照。
[0041]图 4 为巢式RT-PCR的敏感性试验结果。M:100bpDNALadder:1 :3. 6ng/μLRNA; 2 ：360pg/μLRNA；3 ：36pg/μLRNA；4 ：3. 6pg/μLRNA；5 ：360fg/μLRNA；6 ：36fg/μL RNA;7 :3. 6fg/yL;8 :阴性对照。
[0042] 图5为巢式RT-PCR的临床样品检测结果。M:100bpDNALadder;2、5、11 :H4亚型 禽流感病毒阳性产物；1、3、4、6~10、12~17 :H4亚型禽流感病毒阴性产物。
【具体实施方式】
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]H4N2 亚型禽流感病毒A/duck/Guangxi/12roi7/2012 (H4N2)株：收录于NCBI基因 库登录号为KJ881013或KJ881020。
[0046]H4N5 亚型禽流感病毒A/Duck/HK/668/79(H4N5)株：记载于"Zhixun Xie,Ya〇-shanPang,JiaboLiu,etal.AmultiplexRT-PCRfordetectionoftype AinfluenzavirusanddifferentiationofavianH5,H7,andH9hemagglutinin subtypes[J] ·MolecularandCellularProbes, 2006, 20 (3-4) : 245-249" 一文中，公众可从 广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0047]H4亚型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/027D/09(H4)株：记载于"彭宜，谢芝勋，刘加 波，等.禽流感病毒訂-1^1^检测技术的建立[刀.动物医学进展，2012,33(12) :43 - 46." 一文中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0048]H1N2 亚型禽流感病毒A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012 (H1N2)株：记载于"郭 捷，谢芝勋，彭宜，等.一株鸟源H1N2型禽流感病毒全基因序列分析[J].中国兽医学 报，2014, 34 (6) : 874-820" 一文中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0049]H3N2 亚型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/N42/2009 (H3N2)株：记载于"Peng Yl,XieZ,LiuJ,etal.VisualdetectionofH3subtypeavianinfluenzavirusesby reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationassay.Virology Journal, 2011，8:337" 一文中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0050]H5N2亚型禽流感病毒A/Turkey/GA/209092/02(H5N2)株：记载于"彭宜，谢芝 勋，刘加波，等.H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立[J].南方农业学报， 2013, 02:323-327. " 一文中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0051]H6N2 亚型禽流感病毒A/duck/Guangxi/GXd-3/2009 (H6N2)株：记载于"Peng Y,XieZ,LiuJ，etal.EpidemiologicalSurveillanceofLowPathogenicAvian InfluenzaVirus(LPAIV)fromPoultryinGuangxiProvince,SouthernChina. [J].PL0S 0NE，2013,8(10) :1-6. " 一文中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0052]H7N2亚型禽流感病毒A/Chicken/NY/273874/03 (H7N2)株：记载于"谢芝勋，庞耀 珊，邓显文，等.H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法 的建立[J]. " 一文中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0053]H9N2 亚型禽流感病毒A/turtledove/Guangxi/49B6/2013 (H9N2)株：记载于"Xu Q,XieZX,XieLJ,etal.CharacterizationofanAvianInfluenzaVirusH9N2Strain IsolatedfromaWildBirdinSouthernChina[J].GenomeAnnounc. 2014Jun19 ；2(3). pii:e00600-14.doi:10. 1128/genomeA. 00600-14. "一文中，公众可从广西壮族自治区兽医 研究所获得。
