一种用于区分萝卜品种的rapd引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用RAPD分子标记技术快速区分 萝卜品种的方法。
【背景技术】
[0002] 萝卜为起源于中国的一种世界性蔬菜，其栽培历史悠久，品种资源及其丰富，2006 年以来全国年播种面积超过1200千公顷，位于所有蔬菜作物的前3位，在蔬菜生产与供应中 占有重要地位。近些年来，随着我国萝卜产量及栽培面积的大幅度扩展，越来越多的优良品 种应用于萝卜生产中。因此，建立萝卜品种快速可靠的鉴定技术体系对于萝卜品种遗传资源的 研究保护、苗期鉴定、品种区分乃至萝卜产业的持续发展等具有重要的意义。
[0003] DNA分子标记是随着分子克隆和重组DNA等生物技术迅速发展而产生的一类遗传 标记，由于其直接建立在分子水平上，而不受外界环境、作物发育阶段、取样部位等因素影 响，其检出的多态性位点是无限的，故鉴定结果具有高度的可靠性，且重复性高，鉴别力强。
[0004] 由于目前传统单一的形态学品种鉴定方法已无法满足有效鉴别或区分当今日益 增多的品种的要求。分子标记的应用给作物遗传育种研究带来了巨大变化，同时也应用到 了品种鉴定的研究中。在常用的RAro、ISSR、SRAP和AFLP等众多分子标记技术中，随机扩增 多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNAJAFO)基于PCR技术，是应用较早的分子 标记技术之一，它以分析程序简便快捷，周期性短，不易受外界环境影响，所需费用低，且无 需对基因组序列进行预知等优点，已被普遍应用于指纹图谱构建、种质资源的遗传基础研 究、基因的快速定位、基因连锁标记、遗传多样性分析，品种分类研究等方面。
[0005] 现有的利用RAro技术在进行蔬菜作物品种区分与种质鉴定的研究工作中，多采用 计算机软件绘制数字化指纹图谱并结合统计学软件聚类分析得出聚类树，但是此聚类分析 结果不但无法直观显示出区分品种的引物，无法显示鉴别过程，其操作量大，缺乏实用性。
【发明内容】
[0006] 本发明需要解决的技术问题是:提供一种利用RAro技术区分萝卜品种的引物。
[0007] 本发明还要解决的技术问题是:提供利用上述引物区分萝卜品种的应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0009] -种用于区分萝卜品种的RAPD引物包括如下引物序列：
[0010] RP13:5 '-TATGTCTACTC-3 '；
[0011] RP102:5 '-CTAGGATTATT-3 '；
[0012] RP55:5 '-TATTATTGGCT-3 '；
[0013] RP271:5 '-ACGGTGCGGCG-3 '。
[0014]上述用于区分萝卜品种的RAPD引物在区分萝卜品种中的应用在本发明的保护范围 之内。
[0015] 利用上述RP13、RP102、RP55与RP271引物区分萝卜品种的RAPD方法，包括如下步骤：
[0016] (1)提取萝卜叶片基因组DNA;
[0017] (2)利用RP13引物对步骤（1)得到的基因组DNA进行RAPD扩增，得到的PCR产物用琼 脂糖凝胶电泳检测，若在1800bp、1200bp处都出现特征性谱带，而在750bp无特征性谱带，萝 卜的品种为"满身红"；若在1800bp、1200bp、750bp处都出现特征性谱带，萝卜品种为"秋田扬 花"；
[0018] (3)若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用RP102引物再对基因组DNA 进行RAro扩增，
[0019] 若利用RP13引物扩增时，在1200bp处出现特征性谱带，而在1800bp、750bp处未出 现特征性谱带，RP102引物扩增后使用如下方法判断萝卜品种:若在lOOObp未出现特征性谱 带的，其品种为"秋田大红袍"；若在l〇〇〇bp、150bp都出现特征性谱带，而在400bp处未出现 特征性谱带，其品种为"秋田满堂红"；若在1 〇〇〇bp、400bp、150bp处都出现特征性谱带，其品 种为"南韩大根"；若在l〇〇〇bp、400bp都出现特征性谱带，而在150bp未出现特征谱带，则进 入步骤(4);若在400bp、150bp均未出现特征性谱带，而在lOOObp出现特征谱带，贝lj进入步骤 (5)；
[0020] 若利用RP13引物扩增时，若在1800bp处出现特征性谱带，而在1200bp、750bp处未 出现特征性谱带，利用引物RP102扩增后使用如下方法判断萝卜品种:经琼脂糖凝胶电泳检 测在600bp、250bp均出现特征性谱带，其品种为"西南红帅"；若在600bp出现特征性谱带，而 250bp未出现特征性谱带，则进入步骤(6);
