雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及雌根结线虫基因表达检测技术，具体涉及一种雌根结线虫食道腺基因 原位杂交技术及其应用。
【背景技术】
[0002] 原位杂交组织化学技术(简称原位杂交Insituhybridization，ISH)是利用带有 标记物的核酸(DNA或RNA)探针检测组织或细胞内待测核酸的表达和分布情况，已知序列的 探针和组织或细胞内的待测核酸通过碱基互补配对结合，探针上带有的特定标记物，可以 和相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学的方法在待测核酸的原位形成有色的杂 交信号；尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，是分析低丰度和罕见的 mRNA表达的重要技术，已成为最有效的分子病理学技术。
[0003] 根结线虫(Meloidogyne spp.)可以寄生2000多种植物，给农作物生产带来严重损 失;根结线虫生活史在25约28天;包括卵、一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫和和成 虫阶段;其中二龄幼虫呈线形，雌成虫膨大呈球形或柠檬形（图1);雌根结线虫虫体体积最 大，在寄主体内存活时间较长。
[0004]根结线虫在一个生长季节可以繁殖3-4代，每代的繁殖量很大，平均每条雌虫可产 生300-500个卵，雌根结线虫能够成功产卵，是造成作物连作基地根结线虫虫口密度不断上 升的关键因素;但由于雌根结线虫在植物体内，常规的防治技术难对其进行防治;近年来发 展起来的基因沉默技术以及转基因技术，可望创制出抗根结线虫病植物材料。
[0005]运用原位杂交技术对根结线虫中基因表达部位的研究已经有多篇报导，多种食道 腺分泌蛋白已成功在南方根结线虫二龄幼虫上进行定位;但是所有报道均是对呈线状虫体 的根结线虫二龄幼虫原位杂交技术。未见呈球形的雌根结线虫原位杂交技术。
[0006]鉴于雌根结线虫在寄主体内存活时间较长（15-18天），对其寄主巨型细胞的调控 中起到重要作用，因此建立针对雌根结线虫的食道腺基因的原位杂交技术具有重要的科学 意义和实践意义。
【发明内容】
[0007]针对上述现有技术中存在的问题，本发明的首要目的是提供一种雌根结线虫食道 腺基因原位杂交技术。本发明人通过查阅已经发表的基因原位杂交文献，针对雌根结线虫 虫体易破裂的特点，设计并筛选出防止雌根结线虫虫体破裂的系列技术，从而成功建立了 雌根结线虫食道腺基因的原位杂交技术。
[0008]本发明的另一目的在于提供上述雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术的应用。
[0009]本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：一种雌根结线虫食道腺基因原位 杂交技术，包括如下步骤：
[0010] (1)收集活体南方根结线虫雌成虫，4°C2%多聚甲醛溶液浸泡86h，然后22°C4h;
[0011] (2)将浸泡的线虫去上清，加400yL0.1X固定液重悬浮线虫，吸置DEPC处理过的 载玻片，用针灸针把成虫的前体部扎1-2个小孔(避免把虫体弄破），然后将雌根结线虫虫体 收集到灭菌处理后的96孔板中；
[0012] (3)将收集的线虫用0.1XM9缓冲液漂洗2次，每次lmin;
[0013] ⑷裂解缓冲液22°c处理22min;去上清；
[0014] (5)0.1XM9缓冲液漂洗2次，每次lmin;
[0015] (6)去上清，-78°C的干冰中处理20min;
[0016] (7)-20°C甲醇处理lmin，去上清；
[0017] (8)_20°C丙酮处理lmin，去上清；
[0018] (9)加入20 %的丙酮，22°C水浴20min，去上清；
[0019] (10)预杂交:加入250yL55°C预热的杂交液，45°C轻摇lh;
[0020] (11)探针变性:探针在沸水中变性lOmin，并迅速置于冰水中2 5min，获得变性的 探针；
