一种amacr基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法

专利名称：一种amacr基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
一种AMACR基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种AMACR基因的原位杂交检测试 剂盒及其检测方法和应用。
背景技术：
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万，死亡 人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800 万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。
2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度 报告，"认为人类在抗癌大战中是失败"，也就是说癌症死亡率没有降低，其列 举出造成抗癌大战失败的几个因素是l.肿瘤细胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性； 3.抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌 症的措施。
本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另两个重要原因是:l.不能 做到真正的早期诊断;2.转移的病理机制不清楚。依照传统的医学影像及和其它 生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属于早 期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一概念值得认真讨论。影像医学 的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，l公 分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止 2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病 理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个
过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已证实 一旦形成肿 块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长； 一旦切除原发 灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以2公 分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时， 同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时己经是晚期了，这是导致 癌症死亡率不降的真正原因。
随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入 展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或 癌细胞形成(单克隆时)或突破血管壁早期转移时，就能做到早期预测诊断。
几十年来,PSA在前列腺癌的诊断和治疗中具有划时代的意义。然而，近 些年来越来越多低丰度PSA前列腺癌被诊断，PSA对前列腺癌诊断的敏感性 和特异性越来越受到质疑。Stamey等对1317例前列腺癌根治患者分析发现， 1983-1988年间与1999-2003间相比:直肠指诊阳性率由91°/。降到17%;患者 平均年龄由64岁降至59岁；肿瘤的体积由5.3cm降至2.4cm;平均PSA水平 由25ng/ml降至8nh/ml;前列腺体积由44g增至53g。研究者认为，1983-1988 年间PSA列腺癌密切相关，而1999-2003年间PSA仅与前列腺增生(体积)
- 、
相关。Bader等报告U93例前列腺癌根治术患者中，有相当部分的前列腺癌患 者PSA水平低(8ng/ml)，而且这部分病人与前列腺增生难以鉴别,特别是检测 前列腺特异性抗原(PSA)血浓度来筛査前列腺癌,但非前列腺癌疾病患者 PSA血浓度也可以升高。研究发现，前列腺癌过度表达a-甲基酰基辅酶A消旋 酶(AMACR)。为了确定前列腺癌组织表达AMACR的情况和临床实用价值， 美国密歇根大学Rubin等对独立完成的4组DNA微阵列基因表达资料(128 份标本)进行了分析。并采用前列腺癌组织微阵列测定了 342份前列腺组织(代
表前列腺癌不同发展阶段)的AMACR水平，蛋白质表达水平分为阴性(1 分)、弱阳性(2分)、中度阳性(3分)和强阳性(4分)。结果显示，在4组 独立完成的DNA微阵列分析中，有3组发现前列腺癌显著过度表达AMACR (P< 0.001)。在转录物水平(逆转录聚合酶链反应，RT—PCR)和蛋白质水 平(免疫印迹及免疫组化)都证实前列腺癌AMACR表达上调。免疫组化检査 证实，恶性前列腺上皮的AMACR表达比良性上皮增高。组织微阵列测定显示， 良性前列腺(108份标本)、萎縮前列腺(26份标本)、前列腺上皮内瘤形成(75 份标本)、局限性前列腺癌(116份标本)、转移前列腺癌(17份标本)的平均 AMACR蛋白染色强度分别为1.31、 2.33、 2.67、 3.20和2.50(P< 0.001)。成 对比较显示，局限性前列腺癌和良性前列腺组织染色强度有显著差异，平均表 达评分分别为3.2分和1.3分(平均相差1.9， P< 0.001)。将中度或高度染色强 度(3或4分)作为阳性标准，Rubin等评估了 94份前列腺针吸活检标本的 AMACR蛋白表达。结果证明，AMACR检测诊断前列腺癌的敏感性为97X， 特异性为100%。 AMACR的优点在于它是癌症特异性，只存在于癌症组织。 Rubin称，AMACR亦可用作其他癌症的诊断标志物。对各种癌症细胞进行检 查后发现，结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤都 过度表达AMACR,以结肠直肠癌和前列腺癌表达最高。研究者认为，AMACR 是对现有前列腺癌诊断方法的重要补充，AMACR可大大提高前列腺癌的诊断 准确性。诊断有困难的前列腺针吸活检标本，可进一步检査AMACR获得确诊。 目前对AMACR基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这些方法多用 于科研方面，不适应临床推广应用，特别是个性化的应用在国内外现阶段尚未 见介绍。根据现有的文献资料AMACR基因的检测技术及基因诊断试剂盒未见 报道。

发明内容
本发明的目的是，提供一种AMACR基因的原位杂交检测试剂盒在制备 检测前列腺和其它癌症疾病药物中的应用。
本发明的再一的目的是，提供一种AMACR基因的原位杂交检测试剂盒。 本发明的再一的目的是，提供一种AMACR的基因原位杂交检测方法。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是 一种AMACR基因的原位杂 交检测试剂盒在制备检测前列腺和其它癌症疾病药物中的应用，所述的 试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1 所示的AMACR基因序列，AMACR基因的核苷酸序列长度是1299bp， CDS 是20…1168bp。所述的其它癌症是结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、 肺癌、淋巴瘤和黑素瘤。
