专利名称：：农杆菌介导木本植物叶芽原位基因转化方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物基因转化方法，特别是一种利用农杆菌介导、不需要组织培养过程的基因转化新方法。技术背景杨树是重要的绿化及工业用材树种，杨树基因组测序的完成，使其成为最重要的研究林木生物学的模式植物，其遗传转化在国内外都非常受重视。目前已用农杆菌介导法获得了一系列转基因杨树品种，但所采用的方法都是常规的农杆菌介导法，需要通过耗时耗力的植物组织培养过程。在专利号为01104185.4的中国专利中公开了一种利用农杆菌直接转化玉米萌发种胚的转基因方法，该发明是一种利用农杆菌介导植物萌发种子进行基因转化的方法，即以植物萌发种子为受体材料，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因供体，在植物种子萌发过程中与农杆菌共培养，使其将供体的外源基因片段转移到受体基因组中。种子是植物体的雏形，而叶芽是枝条的雏型，既然农杆菌可通过直接侵染种胚导入外源基因，就有可能利用农杆菌侵染植物叶芽，使其Ti质粒上的T-DNA转移并整合到生长点细胞中，实现对新生枝条的转化，进而通过无性繁殖在短期内即可获得转基因植株。
发明内容本发明目的是克服上述己有技术的不足，提供一种以植物萌动叶芽作为农杆菌侵染受体，不需进行组织培养和植株再生的农杆菌介导木本植物叶芽原位基因转化方法。本发明的具体技术方案是以木本植物单叶芽为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在芽刚萌动时划伤生长点，并对划伤部位进行农杆菌侵染及保湿处理，将外源基因转移到受体基因组中，通过抗生素筛选、PCR扩增及Southern杂交，筛选阳性枝条，然后对阳性枝条进行扦插繁殖。由于无性繁殖可使导入基因稳定遗传，因此可在较短时间内得到转基因植株。本发明所述的木本植物叶芽主要是杨树叶芽。选刚萌动的杨树顶芽和侧芽，在叶芽表面光滑，尚无绿叶出现时进行处理。农杆菌转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期内，细胞具有分裂能力是转化的基本条件，刚刚萌动叶芽的生长点细胞处于旺盛分裂期，因此选萌动叶芽为处理受体。对刚萌动的叶芽用锋利的刀片纵向划伤生长锥。芽是由包括有生长点(茎的顶端分生组织)的生长锥及其叶原基、腋芽原基和幼叶等外围附属物所组成。有些植物的芽在幼叶的外面还包有鳞片茎的原始体，如杨树芽即为鳞芽。为使农杆菌Ti质粒进入到受体细胞中，用刀片纵切植物叶芽使其生长锥部位受伤，由于受伤后的生长点分裂能力下降甚至死亡，而未受伤或处理过轻的生长点则不会被农杆菌侵染，因此划伤应适度。将携带外源基因片段的农杆菌在叶芽处理的前一天进行培养，从平板上挑取单菌落于加有卡那霉素(50mg/ml)的YP(yeastpeptone)液体培养基中进行振荡培养，调节农杆菌溶液OD值至O.l—l.O，将其滴到幼芽伤口处，然后用封口膜包裹被处理的叶芽保湿，2—3天后去膜。许多双子叶植物是农杆菌的天然宿主。根据前人的研究结果，那些易被农杆菌转化的双子叶植物通常可在感染处分泌出一种酚类物质——乙酰丁香酮，该物质可激活农杆菌Ti质粒上的Vir基因，从而促进农杆菌侵染和对受体的转化。因此当受体为农杆菌宿主植物叶芽时，可直接被农杆菌侵染和转化；当受体为非农杆菌宿主或单子叶植物叶芽时，可在农杆菌悬浮液中加入一定量的乙酰丁香酮作为农杆菌侵染诱导物。本发明方法可用于任何单叶芽木本植物的基因转化。实验证实采用农杆菌介导植物叶芽原位基因转化后，外源基因已整合到受体植物染色体中。利用植物叶芽作为农杆菌介导外源基因转化的受体系统，避开了传统农杆菌共培养法所要求的严格繁冗的组织培养过程，縮短了实验周期，且充分利用了母体植株的生长潜力。本发明不需要昂贵的仪器及复杂的操作技术，利用植物叶芽作为受体，操作简单，普通育种工作者就可操作，且一次可处理大量叶芽。