樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉组合物及在制备抗痛风药物中的应用的制作方法

本发明涉及鄂西北十堰地区樱桃樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉组合物及在制备抗痛风药物中的应用。

背景技术：

痛风是一种单钠尿酸盐（monosodiumurate,msu）沉积所致的晶体相关性疾病，与嘌呤代谢紊乱及（或）尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，属于代谢性风湿病范畴。痛风发作时患者会出现剧烈疼痛，被称为“痛中之王”，临床上表现为急性发作性关节肿痛，常伴有血尿酸水平升高。最新流行病学资料显示痛风的发病率在世界范围内呈逐年上升趋势，受种族、基因、年龄、性别、饮食、职业、环境和受教育程度等多因素影响。

来自中国风湿病数据中心的数据显示，在痛风发作期间，有79％的患者会因疼痛和需住院治疗而不能坚持正常工作，严重影响患者的工作和生活质量，给患者及社会带来极大的精神压力和经济负担，故对痛风发病机制的研究以及开发有效的预防与治疗药物尤其重要。

目前，对于痛风还没有完全根治的办法，只能通过药物干预缓解病情。痛风的药物干预包括降尿酸治疗和抗炎治疗。临床上常用的降尿酸药物主要包括以别嘌呤醇为代表的抑制尿酸合成的药物和以苯溴马隆为代表的促进尿酸排泄药物两类。别嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧化酶产生降尿酸作用，是一线抗痛风药物，但其常见的肝肾功能损伤和超敏反应限制了其应用范围，发生超敏反应后其死亡率高达20%。临床上常用于治疗痛风的抗炎药物主要包括非甾体类抗炎药（nsaids）、秋水仙碱和糖皮质激素。nsaids、秋水仙碱及糖皮质激素存在严重胃肠道反应，肝肾损伤、并发感染等不良反应，禁止大剂量及长期使用。

上述用于降尿酸、防治痛风的有效药物，由于其严重的不良反应、依从性差、价格昂贵等原因，导致全球范围内痛风的药物干预效果仍不容乐观。因此，探索价优易得、不良反应小、治疗依从性好、安全有效、可长期使用的抗痛风药物成为该领域亟待解决的热点。

樱桃为蔷薇科樱桃属植物，是一种低热量、低糖、低脂肪且营养成分十分丰富的水果，其含铁量居众水果之首。樱桃的活性成分主要为花色苷、花青素、褪黑素、槲皮素、异槲皮素等，其中以花色苷和花青素含量最高。已有的研究表明，樱桃果实具有镇痛、抗炎、抗氧化、降尿酸、抗痛风、抗肿瘤、降血糖、降血脂、眼科保健等药理作用。国内研究者蒲昭和指出一般痛风病人，使用樱桃能起到消肿、减轻疼痛的作用。土茯苓是临床应用较广的抗痛风中药。

鄂西北十堰地区，是我国中西结合部和南北气候过渡带，中药材资源丰富，品种优良。其中郧阳区樱桃色优味美，深受大众喜爱。该地区樱桃外观明显区别于美国车厘子大樱桃及其他地区樱桃，颗粒较小，呈粉色偏黄，酸甜味。据当地痛风患者多年经验显示，鄂西北十堰地区（郧阳区）樱桃对痛风具有很好的防治作用。樱桃兼有降血压、降血糖等药理活性，且是药食同源的果品，安全性好便于长期服用，可弥补传统抗痛风药物的不足，有望研发成为新型抗痛风药物。

技术实现要素：

本发明提出樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉组合物及在制备抗痛风药物中的应用，主要揭示鄂西北十堰地区樱桃冻干粉作为抗痛风药物应用的价值。

为此，本发明采用的技术方案如下所述。

樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉组合物，其特征在于：是樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉的均匀混合物，樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉的质量比为2:1；

