p均未出现特征性谱带，而在 1000bp出现特征谱带，RP55引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0076] 若在1000bp与200bp处均出现特征性谱带的，其品种为"穿心红"；在200bp未出现 特征性谱带，其品种为"白玉春"；若在l〇〇〇bp处未出现特征谱带，而在200bp处出现特征性 谱带，则进入步骤(8)，见图7;
[0077] (6)利用RP102引物进行RAH)扩增，若在600bp出现特征性谱带，而250bp未出现特 征性谱带，再用RP55引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0078] 若在1200bp出现特征性谱带的，其品种为"绵阳红"；在1200bp未出现特征性谱带， 其品种为"扬州圆白"，见图8;
[0079] (7)利用RP102引物进行RATO扩增，若在1800bp、400bp均出现特征谱带，而在100bp 未出现特征谱带，RP55引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0080] 若在1000bp和400bp均出现特征性谱带的，其品种为"霸王青"；在1200bp出现特征 性谱带，其品种为"丰秋青王"；在250bp出现特征性谱带的品种为"韩玉春"，见图9;
[0081 ] (8)利用RP55引物进行RAro扩增，若在1000bp处未出现特征谱带，而在200bp处出 现特征性谱带，RP271引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种：
[0082] 若在400bp出现特征性谱带的为品种"七叶圆红"；若在400bp未出现特征谱带的为 品种"浙大长"，见图10。
[0083]综上所述，但凡涉及上述20个品种中任意品种或者其组合的萝卜品种，按照上述步 骤即可完成品种鉴别和区分。
[0084]利用本发明的方法统计出的"树型鉴别图"不仅可完成对未知品种的鉴定，还可查 询出鉴定不同品种所需要的引物和鉴别依据。下面请参考图1，可以看出，当需要查询任意 萝卜品种的鉴别方法和所需引物时，只需要在树型鉴别图分支末端找到对应品种编号，向前 回溯即可。例如，需要查询区分品种'青皮甜帅''七叶圆红'，根据本发明的方法，通过引物 RP102即可将在100bp有特征性谱带的'青皮甜帅'区分出来，而利用引物RP271进行扩增，在 400bp出现特征性谱带的为品种'七叶圆红'。
【主权项】
1. 一种用于区分萝卜品种的RAPD引物，其特征在于，包括如下引物： RP13:5 '-TATGTCTACTC-3 '； RP102:5 '-CTAGGATTATT-3 '； RP55:5 '-TATTATTGGCT-3 '； RP271:5'-ACGGTGCGGCG-3'。2. 权利要求1所述的用于区分萝卜品种的RAPD引物在区分萝卜品种中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特证在于，包括如下步骤： (1) 提取萝卜叶片基因组DNA; (2) 利用RP13引物对步骤（1)得到的基因组DNA进行RAH)扩增，得到的PCR产物用琼脂糖 凝胶电泳检测，若在1800bp、1200bp处都出现特征性谱带，而在750bp无特征性谱带，萝卜的 品种为"满身红"；若在1800bp、1200bp、750bp处都出现特征性谱带，萝卜品种为"秋田扬花"； (3) 若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用RP102引物再对基因组DNA进行 RATO扩增， 若利用RP13引物扩增时，在1200bp处出现特征性谱带，而在1800bp、750bp处未出现特 征性谱带，RP102引物扩增后使用如下方法判断萝卜品种:若在lOOObp未出现特征性谱带的， 其品种为"秋田大红袍"；若在l〇〇〇bp、150bp都出现特征性谱带，而在400bp处未出现特征性 谱带，其品种为"秋田满堂红"；若在1OOObp、400bp、150bp处都出现特征性谱带，其品种为 "南韩大根"；若在lOOObp、400bp都出现特征性谱带，而在150bp未出现特征谱带，则进入步 骤(4);若在400bp、150bp均未出现特征性谱带，而在lOOObp出现特征谱带，贝丨彳进入步骤(5); 若利用RP13引物扩增时，若在1800bp处出现特征性谱带，而在1200bp、750bp处未出现 特征性谱带，利用引物RP102扩增后使用如下方法判断萝卜品种:经琼脂糖凝胶电泳检测在 600bp、250bp均出现特征性谱带，其品种为"西南红帅"；若在600bp出现特征性谱带，而 250bp未出现特征性谱带，则进入步骤(6); 若利用RP13引物扩增时，在1200bp、750bp处出现特征性谱带，而在1800bp处未出现特 征性谱带，利用引物RP102扩增后使用如下方法判断萝卜品种：经琼脂糖凝胶电泳检测在 lOObp处出现特征性谱带，而在1800bp、400bp处未初现特征谱带的为品种"青皮甜帅"；若在 1800bp处出现特征性谱带，而在400bp、lOObp处未初现特征谱带的为品种"翘头青"；若在 