本发明对再生困难的木本植物具有较大的意义，特别对于可扦插繁殖的木本植物可以在短期内得到转基因植株，且可稳定遗传，避免了传统的林木育种所面临的周期长、再生难的缺陷。本发明基因转化方法已在杨树上进行了遗传转化并获得了成功，本发明为木本植物、特别是杨树的基因转化提供了一条简便、快速、经济的途径。图1为携带几丁质酶基因和蝎毒蛋白基因的重组质粒pBI101的物理图谱。卡那霉素基因能赋予植物对卡那霉素的抗性。图2为几丁质酶基因PCR扩增产物部分电泳图。M为分子量标记DL2000，1为阳性质粒，2为阴性对照，3—11为不同转化枝，其中8、9为阴性枝，其余为阳性枝。图3为蝎毒蛋白基因PCR扩增产物部分电泳图。M为分子量标记DL2000，1为阴性对照，6为阳性质粒，2—5为不同转化枝。图4为部分几丁质酶基因PCR扩增阳性材料Southern杂交结果。1、2为不同转化材料AcMI酶切，3—6:历/7c/III酶切材料，其中3为质粒，4为阴性对照，5、6为不同转化材料。具体实施方式(一)材料与方法(1)外源基因及其载体以携带有质粒pBI101的农杆菌LBA4404为基因供体材料。质粒pBI101携带有双价抗虫基因几丁质酶(chitinase)基因和蝎毒蛋白(BmkIT)基因。抗卡那霉素基因为其选择标记基因，它能赋予植物对卡那霉素的抗性。几丁质酶基因的片段大小为1667bp，蝎毒蛋白基因片段为280bp。质粒pBI101的物理图谱如图1所示。(2)受体材料以青杨(尸c^w/Mca决矽a"aRehd)品种中林美荷为受体材料。(3)转化方法有两种。方法一叶芽处理的前一天进行农杆菌培养。从平板上挑取单菌落于加有卡那霉素(50rag/ml)的YP(yeastpeptone)液体培养基中进行振荡培养。调节农杆菌溶液OD值至O.1—1.0后，加入终浓度为100ixmol/L乙酰丁香酮(AS)。选刚萌动的杨树顶芽或侧芽，用锋利的解剖刀纵向划伤生长锥，用注射器将农杆菌悬浮液滴到幼芽伤口处，然后用封口膜将其包被保湿，2-3天后，去膜。待被处理叶芽伸长并长出2一3片新叶时，对处理枝上生出的新叶片进行抗生素初步筛选。通过不同浓度梯度的卡那霉素涂抹未转化枝条叶片的预备试验中，确定150mg/L卡那霉素为适宜的选择压力。方法二农杆菌悬浮液中不加乙酰丁香酮，其它步骤与方法一相同。(二)转化结果(1)抗生素初步筛选在用卡那霉素对处理枝叶片涂抹后一周，对叶片反应进行观察记载，初步将叶片无黄斑或出现不明显斑痕的枝条认为疑似转化枝。杨树母体叶芽基因转化处理后卡那霉素筛选结果见下表1。表1杨树母体叶芽基因转化处理后卡那霉素筛选结果处理处理芽数/个成枝数/个成枝率/%卡那霉素抗性枝条数/枝卡那霉素筛选率/%顶芽25011244.82925.9顶芽+AS25014457.63322.9侧芽26422083.33214.5侧芽+AS55228952.45017.3抗生素初步筛选结果表明，侧芽的平均成枝率为67.85%，比顶芽高16.6%，但经卡那霉素筛选后，顶芽在两种处理下，其成枝率均较侧芽高；农杆菌溶液加入AS后，侧芽的卡那霉素筛选率较不加AS高2.8%，顶芽相同处理则低3.0%，表明农杆菌溶液中添加AS与否对外源基因的转化无明显影响，这表明杨树叶芽伤口可能分泌一些利于农杆菌侵染的物质，因而不需要附加外源AS。但对于那些不能分泌有利于农杆菌浸染的酚类物质的双子叶植物及大部分单子叶植物，在农杆菌悬浮液中添加AS则可能是提高转化率的必要条件。(2)PCR扩增检测为进一步确定外源基因是否整合到杨树基因组中，在卡那霉素初步筛选的基础上，以未转化枝为对照，取疑似转化枝叶片提取DNA分别进行几丁质酶基因和蝎毒蛋白基因的扩增，具体方法如下A、取疑似转化枝及未转化枝幼嫩叶片提取总DNA作模板，植物总DNA的提取采用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法2%CTAB抽提缓冲液在65'C水浴中预热；取少量叶片(约lg)置于研钵中，用液氮磨至粉状；加入700ul2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动，置于65。