1）所述樱桃冻干粉的制备：采用鄂西北十堰地区樱桃，把樱桃洗净，将樱桃果核分离，弃掉，剩余部分放入-80℃保存；取去核后的樱桃解冻，根据质量比1∶4加入纯水，浸泡1h，在1000w、60℃、25khz条件下，超声提取20min；干净的纱布初滤超声提取液，3900r/min、23℃，离心20min，收集上清液，放置于冻干瓶内，干冰丙酮浴中快速冷冻，置入真空冷冻干燥机（-80℃、0.2mbar），制得冻干粉；分装在干净容器内，封口膜密封，-20℃存放，备用；

2）所述土茯苓冻干粉的制备：把土茯苓洗净、烘干，把烘干后的土茯苓粉碎，粉碎粒度为50-200目，根据质量比1:10加入纯水，其它过程同步骤1），制得土茯苓冻干粉。

上述樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉组合物，在制备抗痛风药物中的应用。

一种抗痛风药物，其特征在于：活性成分是上述樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉组合物。

有益效果：本发明利用鄂西北十堰地区樱桃制备的樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉组合物作为抗痛风药物中的应用，通过非尿酸合成抑制途径发挥降尿酸作用，对高尿酸血症小鼠具有显著的降尿酸效果，能明显降低高尿酸血症小鼠的血清肌酐和尿素氮水平，且对肝脏无明显影响。

附图说明

图1是本发明樱桃冻干粉及其联合土茯苓对高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的影响比较图。

图2是本发明樱桃冻干粉及其联合土茯苓对高尿酸血症小鼠血清肌酐水平的影响比较图。

图3是本发明樱桃冻干粉及其联合土茯苓对高尿酸血症小鼠血清尿素氮水平的影响比较图

图4是本发明樱桃冻干粉及其联合土茯苓对高尿酸血症小鼠血清渗透压水平的影响比较图

图5本发明樱桃冻干粉及其联合土茯苓对高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响比较图

图6本发明樱桃冻干粉及其联合土茯苓对高尿酸血症小鼠肾脏病理学变化的影响比较图

图7本发明樱桃冻干粉对高尿酸血症小鼠肝脏病理学变化的影响比较图。

具体实施方式

实施例1

樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉组合物，其特征在于：是樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉的均匀混合物，樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉的质量比为2:1；

1）所述樱桃冻干粉的制备：樱桃采购于湖北省十堰市郧阳区当地樱桃沟樱桃，购买当天快速进行初期处理：挑选颗粒饱满、完整的樱桃，洗净，将樱桃果核分离、弃掉，剩余的果汁与果肉部分放入-80℃保存；樱桃冻干粉制备：取樱桃解冻，根据质量比1：4加入纯水，浸泡1h，在1000w、60℃、25khz条件下，超声提取20min；干净的纱布初滤超声提取液，3900r/min、23℃，离心20min，收集上清液，放置于冻干瓶内，干冰丙酮浴中快速冷冻，置入真空冷冻干燥机（-80℃、0.2mbar），制得冻干粉；分装在干净容器内，封口膜密封，-20℃存放，备用；

2）所述土茯苓冻干粉的制备，土茯苓购自湖北省十堰市太和医院中药房，洗净、烘干，把烘干后的土茯苓粉碎，粉碎粒度为50-200目，根据质量比1:10加入纯水，其它过程同步骤1），制得土茯苓冻干粉。

实施例2樱桃果核冻干粉血清尿酸、肌酐、尿素氮、渗透压水平检测

1、高尿酸血症动物模型的建立与给药方法

通过查阅文献及预实验结果，采用氧嗪酸钾、次黄嘌呤联合法建立高尿酸血症动物模型：氧嗪酸钾按50mg/kg一次性皮下注射给药+次黄嘌呤按500mg/kg一次性腹腔注射给药。氧嗪酸钾、次黄嘌呤均用0.5%cmc-na配成混悬液；

spf级昆明种小鼠64只，雄性，体重28±2g，随机分为8组（n=8）：溶剂对照组、模型组、樱桃干粉组、樱桃+土茯苓冻干粉组（其中，樱桃冻干粉与土茯苓冻干粉的质量比为2:1）、车厘子冻干粉对照组、苯溴马隆组和别嘌呤醇组；

