虾暴发性流行病病原-白斑综合症病毒(WSSV)的病虾胃组织，经研磨，离心后，取上清液10～30μl。
7.根据权利要求1所述的对虾流行病病原检测试剂盒及病原检测方法，其特征在于所述的阴性病原对照，其是由健康的对虾未含有白斑综合症病毒(WSSV)的胃组织，经研磨，离心后，取上清液10～30μl。
8.根据权利要求1所述的对虾流行病病原检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒，其为长方体形的外盒盖和滑配合包容的内底盒组成，即，在内底盒中设有占盒长度1/2～3/5的试剂瓶、管孔支架，该支架的架平面设在低于内底盒盒口适当位置处，并在该面上设有排列有序的大小瓶、管孔洞，该支架塞紧在内底盒的一端，在该支架的另一端立架壁与内底盒的另一端宽度立面之间的空间内设有袋装平皿和预备瓶、管；在罩扣在内底盒上的外盒盖顶平面上设有排列有序的瓶、管孔洞，该孔洞上覆设有盒贴薄膜。
9.根据权利要求8所述的对虾流行病病原检测试剂盒，其特征在于所述的瓶、管孔支架，其架平面处的适当位置在内底盒高的3/5～4/5位置处，该面上所设计的大小瓶、管孔洞分别为①分别装有泡膜液和研磨液的闪烁瓶的两个大孔洞；②分别装有预杂交液，清洗液A和缓冲液B的血清瓶的三个中上孔洞；③分别装有两个封闭剂，清洗液B，三个缓冲液A，两个缓冲液D和缓冲液C的离心管的九个中下孔洞；④分别装有地高辛探针，两个抗体试剂，显色剂A，显色剂B，阳性病原对照和阴性病原对照的小离心管的七个小孔洞。
10.根据权利要求8所述的对虾流行病病原检测试剂盒，其特征在于所述的外盒盖，其顶平面上设置的瓶、管孔洞为两排或三排有序排列覆盖盒贴薄膜的隐形孔洞；所述的内底盒，其盒内中还装有袋装的杂交膜片，杂交袋，点样毛细管和操作手套。
全文摘要
本发明是对虾流行病病原检测试剂盒及其检测方法。该盒内包含有:研膜液等二十二种试剂和材料设计的。WSSV病原检测方法为:(1′)泡膜_(1)采样研磨→(2)点样→(3)交联→(4)预杂交→(5)杂交→(6)加入抗体→(7)显色→(8)观察记录。设计了样品研磨液,预杂交液和地高辛标记的病毒DNA探针,使检测方法标准化,商品化,配套化,具有准确、灵敏、安全、方便的特点。
文档编号C12Q1/70GK1340706SQ0011133
公开日2002年3月20日 申请日期2000年8月30日 优先权日2000年8月30日
发明者史成银, 杨冰, 黄捷, 宋晓玲, 杨丛海 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所