专利名称：一种突变的hpv16 e7基因的克隆、表达与蛋白纯化方法
技术领域：
本发明属于基因克隆表达技术领域，具体涉及一种突变的HPV16 E7基因的克隆、 表达与蛋白纯化方法。
背景技术：
宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，发病率位于女性肿瘤的第二位，仅排在乳腺癌之后，每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例，约20万人死于宫颈癌，在一些发展中国家甚至已居于女性癌症死亡率首位。分子流行病学的研究已经证实人乳头瘤病毒 (humanpapi 1 lomavirus,HPV)感染与宫颈癌有着十分密切的关系。HPV高危型(HPV16，18， 31，45型等)的感染是导致宫颈癌发生和发展的重要原因，宫颈癌中HPV DNA的检出率高达 99%，其中HPV16约为60%。因此，HPV疫苗用于预防和治疗宫颈癌已成为近年来的研究热点。尽管HPV预防性疫苗已经问世，但是面对众多已感染HPV且出现病变的患者，预防性疫苗作用不大。HPV16两个早期基因E6、E7的表达产物E6、E7蛋白在肿瘤发生、细胞周期调控及凋亡调节中起重要作用，是宫颈癌发生的主要原因，在癌细胞中持续表达，也被称为E6、E7 癌蛋白。因此E6和E7蛋白可以作为HPV16相关肿瘤治疗性疫苗的理想靶抗原，相继也出现了以E6、E7为免疫抗原不同形式的疫苗。由于蛋白质疫苗既不受HLA限制性，又避免了病毒载体或DNA疫苗潜在的安全隐患，是目前公认最安全、有效的疫苗。有报道，E6、E7蛋白的突变体可以避免或降低其转化活性。E7蛋白的第2位His、M位Cys以及两个模序 Cys-X-X-Cys (分别为58_61和91_94)结构是其转化活性的关键部位，将M位Cys转变为 Gly可以完全消除E7蛋白的转化活性，而将2位His转变为Gly、61或94为Cys转变为Gly 也可以大大降低蛋白的转化活性，因此克隆表达E6、E7蛋白的突变体将能够进一步提高疫苗的安全性。
发明内容
本发明需要解决的问题是为进一步改进了宫颈癌治疗性疫苗的安全性而克隆、表达并分离纯化突变的HPV16 E7蛋白质的方法。本发明是关于一种突变的HPV16 E7基因(mutant E7，mE7)的克隆、表达与蛋白纯化方法。主要由以下内容组成1.重组克隆载体TA-mE7的构建(l)HPV16mE7 的引物设计以pET28a(+)_E7为模板，通过拼接PCR扩增mE7，引入E7基因第70位碱基突变(T — G)，去除终止密码子之前的15bp，设计出4条引物mE7pl、mE7p2、mE7pl-G-3，、 mE7p2-G-5，。上游弓丨物mE7pl含有内切酶位点Nde I，下游弓丨物mE7p2含有内切酶位点Hind III，引入突变位点的弓I物分另Ij为mE7p 1-G-3，，mE7p2-G_5，。
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mE7pl :5，-CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3， mE7p1-G-3， 5，-TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3，mE7p2-G-5， 5， -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3，mE7p2 :5， -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3‘(2)拼接PCR扩增HPV16mE7基因片段以pET28a(+)_E7为模板，通过拼接PCR扩增mE7基因片段，先扩增Nde I与E7基因第84碱基中间的片段(13^p，称为Nde I_E784)和E7基因第56-297位碱基序列(称为 E756_297)。PCR反应体系(Pyrobest 酶)41. 25 μ L无菌水，5 μ L IOXbuffer (含MgCl2)，1 μ L IOmM dNTPs,1 μ L mE7pl/mE7pl-G_3，，1 μ L mE7p2-G_5，/mE7p2，0· 5 μ L pET28a(+)-E7， 0.25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即进行扩增。反应条件为94°C预变性!Min ；然后进行以下 35 个循环:94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ；最后在 72°C延伸 3min。上述PCR产物用1 %琼脂糖凝胶90V恒压电泳20min，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增Nde I-mE7序列。PCR反应体系(Pyrobest酶):39. 75 μ L无菌水，5口1^10父1311打61~(含]\%(12)，1口1^ IOmM dNTPs, 1 μ L mE7pl, 1 μ L mE7p2,1 μ L Nde I-E784，1 μ L E756_297，0.25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即进行扩增。反应条件为94°C预变性 3min ；然后进行以下；35 个循环94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ；最后在 72°C延伸!3min。琼脂糖凝胶电泳、胶回收DNA片段，为便于用Taq酶延伸加A，胶回收的洗脱缓冲液使用含MgCl2的Taq酶缓冲液。