]DNaseI试剂:北京天根生物技术有限责任公司；
[0071](2).主要溶液配置：
[0072]l〇XM9Buffer:称取30.24g Na2HP〇4·12H20,6.0g KH2P〇4，10g NaCl，0.5g MgS〇4·7H2〇,用蒸馏水定容至200mL，高压灭菌；
[0073] 马来酸缓冲液(MaleicAcidBuffer):称取11.067g马来酸和8.766gNaCl溶于 800mL蒸馏水中，用NaOH(固）调pH至7.5，用蒸馏水定容至1L，分装后高压灭菌；
[0074]NBT(50mg/mL):100mgNBT加入2mL70%二甲基甲酰胺溶液溶解；
[0075]BCIP(50mg/mL):100mgBCIP加入2mL灭菌水溶解；
[0076]洗涤缓冲液(WashingBuffer):MaleicAcidBuffer灭菌后加入0 · 3% (v/v)吐温 20；
[0077]检测缓冲液（DetectionBuffer):将1 · 1688gNaCl溶于lOOmL蒸馈水中，加20mL 1MTris-HCl(pH8.0)，用NaOH调pH至9.5,蒸馏水定容至200mL，高压灭菌，室温保存；
[0078]以下溶液需现用现配：
[0079]0 · 1X封闭液（0 · 1X BlockingSolution):用MaleicAcidBuffer把 10X封闭液 稀释成0.1X封闭液。
[0080]抗体溶液（AntibodySolution):Anti-Digoxigenin-APlOOOOrpm离心5min吸取 上层〇.4yL加入2mLBlockingSolution( 1:5000用BlockingSolution稀释）；
[0081]显色液（Colorsubstratesolution):将NBT/BCIP按 1:50用DetectionBuffer稀 释，避光保存；
[0082](3).原位杂交RNA探针的准备：
[0083] 〈1>探针设计：
[0084]根据获得到的MiPDO)6全长序列，应用软件PrimerPremier5.0设计原位杂交探 针引物，扩增的片段跨越内含子，另外再合成一对带T7启动子的上下游引物，T7启动子序 列:TAATACGACTCACTATAGGG，引物序列如下
[0089] 〈2>正/反义链模板的准备：
[0090] 正义链探针为引物In-PD-F与In-PD-T7R配对，反义链探针为引物In-PD-T7F与In-ro-R配对，以ro⑶6质粒DNA为模板，分别进行PCR扩增，退火温度均为60°C。
[0091] 按如下体系准备PCR反应混合液(共25μυ: 火菌eidH20 17.375μL ΙΟΧΕχTaqBuiTcr 2.5：μL dNTP(rrlOmM) 2nL
[0092] 正向特异引物 1 WL 反向特异引物 iyL ExTaqHS(5U/μL) 0 125uL 质粒DNA 1 UL
[0093] 按以下条件进行PCR反应：
[0095]1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳产物回收后用于正/反义链探针合成的DNA模版。
[0096]〈3>正/反义RNA探针的标记：
[0097]参照东洋纺的ScriptMAX TM Thermo T7Transcription Kit和罗氏的DIGRNA Labeling Mix，10Xcone说明书进行。
[0098] 按如下体系准备转录混合液(共25μ〇 :
[0101] 温育2h后-20°C保存，备用。
[0102]<4>RNA探针的纯化：
[0103]采用北京天根生物技术有限责任公司的DNase I试剂，按说明书操作。最后加入约 20yLDEPCH2O,取0.5yL左右电泳检验，备用。
[0104]2.具体操作步骤：
[0105](1)收集活体南方根结线虫雌成虫，4°C2%多聚甲醛溶液浸泡86h，然后22°C4h;
[0106](2)将浸泡的线虫去上清，加400yL0.1X固定液重悬浮线虫，吸置DEPC处理过的 载玻片，用针灸针把成虫的前体部扎1-2个小孔(避免把虫体弄破），然后将雌根结线虫虫体 收集到灭菌处理后的96孔板中；
[0107] (3)将收集的线虫用0.1XM9缓冲液漂洗2次，每次lmin;
[0108](4)裂解缓冲液(0.5mg/mL蛋白激酶K，M9缓冲液配置)22°C处理22min;去上清；[0109](5)0·1ΧΜ9缓冲液漂洗2次，每次lmin;
[0110] (6)去上清，-78°C的干冰中处理20min;
[0111](7)-20°C甲醇处理lmin，去上清；
[0112] (8)_20°C丙酮处理lmin，去上清；
[0113](9)加入20 %的丙酮，22°C水浴20min，去上清；
[0114](10)预杂交:加入250yL55°C预热的杂交液，45°C轻摇lh;
[0115](11)探针变性:探针在沸水中变性lOmin，并迅速置于冰水中2 5min;
[0116] (12)将变性的探针加入到250yL 55°C预热杂交液中，混匀，获得终浓度为50ngAiL的混有探针的杂交液；
[0117] (13)将预杂交后的线虫去除预杂交液，加入混有探针的杂交液，避光45°C杂交 18h；
[0118](14)步骤（13)杂交完成后，倒去杂交液，在45°C、4XSSC缓冲液中洗15min，去上 清，重复3次；
[0119](15)线虫于37°CNTE缓冲液中洗lOmin，去上清；
[0120](16)加入RNAse A(NTE buffer稀释成60yg/mL)消化未杂交探针，37°C处理lh;
[0121](17)线虫于45°C，0.1 X SSC缓冲液，0.1%SDS中洗20min，去上清，重复3次；
[0122] (18)在22°C马来酸缓冲中浸泡5min去上清；
[0123] (19)加入新鲜配制的0.1X封闭液22°C保温30min，去上清；
[0124] (20)新鲜配制的0.5mL抗体溶液22°C反应2h，去上清；
[0125] (21)在洗涤缓冲液中浸泡15min去上清，重复3次；
[0126] (22)检测缓冲液中平衡5min;去上清；