各租冻干粉组分别用生理盐水溶解、混匀，配成25mg/ml的溶液；苯溴马隆、别嘌呤醇分别用生理盐水溶解、混匀，配成1mg/ml溶液；对照组和模型组按照0.4ml/20g灌胃给予生理盐水；樱桃/樱桃+土茯苓/车厘子冻干粉组均按照500mg/kg灌胃给药；苯溴马隆组和别嘌呤醇组均按20mg/kg灌胃给药，每日1次，灌胃时间为早上10点，连续7天；第7天，除对照组外，其余各组在末次灌胃给药前1h，即早上9点，采用氧嗪酸钾+次黄嘌呤联合造模，对照组通过腹腔和皮下注射相应体积0.5%cmc-na给予同样的刺激。1h后各组灌胃给药，灌胃后1h进行标本采集。

标本采集

第7天各组动物灌胃1h后，摘眼球取血，4000rpm，4℃离心10min取血清，-80℃保存待测；采血后颈部脱臼处死小鼠，冰上收集两小块肝脏，一块快速置于ep管中冰浴，用于制备肝组织匀浆液，另一块固定于4%多聚甲醛用于观察肝脏病理学变化；冰上取下小鼠左右两侧肾，切取适当大小的一侧肾置于4%多聚甲醛固定用于观察肾脏病理学变化，剩余部分-80℃保存用于检测尿酸转运蛋白水平；另一侧肾脏快速置入液氮保存用于提取mrna。

小鼠肝组织匀浆液制备

取肝组织约0.06g，根据黄嘌呤氧化酶检测试剂盒要求加入4倍体积的assaybuffer提取黄嘌呤氧化酶，在冰浴中以眼科剪刀迅速剪碎、匀浆，匀浆机开至6档，匀浆3次，每次停10s；16000g，4℃离心10min，取上清液测黄嘌呤氧化酶活性（xor）。

血清尿酸、肌酐、尿素氮、渗透压水平检测

血清尿酸、血清肌酐、血清尿素氮分别根据相应试剂盒（货号分别为：c012-2、c011-1、c013-2，南京建成生物技术有限公司）进行检测，血清渗透压水平采用渗透压仪（美国advancedinstrumentsinc.公司）检测。

血清尿酸水平检测

图1中所示，ctr：对照组，vehicle：模型组，wdc：鄂西北十堰地区樱桃组，wdc+tfl：鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组，sweetcherry：车厘子组，ben：苯溴马隆组，ap：别嘌呤醇组；

与对照组比较，^***p<0.001；与模型组比较，^###p<0.001。

与对照组比较，模型组血清尿酸水平具有极显著的统计学意义，提示造模成功。本实验结果表明车厘子组的血清尿酸水平与模型组比较具有极显著的统计学意义，与文献报道结果一致；樱桃冻干粉组与模型组比较也能显著降低血清尿酸水平，且他们的降尿酸效果与车厘子比较无明显的统计学意义。樱桃+土茯苓组与模型组比较能显著降低血清尿素水平。阳性对照组苯溴马隆和别嘌呤醇均能显著降低血清尿酸水平，且别嘌呤醇能将小鼠的血清尿酸水平降到正常值以下；血尿酸在体内具有双重作用，正常生理浓度的血尿酸具有抗氧化和抑制dna损伤作用，当尿酸浓度低于正常水平时，体内抗氧化能力急剧下降引起血管内皮细胞炎性反应和功能紊乱，表明鄂西北十堰地区樱桃相比别嘌呤醇具有更安全、副作用更小的降尿酸效果。

上述结果表明，鄂西北十堰地区樱桃冻干粉单用或者与土茯冻干粉苓联用均能明显降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平，且二者联用降尿酸效果优于单用樱桃冻干粉。