用25 μ L胶回收洗脱缓冲液洗脱PCR扩增的DNA片段。取 13. 7μ L的胶回收洗脱液，加入1. 2μ L IOmM dNTP和0. IyL Taq酶，72°C延伸6min，PCR产物延伸A。(3) TA克隆连接取IyL PMD18-T载体，加入2yL延伸过A的mE7片段，再加入5yL的连接缓冲液，2 μ L无菌水补足至1(^1^体系，于161连接2hr。(4) TA克隆转化将上述TA连接产物10 μ L转移到DH5 α感受态细胞中；冰上静置30min ；42°C热激 90s ；冰上再静置 5min ；加入 800 μ L LB, 37°C摇床 120rpm 摇 Ihr ；4000rpm 离心 3min ；在超净台中移去大部分上清，轻悬沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板中； LB平板倒置于37°C培养箱培养过夜。(5) TA克隆的鉴定随机挑取4个TA阳性克隆，接入4mL LB (Amp+)中；37°C摇床220rpm摇过夜；抽提质粒TA-mE7，保存于_80°C，并进行双酶切和PCR鉴定。选取双酶切和PCR都为阳性的TA 克隆质粒测序。2.重组表达质粒pET_28a (+) ~mE7的构建(1)酶切与回收mE7基因序列中有EcoR I酶切位点(E7上游引物中引入)，用EcoR I/Hind III 双酶切TA-mE7及pET48a(+)质粒，用1 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收目标片段。(2) T4DNA连接酶连接及转化连接体系为1 μ L IOX连接酶缓冲液，1 μ L双酶切pET48a (+)质粒，7 μ L mE7片段，1 μ L T4DNA连接酶，16°C连接过夜。
将连接产物转入DH5 α感受态，转化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB 平板上，37°C倒置培养过夜。(3)阳性克隆鉴定随机挑取4个阳性克隆，接入4mL的LB (Kan+)中；37°C摇床220rpm摇过夜；抽提质粒进行双酶切(EcoR I/Hind III)和PCR鉴定。3. mE7蛋白的诱导表达与鉴定(1)重组质粒转化大肠杆菌将上述鉴定为阳性的重组质粒pET_28a (+) _mE7转入感受态Rosetta，涂布于LB平板(Kan+)上，37°C倒置培养过夜。(2) IPTG诱导蛋白表达挑单克隆于LB(Kan+)中，37°C摇床，220rpm培养过夜，以1 50接过夜菌于20mL LB(Kan+)中，继续培养3hr左右，OD6tltlnm达到0. 6-0. 8时加入IPTG至ImM诱导蛋白表达，分别于 0hr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。(3) SDS-PAGE 鉴定取ImL菌液12000rpm离心Imin收集菌体，加入IOOyL的IX上样缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm离心lmin，取10 μ L样品进行12% SDS-PAGE,电泳条件为18mA, 1. 5hr0取下凝胶在考马斯亮蓝染液中摇动染色lhr，移入洗脱液中摇动洗脱过夜。观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示诱导4hr后蛋白表达到达高峰。4. mE7蛋白的纯化和鉴定(l)mE7蛋白的诱导表达将过夜培养已转入pET-28a(+)_mE7的Rosseta菌液以1 50接于IL LB (Kan+) 中，37°C摇床，220rpm培养2hr左右，OD600nm达到0. 6-0. 8时，加入IPTG至ImM,继续诱导培养4hr，4°C，7000rpm离心6min，收集菌体，-80°C保存。(2)细菌蛋白表达形式的分析-80°C冻存菌体按每克湿菌5-10mL的比例加入细菌裂解液(0. 5M NaCl, 20mM Tris, IOmM巯基乙醇，ImM PMSF，pH7. 9)，超声破菌，4°C，8000rpm离心20min，包涵体沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示mE7蛋白主要存在于包涵体中。(3)mE7蛋白的纯化超声破菌后，4 °C，8000rpm离心20min，弃上清，沉淀用50mL溶液(0. 5MNaCl， 20mMTris,0. 5% Triton, pH7. 9)超声洗涤一次；4°C，8000rpm 离心 20min，弃上清。沉淀即包涵体加入30mL溶液(0. 5M NaCl, 20mM Tris，6M盐酸胍，ρΗ7· 9)，置37°C溶解2hr以上。 4°C，16000rpm 离心 20min，取上清上样至预先用 0. 5M NaCl, 20mM iTrisjM 盐酸胍，pH7. 9 的溶液平衡好的镍柱，分别用溶液①、②、③(①0.5M NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，5mM 咪唑，6M 盐酸胍，pH7. 9 ；② 0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM 巯基乙醇，5mM 咪唑，8M 尿素，pH7. 9 ； ③0.5M NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，20mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗涤10个柱床体积， 再用洗脱缓冲液(0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，200mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗脱， 收集蛋白液，置4°C对IXPBS充分透析，4°C，16000rpm离心20min，取上清液。收获的蛋白用SDS-PAGE进行纯度分析，结果显示纯化的蛋白分子量约为20kDa。(4)mE7蛋白的鉴定