[0021 ] (12)将变性的探针加入到250yL55°C预热杂交液中，混匀，获得终浓度为50ngAiL 的混有探针的杂交液；
[0022] (13)将预杂交后的线虫去除预杂交液，加入混有探针的杂交液，避光45°C杂交 18h；
[0023] (14)步骤（13)杂交完成后，倒去杂交液，在45°C、4XSSC缓冲液中洗15min，去上 清，重复3次；
[0024] (15)线虫于37°CNTE缓冲液中洗lOmin，去上清；
[0025] (16)加入RNAseA消化未杂交探针，37°C处理lh;
[0026] (17)线虫于45°C，0.1XSSC缓冲液，0.1 %SDS中洗20min，去上清，重复3次；
[0027] (18)在22°C马来酸缓冲液中浸泡5min去上清；
[0028] (19)加入新鲜配制的0.1X封闭液22°C保温30min;去上清；
[0029] (20)新鲜配制的0.5mL抗体溶液22°C反应2h，去上清；
[0030] (21)在洗涤缓冲液中浸泡15min去上清，重复3次；
[0031 ] (22)检测缓冲液中平衡5min;去上清；
[0032] (23)加入250yL新鲜配制的显色液试剂，4°C放置暗处，不要动摇;显色16h;
[0033] (24)去上清，M9缓冲液漂洗2次，每次lmin，停止显色，实现雌根结线虫食道腺基因 原位杂交。
[0034]在上述步骤（1)中，为了改进雌根结线虫内部结构固定效果，本发明对固定时间进 行了优化，固定时间为：1811，3611，4811，60,8611。实验结果表明，在雌根结线虫固定8611时，固 定效果最好，因此本发明优选86h作为雌根结线虫原位杂交的固定时间。
[0035] 在上述步骤(2)中，由于雌根结线虫虫体较大，容易破裂，本发明将雌根结线虫用 针灸针把成虫的前体部扎个小孔(避免把虫体弄破），然后收集到灭菌处理后的96孔板中； [0036] 步骤(2)中所述的0.1X固定液为0.1XM9缓冲液中加入0.2 % (W/V)的多聚甲醛；
[0037] 步骤(3)中所述的0.1XM9缓冲液由10XM9缓冲液稀释而成，所述的10XM9缓冲液 的配制方法为：称取30.24gNa2HP〇4· 12H20,6.0gKH2P〇4，10gNaCl，0.5gMgS〇4.7H20,用 蒸馏水定容至200mL，高压灭菌。
[0038]步骤(4)中所述的裂解缓冲液为含0.5mg/mL蛋白激酶K的M9缓冲液。
[0039]步骤(10)中所述的杂交液购自北京鼎国生物技术有限责任公司。
[0040]步骤（11)中所述的探针为根结线虫食道腺基因的原位杂交RNA探针;所述的根结 线虫食道腺基因的原位杂交RNA探针优选为MiPDCD6基因的原位杂交RNA探针；所述的 MiH)⑶6基因的原位杂交RNA探针由引物In-PD-T7F和引物In-PD-R扩增获得;其引物序列如 下：
[0041]In-PD-T7F：TAATACGACTCACTATAGGGGACCAAGACAAATCTGGAAAG；
[0042]In-PD-R：GTTGTAGAAACGGTCAGAAAG〇
[0043]步骤（16)中所述的RNAse A为由ΝΤΕbuffer稀释成60yg/mL的RNAseA。
[0044] 步骤（18)中所述的马来酸缓冲液的配制方法为：称取11.067g马来酸和8.766g NaCl溶于800mL蒸馏水中，用固体NaOH调pH至7.5，用蒸馏水定容至1L，分装后高压灭菌。 [0045]步骤（19)中所述的0.1X封闭液由10X封闭液配制而成，所述的10X封闭液购自 广州聚研生物科技有限公司。
[0046]步骤(20)中所述的抗体溶液的配制方法如下:Anti-Digoxigenin_APlOOOOrpm离 心5min吸取上层0.4yL加入2mL封闭液;所述的Anti-Digoxigenin-AP购自广州聚研生物科 技有限公司。
[0047]步骤（21)中所述的洗涤缓冲液的配制方法如下：马来稀酸缓冲液灭菌后加入 0·3%(ν/ν)吐温 20。