所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 所述的放射性核素选自3H、 35S、 1251或32P中的一种。 所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧 化酶或荧光素中的一种。
所述的非放射性标记物优选自地高辛。
所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是 一种AMACR基因的 原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是 一种AMACR的基 因原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤
a、 、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复 合体；
b、 检测a步骤得到的杂交复合体。
所述的a步骤中形成杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为 42°C;核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标 本或组织细胞标本。
本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以 AMACR基因为检测对象，合成探针是AMACR基因的DNA或RNA序列， 检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技 术的显示方法能提供AMACR基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后 免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人AMACR基因不表达，即不显色， AMACR基因在前列腺癌病人高表达。
本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组 成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作歩骤是 标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其 中杂交的具体步骤包括-仪器操作
1) .将待测标本放入反应槽中；
2) .仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3) .仪器自动弃去液体，自动后固定；
4) .仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C);
5) .仪器自动弃去液体，自动清洗；
6) .仪器自动弃去液体，自动杂交(42'C);
7) .仪器自动弃去液体，自动清洗；
8) .仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；
9) .仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10) .取出封片镜检。
本发明优点在于
1、 本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。
2、 本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推
广。克服了目前对AMACR基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方 法多用于科研方面，不适应临床应用的缺陷。
3、 本发明的临床意义是更早期检测前列腺癌症发生，本发明的诊断试剂 盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检査有显著不同。本发明 可以在基因水平上(癌变前期或癌细胞增殖)检测AMACR基因异常表达，在 影像医学检査未发现占位性癌病灶之前，及早于PSA前列腺癌症生化指标未 产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集， 给临床前列腺和其它癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早 预测。这样才有可能实施前列腺和其它癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，
'有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。
4、 用AMACR基因试剂盒检测前列腺和其它癌症比用其它试剂盒(PSA 蛋白标记物)检测前列腺癌症更早期、敏感性更好。本发明采用核酸原位杂交 技术检测AMACR的mRNA或DNA要比尿液的AMACR的蛋白更早期、敏 感性更好。


图1是本发明实施2例中正常人AMACR图2是本发明实施例2中前列腺癌症病人AMACR过量表达图3是本发明实施例2中肺癌AMACR表达图4是本发明实施例2中乳腺癌AMACR表达图5是本发明实施例3中AMACR和PSA基因平衡试验比较图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的一种AMACR基因的原位杂交检测试剂盒及其 检测方法和应用的具体实施方式
做详细说明。 实施例1
一种AMACR基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂， 其中，所述的杂交探针序列如SEQ IDNO. 1所示，所示。杂交探针用地高辛 标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下
消化液100 u 1/管l管/盒无色透明液体
保护液100ul/管l管/盒无色透明液体
预杂交液1300 ul/管2管/盒无色透明液体
正义杂交液10ul/管'l管/盒无色透明液体
反义杂交液10ul/管l管/盒无色透明液体
封闭液1000 tU/管1管/盒无色透明液体
碱性磷酸酶抗体lul/管l管/盒无色透明液体
显色剂A175 n 1/管l管/盒黄色液体
显色剂B320 li 1/管l管/盒无色透明液体
缓冲液I 10x90ml/瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液n iox80ml/瓶l瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液m iox20m/瓶3瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液IV 10x90ml/瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体
固定液卯ml/瓶l瓶/盒无色透明液体
阳性对照标本6片/盒
上述试剂成分说明(所有试剂购自SIGMA)
1 、 消化液20mg/ml蛋白酶K, 1 OOmg蛋白酶K，力卩DEPC- H20 5ml;
2、 保护液0.2g的glycine加入lml的1 X缓冲液I ;
3、 预杂交液lX缓冲液II7.5ml 50XD3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul
1 lmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul
0.04MEDTA3ml
50% formamide 15ml
4、 封闭液0.03g的bloking (购买自罗氏公司)加入lmllX缓冲液III;
5、 lOx缓冲液I: (PH7.1-7.4) NaCl 80g
Na2HPO/12H20 360g KC1 2g KH2P042g
加三蒸水至ll,并高压灭菌；
6、 lOx缓冲液II: (PH7.0)
NaCl 175,3g 柠檬酸钠88.2g HCl几滴