1800bp、400bp均出现特征谱带，而在lOObp未出现特征谱带，贝lj进入步骤(7); (4) 利用RP102引物进行RAH)扩增，若在1000bp、400bp都出现特征性谱带，而在150bp未 出现特征谱带，RP55引物扩增后使用如下方法判断萝卜品种： 若在lOOObp出现特征性谱带的，其品种为"短叶十三"；若在250bp出现特征性谱带的， 其品种为"银魅"；若在3000bp、500bp均出现特征性谱带的，其品种为"中秋红"； (5) 利用RP102引物进行RAPD扩增，若在400bp、150bp均未出现特征性谱带，而在lOOObp 出现特征谱带，RP55引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种： 若在lOOObp与200bp处均出现特征性谱带的，其品种为"穿心红"；在200bp未出现特征 性谱带，其品种为"白玉春"；若在lOOObp处未出现特征谱带，而在200bp处出现特征性谱带， 则进入步骤(8); (6) 利用RP102引物进行RAPD扩增，若在600bp出现特征性谱带，而250bp未出现特征性 谱带，再用RP55引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种： 若在1200bp出现特征性谱带的，其品种为"绵阳红"；在1200bp未出现特征性谱带，其品 种为"扬州圆白"； (7)利用RP102引物进行RAPD扩增，若在1800bp、400bp均出现特征谱带，而在lOObp未出 现特征谱带，RP55引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种： 若在lOOObp和400bp均出现特征性谱带的，其品种为"霸王青"；在1200bp出现特征性谱 带，其品种为"丰秋青王"；在250bp出现特征性谱带的品种为"韩玉春"； (8) 利用RP55引物进行RAPD扩增，若在lOOObp处未出现特征谱带，而在200bp处出现特 征性谱带，RP271引物进行RAH)扩增后使用如下方法判断萝卜品种： 若在400bp出现特征性谱带的为品种"七叶圆红"；若在400bp未出现特征谱带的为品种 "浙大长"。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1)提取萝卜叶片基因组DNA的方法如 下： 取萝卜幼嫩叶片0.2g，经液氮研磨，加入500μ1CTAB裂解液，转入1.5ml离心管中，65°C水浴0.5~lh后取出冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合物后轻轻摇晃，12000r/min，离心 8~lOmin，上清液用氯仿/异戊醇混合物抽提1~2次，加入预冷异丙醇，在4°C条件下静置3 小时以上，收集絮状DNA用体积分数为70%的乙醇洗涤，干燥后将絮状DNA溶于TE缓冲液中 保存； 其中，所述的CTAB裂解液的组成如下：体积分数为2%CTAB，2mol/LNaCl2,，20mmol/L EDTA，100mmol/LTris-HCl，PH=8.0，体积分数为0.2巯基乙醇;所述的氯仿/异戊醇混 合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)~(5)所述的RAPD扩增，其PCR反应 体系为20μ1，其中含基因组DNA 50ng，MgCl22.0mmol/L，dNTPs 0.15mmol/L，引物0·44μπιο1/ L，Taq DNA聚合酶0.75U。6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)~(5)所述的RAPD扩增，其PCR反应 条件为:94°C预变性2min; 94°C变性30S，退火45S，72°C延伸90S，42个循环;72°C延伸lOmin， 后于4°C保存； 其中，RP13引物的退火温度为43.5°C，RP102的退火温度为42.3°C，RP55的退火温度为 39.4°C，RP271 的退火温度为 41.6°C。
【专利摘要】本发明公开了一种用于区分萝卜品种的RAPD引物及其应用，属于分子生物学分子标记领域。该方法通过设计筛选出的4个RAPD随机引物，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1～3所示，用于扩增未知萝卜品种的DNA，通过统计凝胶电泳后的谱带，区分出具有唯一特异性谱带的品种，并建立被区分品种的树形鉴别图。本发明的引物提高了RAPD反应的稳定性，操作简便，高效准确，节省引物，仅通过4次PCR就可轻松的将“满身红”等20个萝卜品种在分子水平上进行快速区分，所得到的品种鉴定图比聚类树更具有直观性，即根据品种鉴定图就可以快速找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现萝卜种苗早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105463120
【申请号】CN201610044603
【发明人】许园园, 苏小俊, 娄丽娜
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月22日