[0048]步骤(22)中所述的检测缓冲液的配制方法如下：将1.1688g NaCl溶于100mL蒸馏 水中，加20mL 1M Tris-HCl(pH 8.0)，用NaOH调pH至9.5,蒸馏水定容至200mL，高压灭菌，室 温保存。
[0049]步骤（23)中所述的显色液的配制方法如下：将NBT/BCIP按1 :50用Detection Buffer稀释，避光保存；其中NBT(50mg/mL)的配置方法为：100mgNBT加入2mL70%二甲基 甲酰胺溶液溶解;BCIP(50mg/mL)的配置方法为：100mgBCIP加入2mL灭菌水溶解。
[0050]为防止雌根结线虫虫体破裂，在上述步骤(3)、（4)、（5)、（6)、（7)、（8)、（9)、（11)、 (12)、（13)、（14)、（15)、（16)、（17)、（18)、（19)、（20)、（21)、（22)、（24)中均不需要离心，直 接去上清液。
[0051]原位杂交技术中一个重要的步骤是对虫体内部结构的固定；由于雌根结线虫虫体 较大，用常规的固定线形线虫的技术不能成功固定雌根结线虫内部结构，因此本发明就建 立了雌根结线虫的固定技术;优选的固定技术参数如下:将收集的南方根结线虫雌成虫在 2 %多聚甲醛溶液4°C固定86h。
[0052]原位杂交技术中另一个重要步骤是把固定好的线虫切割成2-5段，以方便探针的 进入，线状虫体切割并不难，但是由于雌根结线虫是球形的，切割容易造成虫体的破裂变 形，本发明采用针灸针在雌根结线虫成虫的前体部轻轻地扎1-2个小孔，避免了虫体的破 裂。
[0053]原位杂交技术中另一个重要步骤是反复冲洗和离心，这样极易导致雌根结线虫虫 体破裂;本发明将原位杂交的整个过程在灭菌的96孔板中进行，冲洗后，不需离心，弃上清 液，试剂的使用量降低为250yL，杂交温度为45°C。
[0054]经过上述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术后，显色后在显微镜下观察发 现，目的基因在利用反向探针杂交时，在雌根结线虫的食道腺上有明显的杂交信号，而正向 探针没有杂交信号。
[0055]上述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术应用于检测目的基因在雌根结线虫 食道腺中的表达部位。
[0056]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0057] 1、雌成虫体积比二龄幼虫大，改变固定时间使其固定更彻底，后面的杂交步骤虫 体不容易破裂；
[0058]2、雌成虫呈球状切割容易造成内含物流出变形，所以改用针灸针在虫体扎孔能避 免虫子变形，而且发现在虫体前部扎孔不会造成虫体破裂；
[0059]3、改用96孔板实验可以减少虫体挪动，避免了离心管中因大量虫子聚集挤压造成 的变形，而且雌虫体积较大，较重，不需要离心即能沉到底部，省去离心的步骤，能更好的维 持虫体不变形；由于96孔板每个孔的体积限制，试剂用量减少为250yL;
[0060]4、通过技术创新，在南方根结线虫雌成虫食道腺中实现了基因的原位杂交。
【附图说明】
[0061]图1南方根结线虫雌成虫MiroCD6基因在食道腺原位杂交效果图；a:反义探针杂交 结果;b:正义探针杂交结果;M:中食道球;G:食道腺。
【具体实施方式】
[0062]下面结合具体实施例对本发明作进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。
[0063] 实施例1本发明技术检测Miro⑶6基因在雌根结线虫食道腺中的表达部位；
[0064] 1.试剂购买与配置[0065] (1).主要试剂购买：
[0066]杂交液:购自北京鼎国生物技术有限责任公司；
[0067]Anti-Digoxigenin-AP:购自广州聚研生物科技有限公司；
[0068]10X封闭液(Blocking solution):购自广州聚研生物科技有限公司；
[0069]ScriptMAXTMThermoT7TranscriptionKit:购自东洋纺（上海）生物科技有限 公司；
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