[0021] 若利用RP13引物扩增时，在1200bp、750bp处出现特征性谱带，而在1800bp处未出 现特征性谱带，利用引物RP102扩增后使用如下方法判断萝卜品种:经琼脂糖凝胶电泳检测 在100bp处出现特征性谱带，而在1800bp、400bp处未初现特征谱带的为品种"青皮甜帅"；若 在1800bp处出现特征性谱带，而在400bp、100bp处未初现特征谱带的为品种"翘头青"；若在 1800bp、400bp均出现特征谱带，而在100bp未出现特征谱带，贝lj进入步骤(7);
[0022] (4)利用RP102引物进行RAPD扩增，若在1000bp、400bp都出现特征性谱带，而在 150bp未出现特征谱带，RP55引物扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0023] 若在lOOObp出现特征性谱带的，其品种为"短叶十三"；若在250bp出现特征性谱带 的，其品种为"银魅"；若在3000bp、500bp均出现特征性谱带的，其品种为"中秋红"；
[0024] (5)利用RP102引物进行RAH)扩增，若在400bp、150bp均未出现特征性谱带，而在 lOOObp出现特征谱带，RP55引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0025] 若在lOOObp与200bp处均出现特征性谱带的，其品种为"穿心红"；在200bp未出现 特征性谱带，其品种为"白玉春"；若在lOOObp处未出现特征谱带，而在200bp处出现特征性 谱带，则进入步骤(8);
[0026] (6)利用RP102引物进行RAH)扩增，若在600bp出现特征性谱带，而250bp未出现特 征性谱带，再用RP55引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0027] 若在1200bp出现特征性谱带的，其品种为"绵阳红"；在1200bp未出现特征性谱带， 其品种为"扬州圆白"；
[0028] (7)利用RP102引物进行RATO扩增，若在1800bp、400bp均出现特征谱带，而在100bp 未出现特征谱带，RP55引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0029] 若在lOOObp和400bp均出现特征性谱带的，其品种为"霸王青"；在1200bp出现特征 性谱带，其品种为"丰秋青王"；在250bp出现特征性谱带的品种为"韩玉春"；
[0030] (8)利用RP55引物进行RAro扩增，若在lOOObp处未出现特征谱带，而在200bp处出 现特征性谱带，RP271引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0031 ] 若在400bp出现特征性谱带的为品种"七叶圆红"；若在400bp未出现特征谱带的为 品种"浙大长"。
[0032]其中，步骤(1)提取萝卜叶片基因组DNA的方法如下：
[0033] 取萝卜幼嫩叶片0.2g，经液氮研磨，加入500μ1CTAB裂解液，转入1.5ml离心管中， 65°C水浴0.5~lh后取出冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合物后轻轻摇晃，12000r/min， 离心8~lOmin，上清液用氯仿/异戊醇混合物抽提1~2次，加入预冷异丙醇，在4°C条件下静 置3小时以上，收集絮状DNA用体积分数为70 %的乙醇洗涤，干燥后将絮状DNA溶于TE缓冲液 中保存；
[0034] 其中，所述的CTAB裂解液的组成如下：体积分数为2%CTAB，2mol/LNaCl2,20m mol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl，PH=8.0，体积分数为0.2%β-巯基乙醇;所述的氯仿/异 戊醇混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0035] 其中，所述的RAPD扩增，其PCR反应体系为20μ1，其中含50ng基因组DNA，MgCl22.0mmol·L-SdNTPs0.15mmol·L-S引物0·44μπιο1 ·L-STaqDNA聚合酶0.75U。
[0036] 其中，所述的RAPD扩增，其PCR反应条件为：94°C预变性2min; 94°C变性30S，退火 45S，72°C延伸90S，42个循环；72°C延伸10min，后于4°C保存；其中RP13引物的退火温度为 43.5°C，RP102的退火温度为42.3°C，RP55的退火温度为39.4°C，RP271的退火温度为41.6 V。
[0037] 在PCR扩增仪上进行扩增，扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染 色，紫外投射仪观察拍照得到扩增谱带。
[0038]本发明通过4个引物就能区分出20个不同萝卜品种，为了清晰、完整地表示鉴别采 用的引物和鉴别出的品种，同时为了方便他人对萝卜品种进行区分、鉴定，本发明还人工绘 制了 "树型植物品种鉴定图"。通过树形图表示各个品种区分的过程及相应品种，通过标记 引物名称和谱带的有无表示品种的鉴定方法和判断依据。本发明