4.2血清肌酐水平检测

图2中所示，ctr：对照组，vehicle：模型组，wdc：鄂西北十堰地区樱桃组，wdc+tfl：鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组，sweetcherry：车厘子组，ben：苯溴马隆组，ap：别嘌呤醇组。与对照组比较，^***p<0.001；与模型组比较，^##p<0.01，^###p<0.001。

小鼠血清肌酐检测结果表明，模型组血清肌酐水平与对照组比较具有极显著的统计学意义。与模型组比较，鄂西北十堰地区樱桃、鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组以及车厘子组均能显著降低高尿酸血症小鼠的血清肌酐水平，苯溴马隆和别嘌呤醇也有相似的作用。

上述结果表明，鄂西北十堰地区樱桃冻干粉单用或者与土茯苓冻干粉联用可显著降低高尿酸血症小鼠的血清肌酐水平。

4.3血清尿素氮水平检测

图3中所示，ctr：对照组，vehicle：模型组，wdc：鄂西北十堰地区樱桃组，wdc+tfl：鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组，sweetcherry：车厘子组，ben：苯溴马隆组，ap：别嘌呤醇组。与对照组比较，^***p<0.001；与模型组比较，^##p<0.01，^###p<0.001。

模型组血清尿素氮水平显著高于对照组，与模型组比较，鄂西北十堰地区樱桃组与鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组均能显著降低高尿酸血症小鼠的血清尿素氮水平，车厘子组也能显著降低血清尿素氮水平。苯溴马隆和别嘌呤醇的血清尿素氮水平与模型组比较也具有极显著的统计学意义。

上述研究结果表明，鄂西北十堰地区樱桃冻干粉单用或者与土茯苓冻干粉联用能明显降低高尿酸血症小鼠的血清尿素氮水平。

4.4血清渗透压水平检测

图4中所示，ctr：对照组，vehicle：模型组，wdc：鄂西北十堰地区樱桃组，wdc+tfl：鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组，sweetcherry：车厘子组，ben：苯溴马隆组，ap：别嘌呤醇组。

与模型组比较，苯溴马隆显著降低高尿酸血症小鼠的血清渗透压水平，与对照组比较，其差异无统计学意义；其他各组对血清渗透压水平的影响无统计学意义。

上述研究结果表明，鄂西北十堰地区樱桃冻干粉单用或者与土茯苓冻干粉联用对小鼠的血清渗透压水平基本无影响。

血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性检测

采用黄嘌呤氧化酶检测试剂盒（货号：k710-100，美国biovision公司），按其使用说明书操作步骤进行测定。

图5中所示，ctr：对照组，vehicle：模型组，wdc：鄂西北十堰地区樱桃组，wdc+tfl：鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组，sweetcherry：车厘子组，ben：苯溴马隆组，ap：别嘌呤醇组。

与对照组比较，^***p<0.001；与模型组比较，^###p<0.001。

与模型组比较，别嘌呤醇组的肝脏黄嘌呤氧化酶活性具有统计学意义，别嘌呤醇组检测到该酶活性极低，这与别嘌呤醇降尿酸的作用原理相一致，即别嘌呤醇作为一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，它可使该酶活性丧失引起尿酸合成受阻从而消除高尿酸血症。且别嘌呤醇不仅能显著降低高尿酸血症小鼠的肝脏黄嘌呤氧化酶活性，也能显著降低正常小鼠体内该酶的活性。此外，本课题组也对血清中的黄嘌呤氧化酶活性进行了检测，结果显示血清中该酶活性极低，几乎为零。

与模型组比较，鄂西北十堰地区樱桃组对肝脏黄嘌呤氧化酶无显著影响，说明鄂西北十堰地区樱桃通过非尿酸合成抑制途径发挥降尿酸作用。而鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组肝脏黄嘌呤氧化酶活性有显著下降，表明土茯苓对黄嘌呤氧化酶有一定的抑制作用，但其抑制作用较别嘌呤醇弱。

