与现有技术不同的是未采 用"0-1"矩阵构建指纹图谱并进行聚类分析，通过对比谱带进行筛选，建立直观的鉴定图 谱。
[0039] 有益效果:本发明的一种利用RAH)技术快速区分萝卜品种的方法，本发明方法操作 简便，快速准确，4次PCR就能够将20个萝卜品种在分子水平上区分开，所得的品种鉴定图比 聚类树更具直观性，即根据品种鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物，该方法可 以实现萝卜种苗的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。
【附图说明】
[0040] 图1是利用4个引物对20个萝卜品种进行区分鉴定的树型鉴别图；
[0041 ]图2是利用引物RP13在20个萝卜品种上的RAPD扩增图，数字与图11对应，Μ表示DNA marker；
[0042]图3是利用引物RP102对A组品种的DNA进行RAH)扩增得到的扩增图，横列是特征谱 带，纵列的数字与图11对应，Μ表示DNAmarker;
[0043] 图4是利用引物RP102对B组品种的DNA进行RAH)扩增得到的扩增图，横列是特征谱 带，纵列的数字与图11对应，Μ表示DNAmarker;
[0044] 图5是利用引物RP102对C组品种的DNA进行RAH)扩增得到的扩增图，横列是特征谱 带，纵列的数字与图11对应，Μ表示DNAmarker;
[0045] 图6是利用引物RP55对3、9、19三个品种的DNA进行RAH)扩增得到的扩增图，横列是 特征谱带，纵列的数字与图11对应，Μ表示DNAmarker;
[0046] 图7是利用引物RP55对7、13、14、20四个品种的DNA进行RAPD扩增得到的扩增图，横 列是特征谱带，纵列的数字与图11对应，Μ表示DNAmarker;
[0047] 图8是利用引物RP55验证区分8、11两个品种的扩增产物电泳图，横列是特征谱带， 纵列的数字与图11对应，Μ表示DNAmarker;
[0048] 图9是利用引物RP55验证区分2、10、17三个品种的扩增产物电泳图，横列是特征谱 带，纵列的数字与图11对应，Μ表示DNAmarker;
[0049] 图10是利用引物RP271验证区分13、14三个品种的扩增产物电泳图，横列是特征谱 带，纵列的数字与图11对应，Μ表示DNAmarker;
[0050] 图11是本发明20个萝卜品种的编号和品种名称。
【具体实施方式】
[0051] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0052] 实施例1:DNA的提取。
[0053]本发明的萝卜品种样品均是市面常见的重要萝卜品种，这20个品种包括:满身红，霸 王青，短叶十三，秋田扬花，秋田大红袍，秋田满堂红，穿心红，绵阳红，银魅，丰秋青王，扬州 圆白，青皮甜帅，七叶圆红，浙大长，翘头青，南韩大根，韩玉春，西南红帅，中秋红，白玉春。 [0054] 以萝卜幼嫩叶片为材料约0.2g，经液氮研磨，加入500μ1CTAB裂解液（2%CTAB， 2MNaCl2，20mMEDTA，1OOmMTris-HCl(PH= 8 · 0)与0 · 2 % 的β-巯基乙醇），转入 1 · 5ml离心管 中，65°C水浴0.5~lh后取出冷却，加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)混合物后轻轻摇晃，将乳 状物离心12000r/min，8~lOmin，上清液用氯仿/异戊醇（24:1)抽提1~2次，加入预冷异丙 醇4°C冰箱静置3小时以上，收集絮状DNA用70%乙醇洗涤，干燥后溶于TE缓冲液中保存备 用。为了方便在扩增图谱中标记出来，对每个萝卜品种进行了编号，参考说明书附图中的图 9〇
[0055] 实施例2:RAPD_PCR反应体系与条件。
[0056] RAPD-PCR反应体系为20μ1，含50ng基因组DNA，2.0mmol·L-WgChA.lSmmol·L- ΜΝΤΡ8,0·44μπιο1 .L-HOmer引物，0.75UTaqDNA聚合酶。
[0057]RATO-PCR扩增程序为94°C预变性2min，94°C变性30S，退火45S，72°C延伸90S，42个 循环，72°C延伸lOmin，后于4°C保存。在PCR扩增仪上进行扩增，扩增产物采用琼脂糖凝胶电 泳(含有1.2 %溴化乙锭），1XTAE电泳缓冲液（1L中含有：0.242gTris，0.057ml冰醋酸， 0.2ml0.25mol/LEDTApH8.0)。扩增后的DNA样品加入4μ1 6X上样缓冲液(含0.25%溴 酚蓝、30%蔗糖），在120V恒压下进行电泳0.5~0.8小时，使扩增的DNA条带清晰明显分离为 止，后紫外投射仪观察拍照得到扩增谱带。
[0058] 实施例3:特异引物的严格筛选。