加三蒸水至11,并高压灭菌；
7、 缓冲液III: (PH7.9) Tris 12Ug
NaCl 87.66g HCl60ml左右 加三蒸水至ll，并高压灭菌；
8、 缓冲液IV:
1M Tris-HC1(PH9.5): Tirs 121.1g力P HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至
9.5，加水至ll，并高压灭菌;
1MNaCl: NaCl 58.44加水至11，并高压灭菌； 0.5MMgCl2: 101.65gMgCl2.6H20加水至11，并高压灭菌；
9、 固定液多聚甲醛40g加1 X缓冲液I至ll，稍加热(约50-60度)搅拌至溶 解；
10、 显色剂A: NBT lg加70%DMF11.44ml; 11 、 显色剂B: BCIP lg力B 1000/oDMF30ml。
本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。 实施例2
一种AMACR基因的原位杂交检测方法 一、标本处理
1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3 ml抗凝血缓慢加入含
有淋巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液^:1.5)的离心管中，2000r/min离心10 min;
2、 吸取中间层白细胞至另一离心管中,再在此管中加入约两倍的1X缓冲液I， 混匀，1500g/min离心10min;
3、 弃上清.沉淀加入约两倍的lX缓冲液I,混匀,1500g/min离心10min;
4、 弃上清,并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻 片上推片,自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3 ml血，可以做4 张片子；
5、 用40ml 4%固定液在玻璃缸中，固定30min，再用lX缓冲液I洗5min。每 缸可以放16片；
6、 标本可保存在-2(TC，或继续做实验。
二、 将试剂盒中试剂配制成使用浓度
1、将10X缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1X缓冲液I;
2 、将20 X缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2 X缓冲液II;
按1:100稀释成0.2X缓冲液II;按1:200稀释成0.1 X缓冲液II;
3、 将IOX缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成lX缓冲液m;
4、 IOX缓冲液IV用H蒸水按1:10稀释成X缓冲液IV (取1#， 2#， 3#各10ml, 加水至100ml既可)。
三、 实验步骤
1、 取每位待检者标本两张，(另外两张留作复査用)及阳性对照标本两张(每 次实验做一对阳性对照)；
2、 在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1X缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20 ml。 37i:水浴预热10分钟。放进16张玻片，37t处理12 min，再用1 X缓冲 液I洗5min;
3、 用0.2%的保护液(保护液lml加1 X缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min,三 蒸水洗5min,以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；
4、 将玻片放入保湿盒内,加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片,盖紧保湿盒，放在42 。C恒温水浴箱中3h以上；
5、 取出玻片,弃去盖玻片,将玻片放入玻璃缸内，用70%,90%,95%的乙醇各洗 2min，自然干燥；
6、 将玻片放入保湿盒内,每位病人标本两张， 一张加正义杂交液20ul/片，另一 张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42C恒温水浴箱中 16-24h;
7、 取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内
在42'C恒温水浴箱中用2 X缓冲液II洗两次,每次15min 在42'C恒温水浴箱中用0.2X缓冲液II洗一次,每次15min 在42'C恒温水浴箱中用0.1 X缓冲液II洗两次，每次15min;
8、 用IX缓冲液III洗30s,取出玻片,自然干燥；
9、 将玻片放入保湿盒内,加0.5%1封闭液(lml封闭液加5mll X缓冲液HI)100u1/ 片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min;
10、 取出玻片,用IX缓冲液III洗30s,自然干燥；
11、 将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8mllX缓冲液III)100ul/片, 盖紧保湿盒在室温下作用30min;
12、 取出玻片，用lX缓冲液m洗3次，每次15min;
13、 1X缓冲液IV洗2min,加显色剂(显色剂A73.3ul,显色剂B157.5ul加到30mll X缓冲液IV中,混匀)，室温避光12h以上；
14、用三蒸水洗5min,自然干燥，(用甘油加10%的1X缓冲液I混匀)封片镜检。
四、结果判断
在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。 阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。 所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。
正常人AMACR基因表达图见图1;前列腺癌症病人AMACR过量表达图 见图2;肺癌AMACR表达图见图3;乳腺癌AMACR表达图见图4。
地高辛标记的cDNA、 RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记 优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧 等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免 疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数， 判断目的基因的表达量。
本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中 的AMACR基因表达量，用来确定前列腺和其它癌是否发生，临床研究表明， AMACR基因是前列腺癌的特异性基因，AMACR基因在正常人中不表达，唯 独在前列腺和其它癌病人中表达， 一旦AMACR基因表达，说明前列腺和其它 癌己经发生，从而获得前列腺和其它癌的诊断信息。
实施例3
用AMACR基因试剂盒检测前列腺癌症与用PSA、 AMACR基因试剂盒检 测前列腺癌症之间对比实验。
近些年来临床上越来越多PSA蛋白低表达的前列腺癌被诊断出来，临床 上对PSA标记物诊断前列腺癌的敏感性和特异性越来越受到质疑。AMACR