Western blot鉴定SDS_PAGE电泳结束后取下凝胶，电转到硝酸纤维素膜上 (4 °C,100V, Ihr)，取膜，于室温用5%脱脂奶粉封闭》ir，加入鼠抗人HPV16 E7抗体，室温孵育》ir，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗体室温孵育1. 5hr,再用PBST洗膜3 次，每次lOmin，加入底物液显色，在暗室内显影、定影。结果显示约20kDa处出现了 mE7的目标条带O
具体实施例方式以下通过具体的实施例对本发明作进一步阐述。实施例1 :mE7的核苷酸序列本发明克隆了 E7的突变体，将第70位碱基由T变成G，并去除终止密码子前的15 个碱基，先后构建了重组克隆质粒TA-mE7和重组表达质粒PETj8a(+)-mE7，mE7的核苷酸序列见说明书的下一部分。 实施例2 :mE7蛋白的氨基酸序列本发明分离纯化了 mE7蛋白，与HPV16 E7蛋白相比较，第M位氨基酸残基由Cys 转变为Gly，并且去除了 C-末端5个氨基酸残基，包括94位的Cys，破坏了 Cys-X-X-Cys的模序结构。mE7蛋白的氨基酸序列见说明书的下一部分。实施例3 :mE7蛋白预防免疫抗肿瘤作用1. 5nmol蛋白(mE7蛋白及E7蛋白，PBS组为对照)皮下免疫C57BL/6小鼠，两周后腹腔加强免疫1次，一周后皮下接种IXlO5TC-I细胞(经胰酶消化，PBS洗涤2次)。之后每天观察肿瘤生长状况，12d后用游标卡尺测量肿瘤长径和垂直径(每3d测量1次)，持续观测直至对照组小鼠开始死亡为止，继续观察直到荷瘤小鼠全部死亡，记录其荷瘤情况及存活时间，结果全部PBS组小鼠长出了肿瘤，而mE7和E7蛋白免疫组则100 %保护了小鼠不生成肿瘤。植瘤40d时未长瘤小鼠皮下再接种2X IO5TC-I细胞，以未免疫小鼠作为对照组，之后每天观察肿瘤生长状况，直到对照组小鼠全部死亡，记录其荷瘤情况及存活时间， 结果显示对照组小鼠6d后全部长瘤，而mE7和E7蛋白免疫组50d后仍无瘤体生长。
权利要求
1.一种突变的HPV16 E7基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征是“通过拼接PCR 的方法克隆突变的HPV16 E7序列，构建重组的原核表达载体PETj8a(+)-mE7，原核表达并纯化突变的HPV16 E7蛋白”。
2 根据权利要求1所述的突变的HPV16E7基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征是突变的HPV16 E7基因的克隆方法为以pET28a(+)-E7为模板，通过拼接PCR扩增mE7基因片段，先扩增Nde I与E7基因第84碱基中间的片段(135bp，称为Nde I_E784)和E7基因第56-297位碱基序列(称为E756_297)，用胶回收试剂盒回收目的片段Nde I_E784和E756_297， 再拼接PCR扩增Nde I-mE7序列，然后构建重组克隆质粒TA_mE7。
3.根据权利要求1所述的突变的HPV16E7基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征是突变的HPV16 E7基因的重组表达质粒的构建方法为mE7基因序列中有EcoR I酶切位点(E7上游引物中引入)，用EcoR I/Hind III双酶切TA_mE7，将mE7基因定向插入表达载体pET-28a (+)，构建重组表达质粒pET-28a (+) _mE7。
4.根据权利要求1所述的突变的HPV16E7基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征是突变的HPV16 E7蛋白的表达与纯化方法为将转入PETj8a(+)-mE7的Rosetta菌在 37°C培养，ImM IPTG诱导表达4hr，超声裂菌后，用镍柱纯化mE7蛋白，与HPV16 E7蛋白相比较，突变的E7蛋白多肽链中第M位氨基酸由原来的Cys转变为Gly，而且去除了 C-末端 5个氨基酸残基，包括第94位的Cys，破坏了 Cys-X-X-Cys的模序结构，避免或降低了 E7蛋白的转化活性，作为宫颈癌治疗的疫苗更为安全可靠。
全文摘要
本发明用原核细胞表达系统表达了突变的HPV16 E7蛋白。首先克隆了突变的E7(mutantE7，mE7)基因，将第70位碱基由T变成G，并去除终止密码子前的15个碱基，分别构建了mE7的克隆载体TA-mE7和表达载体pET-28a(+)-mE7，并原核表达、分离纯化了mE7蛋白，与HPV16 E7蛋白相比较，第24位氨基酸残基由Cys转变为Gly，并且去除了C-末端5个氨基酸残基，包括94位的Cys，破坏了Cys-X-X-Cys的模序结构，从而大大降低了E7蛋白的转化活性。mE7蛋白免疫100％保护了小鼠不生成TC-1肿瘤。
文档编号C07K14/025GK102373226SQ20101026292
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月26日 优先权日2010年8月26日
发明者刘建宁, 李艳利 申请人:南京大学