[0127] (23)加入250yL新鲜配制的显色液试剂，4°C放置暗处，不要动摇;显色16h;
[0128] (24)去上清，M9洗涤液漂洗2次，每次lmin，停止显色，实现雌根结线虫食道腺基因 MiH)⑶6基因原位杂交；
[0129] (25)显微镜观察结果。
[0130]观察发现，在利用反向探针杂交时，雌根结线虫的食道腺上有明显的杂交信号（图la)，而正向探针没有（图lb)。结果表明MiPDCD6基因在南方根结线虫雌根结线虫的及食道 腺中表达;结果如附图1所示。
[0131]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术，其特征在于:包括如下步骤： (1) 收集活体南方根结线虫雌成虫，4°C2 %多聚甲醛溶液浸泡86h，然后22°C4h; (2) 将浸泡的线虫去上清，加400yL0.1X固定液重悬浮线虫，吸置DEPC处理过的载玻 片，用针灸针把成虫的前体部扎1-2个小孔，然后将雌根结线虫虫体收集到灭菌处理后的96 孔板中； (3) 将收集的线虫用0.1XM9缓冲液漂洗2次，每次lmin; (4) 裂解缓冲液22°C处理22min;去上清； (5) 0.1XM9缓冲液漂洗2次，每次lmin; (6) 去上清，-78°C的干冰中处理20min; (7) -20°C甲醇处理lmin，去上清； (8) -20°C丙酮处理lmin，去上清； (9) 加入20%的丙酮，22°C水浴20min，去上清； (10) 预杂交:加入250yL55°C预热的杂交液，45°C轻摇lh; (11) 探针变性:探针在沸水中变性l〇min，并迅速置于冰水中2 5min，获得变性的探针； (12) 将变性的探针加入到250yL55°C预热杂交液中，混匀，获得终浓度为50ngAiL的混 有探针的杂交液； (13) 将预杂交后的线虫去除预杂交液，加入混有探针的杂交液，避光45°C杂交18h; (14) 步骤（13)杂交完成后，倒去杂交液，在45°C、4XSSC缓冲液中洗15min，去上清，重 复3次； (15) 线虫于37°CNTE缓冲液中洗lOmin，去上清； (16) 加入RNAseA消化未杂交探针，37°C处理lh; (17) 线虫于45°C，0.1XSSC缓冲液，0.1 %SDS中洗20min，去上清，重复3次； (18) 在22°C马来酸缓冲液中浸泡5min去上清； (19) 加入适量新鲜配制的0.1X封闭液22°C保温30min;去上清； (20) 新鲜配制的0.5mL抗体溶液22°C反应2h，去上清； (21) 在洗涤缓冲液中浸泡15min去上清，重复3次； (22) 检测缓冲液中平衡5min;去上清； (23) 加入250yL新鲜配制的显色液试剂，4°C放置暗处，不要动摇;显色16h; (24) 去上清，M9缓冲液漂洗2次，每次lmin，停止显色，实现雌根结线虫食道腺基因原位 杂交。2. 根据权利要求1所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术，其特征在于:步骤(4) 中所述的裂解缓冲液为含〇. 5mg/mL蛋白激酶K的M9Buffer。3. 根据权利要求1所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术，其特征在于:步骤（11) 中所述的探针为根结线虫食道腺基因的原位杂交RNA探针。4. 根据权利要求3所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术，其特征在于:所述的根 结线虫食道腺基因的原位杂交RNA探针为MiH)CD6基因的原位杂交RNA探针。5. 根据权利要求4所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术，其特征在于：所述的 MiH)⑶6基因的原位杂交RNA探针由引物In-PD-T7F和引物In-PD-R扩增获得;其引物序列如 下： In-PD-T7F如SEQIDN0:1所示； In-PD-I^nSEQIDN0:4m*。6. 根据权利要求1所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术，其特征在于:步骤（16) 中所述的RNAse A为由NTE buffer稀释成60yg/mL的RNAseA。7. 根据权利要求1所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术，其特征在于:为防止雌 根结线虫虫体破裂，在上述步骤(3)、（4)、（5)、（6)、（7)、（8)、（9)、（11)、（12)、（13)、（14)、 (15)、（16)、（17)、（18)、（19)、（20)、（21)、（22)、（24)中均不需要离心，直接去上清液。8. 权利要求1~7所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术应用于检测目的基因在 雌根结线虫食道腺中的表达部位。
【专利摘要】本发明公开了一种雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术及其应用，属于雌根结线虫基因表达检测技术领域。本发明针对雌根结线虫虫体易破裂的特点，在原位杂交的过程中采用针灸针在雌根结线虫成虫的前体部轻轻地扎1-2个小孔，提供了避免虫体破裂的方法；本发明还提供了雌根结线虫的固定技术；本发明改用96孔板实验可以减少虫体挪动，避免了离心管中因大量虫子聚集挤压造成的变形，而且雌虫体积较大，较重，不需要离心即能沉到底部，省去离心的步骤，能更好的维持虫体不变形。通过技术创新，在南方根结线虫雌成虫食道腺中实现了基因的原位杂交。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105463113
【申请号】CN201610023504
【发明人】王新荣, 张劲蔼, 陈芳妮, 祝乐天, 孙思, 吴路平
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月14日