[0054] 新城疫病毒（lasota)、传染性支气管炎病毒（M41)、鸡毒支原体（MGS6)、记载于 "彭宜，谢芝勋，郭捷，等.利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、 N2亚型的分型，病毒学报，2013, 29 (2) : 154-159"一文中，公众可从广西壮族自治区兽医研 究所获得。
[0055] 鸡传染性喉气管炎病毒（AV1231):记载于"XieZ，LuoS，XieL，et al.SimultaneoustypingofnineavianrespiratorypathogensusinganovelGeXP analyzer-basedmultiplexPCRassay[J]·JVirolMethods. 2014 12 ;207C:188-195.，'一 文中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0056]禽呼肠孤病毒鸡毒（S1133):记载于"XieZ,LuoS,XieL,etal·Simultaneous typingofnineavianrespiratorypathogensusinganovelGeXPanalyzer-based multiplexPCRassay[J].JVirolMethods. 2014 12 ;207C:188-195."一文中，公众可从 广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0057]AMV反转录酶、5XAMVBuffer均购自宝生物工程（大连）有限公司，产品目录号为 2621。dNTP为大连宝生物工程有限公司产品，产品目录号：4019。DNA/RNA抽提试剂盒为北 京全式金生物技术有限公司产品，产品目录号为ER201-01。2XTapPCRMix(内含dNTPs、 Mg2+和TapDNA聚合酶）为大连宝生物工程有限公司产品，产品目录号：RR901A。
[0058]实施例1、引物的设计与合成
[0059] 根据H4亚型禽流感病毒的HA基因核苷酸序列的保守区域，应用生物软件Primer Premier5.0设计并筛选了 2对特异性引物，S卩外引物和内引物，见表1。其中，外引物扩增 目的片段为342bp(序列5)，内引物扩增目的片段为199bp(序列5的第54-252位）。引物 由Invitrogen公司合成。
[0060] 表1外引物和内引物序列
[0061]
[0062] 实施例2、巢式RT-PCR鉴定H4亚型禽流感病毒的反应体系的建立
[0063] 1、病毒RNA的抽提与反转录
[0064] 病毒RNA的抽提：参照DNA/RNA抽提试剂盒使用说明书抽提H4N2亚型禽流感病毒 A/duck/Guangxi/12roi7/2012(H4N2)株的RNA。
[0065] 反转录：加入随机引物2. 0μL，70°ClOmin;冰浴5min;加入反转录体系： 10yL5XAMVBuffer、4yLdNTP、0.5yLRNA酶抑制剂、lyLAMV反转录酶，瞬时离 心，42°C放置90min，制备得到cDNA。所有抽提所得的DNA及反转录所得的cDNA置-30°C 保存备用。
[0066] 2、巢式RT-PCR条件的优化
[0067] 两次PCR均为25μL反应体系，其他体系组分不变（2XTap PCRMix12.5μL、模 板2μL)，分别针对引物浓度、反应循环数及退火温度进行优化。
[0068] 第一轮PCR扩增，以步骤1获得的H4N2亚型禽流感病毒A/duck/ Guangxi/12roi7/2012(H4N2)株的cDNA为模板，外引物上、下游引物（序列1和序列2)各 0· 1μL-0. 5μL(各引物溶液浓度均为25.Opmol/μL)范围，循环数15、18、21、25、30共5个 梯度，退火温度50°C-60°C优化反应体系。由于第二轮PCR扩增的模板是第一轮的扩增产 物，最好对第一轮产物进行稀释，避免第一轮的引物残留，影响第二轮扩增，第二轮PCR以 第一轮PCR产物10倍倍比稀释为模板，优化第二轮PCR反应模板浓度，引物（内引物，即序 列3和序列4)浓度、反应循环数及退火温度优化同第一轮。
[0069] 经过对巢式RT-PCR条件的优化，结果显示：
[0070] 最佳的反应体系为：两轮的反应体系都是25yL，2XTapPCRMix12.5yL，2yL 模板，上下游引物各〇. 2μL(各引物溶液浓度均为25.Opmol/μL)，加纯水至25μL。反应 体系中，各引物在PCR反应体系中的终浓度均为0. 2pmol/μL。另外，确定第一轮的产物需 稀释100倍后作为第二轮的模板，这样可以达到了很好的PCR反应效果。
[0071]最佳的第一轮反应程序为：95°C5min;95°C50s、55°C40s、72°Clmin，21 个循环； 72°C延伸 10min，12°C结束。
[0072]最佳的第二轮反应程序为：95°C5min;95°C50s、56°C40s、72°Clmin;21 个循环； 72°C延伸 10min，12°C结束。
[0073] 采用优化后的最佳反应体系及程序进行巢式RT-PCR，将所得每轮的PCR产物进行 1. 5%琼脂糖凝胶电泳。结果显示，第一轮特异性扩增产物大小在342bp，与预期结果相符； 第二轮特异性扩增产物大小在199bp，与预期结果相符（图1)。进一步，将第一轮PCR产物 (342bp目的片段）胶回收后测序，其序列如序列表中序列5所示；将第二轮PCR产物（199bp 目的片段）胶回收后测序，其序列如序列表中序列5的第54-252位所示。
[0074] 实施例3、巢式RT-PCR的特异性实验
[0075]1、病