是近来发现的前列腺癌相关诊断标记物1。 AMACR只在前列腺癌组织表达， 在BPH、高分级前列腺上皮内瘤和精囊组织无表达，在其它肿瘤均无表达，而 且AMACR表达的强度随着Gleasson评分增加而增强(+1——h5)。为了科学 评价PSA、 AMACR基因和AMACR基因各自在前列腺癌早期诊断的特异性、 敏感性、准确性。我们用平行试验的方法，同时检测PSA、 AMACR和AMACR 的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例前列腺癌患者的外周血 或前列腺组织标本，同时检测AMACR基因和PSA、 AMACR基因的mRNA (进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用AMACR 基因原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现AMACR基因在前列腺癌 病人中表达量比PSA、 AMACR基因在同一前列腺癌病人的表达量要高。 AMACR基因对前列腺癌早期诊断的特异性、敏感性、准确性比PSA、 AMACR 基因更好，原位杂交基因表达图5显示，AMACR基因的表达量是65M， PSA 基因的表达量是40%， AMACR基因唯独在前列腺和其它癌症中表达，在正常 健康人不表达，它作于前列腺和其它癌诊断的早期指标有非常重要的临床意 义。在前列腺癌的临床诊断中，有可能替代PSA标记物的诊断技术。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING 〈110〉芮屈生物技术(上海)有限公司
〈120〉 一种AMACR基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 〈130〉 / 〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 1299
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 1
gggggcactg ggaagcgcca tggcactgca gggcatctcg gtcgtggagc tgtccggcct 60 ggccccgggc ccgttctgtg ctatggtcct ggctgacttc ggggcgcgtg tggtacgcgt 120 ggaccggccc ggctcccgct acgacgtgag ccgcttgggc cggggcaagc gctcgctagt 180 gctggacctg aBgcagccgc gggg,cgc cgtgctgcgg cgtctgtgca agcggtcgga 譜 tgtgctgctg gagcccttcc gccgcggtgt catggagaaa ctccagctgg gcccagagat 300 tctgcagcgg gaaaatccaa ggcttattta tgccaggctg agtggatttg gccagtcagg 3G0 aagcttctgc cggttagctg gccacgatat caactatttg actttgtcag gcgttctctc 420 aaaaattggc agaagtggtg agaatccgta tgccccgctg aatctcctgg ctgactttgc 480 tggtggtggc cttatgtgtg cactgggcat tataatggct ctttttgacc gcacacgcac 540 tggcaagggt caggtcattg atgcaaatat ggtggaagga acagcatatt taagttcttt 600 tctgtggaaa actcagaaat tgagtctgtg ggaagcacct cgaggacaga acatgttgga 660 tggtggagca cctttctata cgacttacag gacagcagat ggggaattca tggctgttgg 了20 agcaatagaa ccccagttct acgagctgct gatcaaagga cttggactaa agtctgatga 780 acttcccaat cagatgagca tggatgattg gccagaaatg aagaagaagt ttgcagatgt 840 atttgcagag aagacgaagg cagagtggtg tcaaatcttt gacggcacag atgcctgtgt 900 gactccggtt ctgacttttg aggaggttgt tcatcatgat cacaacaagg aacggggctc %0 gtttatcacc agtgaggagc aggacgtgag cccccgccct gcacctctgc tgttaaacac 1020cccagccatc ccttctttca aaagggatcc tttcatagga gaacacactg aggagatact 1080
tgaagaattt ggattcagcc gcgaagagat ttatcagctt aactcagata aaatcattga 1140
aagtaataag gtaaaagcta gtctctaact tccaggccca cggctcaagt gaatttgaat 1200
actgcattta cagtgtagag taacacataa cattgtatgc atggaaacat ggagg犯cag 1260
tattacagtg tcctaccact ctaatcaaga a犯gaatta 1299
权利要求
1. 一种AMACR基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测前列腺和其它癌症疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的其它癌症是结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针 序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的标记 物选自放射性核素或非放射性标记物。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的放射性核 素选自3H、 35S、 1251或32P中的一种。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的 一种。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。
7. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。
8. —种AMACR基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ IDNO. 1所示，所述的 标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
9. 一种AMACR的基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于a步骤中形 成杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42°C;核酸杂交的时间 为16 — 24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。
全文摘要
本发明涉及一种AMACR基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种AMACR基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测前列腺和其它癌症疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
文档编号C12Q1/68GK101386889SQ20081020208
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月31日 优先权日2008年10月31日 公开号200810202081.8
发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司