基于此研究结果，目前正在探索鄂西北十堰地区樱桃通过以尿酸转运蛋白为靶点的促进尿酸排泄途径的降尿酸作用机制。

肝、肾组织病理学观察

实验第7天，处死小鼠，取其肾脏和肝脏，分别放入4%多聚甲醛固定液固定24h，之后脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，轮转式切片机切片（3-5μm厚度），摊片、50-60℃烤片，30-60min后苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，he）染色，经脱蜡、水洗、分化、返蓝、伊红染色、脱水、透明和封片后，显微镜下观察肾脏和肝脏的组织病理学变化。

鄂西北十堰地区樱桃对高尿酸血症小鼠肾脏病理学变化的影响

图6所示，control：对照组，hu+vehicle：高尿酸血症模型组，hu+ben：高尿酸血症苯溴马隆组，hu+ap：高尿酸血症别嘌呤醇组，hu+wdc：高尿酸血症鄂西北十堰地区樱桃组，hu+wdc+tfl：高尿酸血症鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组，hu+sweetcherry：高尿酸血症车厘子组。图中黑色箭头代表肾小管扩张，红色箭头代表肾小管上皮萎缩。

模型组、苯溴马隆组和别嘌呤醇组均出现肾小管扩张和肾小管上皮萎缩现象，而鄂西北十堰地区樱桃组、鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组及车厘子组均无明显肾损伤。

上述研究结果表明，鄂西北十堰地区樱桃单用或者与土茯苓联用能逆转高尿酸血症带来的肾脏损害，对肾脏具有一定的保护作用。

鄂西北十堰地区樱桃对高尿酸血症小鼠肝脏病理学变化的影响

图7所示，control：对照组，hu+vehicle：高尿酸血症模型组，hu+ben：高尿酸血症苯溴马隆组，hu+ap：高尿酸血症别嘌呤醇组，hu+wdc：高尿酸血症鄂西北十堰地区樱桃组，hu+wdc+tfl：高尿酸血症鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组，hu+sweetcherry：高尿酸血症车厘子组。

模型组肝细胞形态与对照组相近，与模型组比较，苯溴马隆组出现明显的肝细胞高度水肿，肝窦消失及部分细胞坏死，这与文献中报道的苯溴马隆存在严重的肝毒性的结论相一致。鄂西北十堰地区樱桃组及车厘子组未出现明显损伤，鄂西北十堰地区樱桃+土茯苓组出现轻微水肿，可能与给药剂量偏大有关，本课题后期会调整相应的给药剂量，继续进行动物实验进一步验证结论。

上述研究结果表明，鄂西北十堰地区樱桃对小鼠的肝脏基本无影响。

基于上述工作，我们初步得出以下结论：

1.鄂西北十堰地区樱桃单用或者与土茯苓联用对高尿酸血症小鼠具有显著的降尿酸效果；

2.鄂西北十堰地区樱桃单用或者与土茯苓联用能明显降低高尿酸血症小鼠的血清肌酐和尿素氮水平；

3.鄂西北十堰地区樱桃单用或者与土茯苓联用对小鼠的血清渗透压水平基本无影响；

4.鄂西北十堰地区樱桃单用对小鼠的肝脏黄嘌呤氧化酶活性无明显影响，且血中的黄嘌呤氧化酶活性基本为零，说明鄂西北十堰地区樱桃通过非尿酸合成抑制途径发挥降尿酸作用；十堰地区樱桃与土茯苓联用黄嘌呤氧化酶活性显著降低，说明土茯苓降尿酸机制可能为抑制黄嘌呤氧化酶活性；

5.鄂西北十堰地区樱桃单用或者与土茯苓联用能逆转高尿酸血症带来的肾脏损害，且对肝脏无明显影响。

通过实施例2验证了樱桃冻干粉联合土茯苓在制备抗痛风药物中的应用效果，采用樱桃冻干粉作为抗痛风药物的活性成分，具备应用价值。