[0059] 本发明的4个引物是在原先设计的52个随机引物经过严格筛选而得。先针对现有 的萝卜品种的基因组设计52个随机引物，从中选取出11个碱基的多态性好、扩增性强、稳定 性高的RAH)随机引物，后通过连续两次梯度PCR选择条带一致的温度作为退火温度。详细的 说，梯度PCR反应体系为20μ1，含50ng基因组DNA，2.0mmol·L-^gChj.lSmmol·L-MNTPs， 0.44μπιο1 .L-HOmer引物，0.75UTaqDNA聚合酶。反应于94°C预变性2min，94°C变性30S，退 火45S，72°C延伸90S，42个循环，72°C延伸lOmin。本发明所述随机引物序列和退火温度如 下：
[0060] RP13:5'-TATGTCTACTC-3'，退火温度43.5°C;
[0061 ] RP102:5 ' -CTAGGATTATT-3 '，退火温度42 · 3°C;
[0062] RP55:5' -TATTATTGGCT-3'，退火温度39 · 4°C。
[0063] RP271:5 ' -ACGGTGCGGCG-3 '，退火温度41 · 6°C。
[0064] 实施例4:萝卜品种的快速区分。
[0065] 选用DNA多态性谱带在不同品种中的有无将萝卜品种进行区分，直到所有待鉴别的 品种被单独分开为止。
[0066] 通过"树型鉴别图"以更好的方便品种鉴定、统计工作。"树型鉴别图"是基于PCR扩 增后的谱带形态统计出的结果，树型鉴别图以引物作为节点，节点后是该引物对不同品种 的区分结果，包括区分出的类别或者直接区分出来的品种，在节点后的分支还标记了不同 结果相互区分的依据，即谱带之间的区别。利用1^13、1^102、1^55、1^271三个引物对20个不 同萝卜品种进行RAH)扩增，即可绘制出完整的树型鉴别图（如图1所示），具体区分步骤如下： [0067] (1)提取萝卜的基因组DNA;
[0068] (2)利用RP13引物对步骤（1)得到的基因组DNA进行RAPD扩增，得到的PCR产物用琼 脂糖凝胶电泳检测，若在1800bp、1200bp处都出现特征性谱带，而在750bp无特征性谱带，萝 卜的品种为"满身红"；若在1800bp、1200bp、750bp处都出现特征性谱带，萝卜品种为"秋田扬 花"（图2);
[0069] (3)若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用RP102引物再对基因组DNA 进行RAro扩增，
[0070] 若利用RP13引物扩增时，在1200bp处出现特征性谱带，而在1800bp、750bp处未出 现特征性谱带，RP102引物扩增后使用如下方法判断萝卜品种:若在lOOObp未出现特征性谱 带的，其品种为"秋田大红袍"；若在l〇〇〇bp、150bp都出现特征性谱带，而在400bp处未出现 特征性谱带，其品种为"秋田满堂红"；若在1 〇〇〇bp、400bp、150bp处都出现特征性谱带，其品 种为"南韩大根"；若在l〇〇〇bp、400bp都出现特征性谱带，而在150bp未出现特征谱带，则进 入步骤(4);若在400bp、150bp均未出现特征性谱带，而在lOOObp出现特征谱带，贝lj进入步骤 (5)，见图3;
[0071] 若利用RP13引物扩增时，若在1800bp处出现特征性谱带，而在1200bp、750bp处未 出现特征性谱带，利用引物RP102扩增后使用如下方法判断萝卜品种:经琼脂糖凝胶电泳检 测在600bp、250bp均出现特征性谱带，其品种为"西南红帅"；若在600bp出现特征性谱带，而 250bp未出现特征性谱带，则进入步骤(6)，见图4;
[0072] 若利用RP13引物扩增时，在1200bp、750bp处出现特征性谱带，而在1800bp处未出 现特征性谱带，利用引物RP102扩增后使用如下方法判断萝卜品种:经琼脂糖凝胶电泳检测 在100bp处出现特征性谱带，而在1800bp、400bp处未初现特征谱带的为品种"青皮甜帅"；若 在1800bp处出现特征性谱带，而在400bp、100bp处未初现特征谱带的为品种"翘头青"；若在 1800bp、400bp均出现特征谱带，而在1OObp未出现特征谱带，则进入步骤(7)，见图5;
[0073] (4)利用RP102引物进行RAPD扩增，若在1000bp、400bp都出现特征性谱带，而在 150bp未出现特征谱带，RP55引物扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0074] 若在1000bp出现特征性谱带的，其品种为"短叶十三"；若在250bp出现特征性谱带 的，其品种为"银魅"；若在3000bp、500bp均出现特征性谱带的，其品种为"中秋红"，见图6; [0075] (5)利用RP102引物进行RAH)扩增，若在400bp、150b