C的水浴中，每隔10min轻轻摇动，30min后取出；加入等体积的Tris饱和酚，混匀；取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，混匀；离心，取上清夜，加入等体积预冷的异丙醇，慢慢上下摇动，使与水层充分混合至能见到DNA絮状物；离心，倒掉上清，加入等体积75。/。乙醇洗DNA两次；干燥DNA;加入TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解；置于-2(TC保存、备用。B、引物设计与合成根据几丁质酶基因和蝎毒蛋白基因的核苷酸序列，分别取5'端和3'端20bp的核苷酸序列对设计引物，两引物间的基因片段大小分别为1667bp和280bp,PCR仪为PTC-200型(MJResearch,Watertown,MA,USA)。C、PCR扩增几丁质酶基因的PCR扩增程序为94°C，4分钟；94°C，30秒；57°C，45秒；72°C，2分钟，扩增30个循环，然后72'C延伸10分钟。蝎毒蛋白基因的扩增程序为94°C，4分钟；94°C，30秒；50°C，30秒；72°C，1分钟，扩增30个循环，72。C延伸10分钟。PCR扩增结果详见表2，PCR产物部分电泳图谱见图2、图3。表2PCR扩增结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>PCR扩增结果表明，经卡那霉素初步筛选获得的疑似转化枝，经PCR扩增，阳性达79.3一90.9%，证实抗生素初步筛选是可行的，可大大减少后期筛选转化枝的工作量，且简便易行。(3)Southern杂交为进一步证实PCR扩增结果的可靠性，随机取PCR扩增阳性枝条叶片提取总DNA并进行Southern杂交，以质粒DNA为阳性对照，未转化枝叶片DNA为阴性对照。具体方法如下A、限制酶切片断的琼脂糖凝胶电泳分离以限制性内切酶历'/7dn和^boyI分别切割质粒DNA、未转化枝DNA及PCR扩增阳性枝DNA各15ug，并将酶切后的DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上电泳分离。.B、印迹对电泳后的凝胶作变性、中和处理，以20XSSC为转移液，将DNA转移至尼龙膜上。C、固定用保鲜膜包好尼龙膜，将DNA印迹面向上，于254nm紫外光下照射4min，使DNA固定于尼龙膜上。D、预杂交将尼龙膜装入盛有适量(200W/Cm2)预杂交液的杂交瓶中，在68'C下预杂交2小时。E、杂交取出尼龙膜，将带有地高辛标记的单链探针DNA(几丁质酶基因PCR扩增产物作为探针)加入适量(O.35ml/cm2)预杂交液中，68'C过夜杂交。F、洗膜取出尼龙膜，迅速置于洗膜液I(2XSSC，0.1%SDS)中，室温下漂洗30分钟，之后置于洗膜液II(0.5XSSC，0.1%SDS)中，65'C水浴振荡洗膜30分钟。G、与抗体孵育加抗体(l:10000)与漂洗后的尼龙膜于室温(15-25°C)下保温30分钟。H、显色力口入化学发光底物disodium3-(4-methoxyspiro{l，2-dioxetane-3,2，-(5，-chloro)tricyclo[3.3丄1]decan)-4-yl}phenylphosphate(CSPD)与尼龙膜作用，可使DNA杂交部位在波长477nm处发光，感光于X光片。I、X光片曝光及显影探针在暗室里，取X光片放于杂交膜上，曝光2—4小时后，进行显影。若曝光过度，则应更换胶片，縮短曝光时间；若曝光不足，则重新压片，增加曝光时间。Southern杂交结果表明，外源几丁质酶基因确已整合到杨树基因组中，且为单拷贝整合。权利要求1、一种农杆菌介导木本植物母体叶芽基因转化方法，其特征是以木本植物叶芽为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在叶芽刚萌动时划伤生长点，并对划伤部位进行农杆菌侵染及保湿处理，将外源基因转移到受体基因组中，通过抗生素筛选、PCR扩增及Southern杂交，筛选阳性枝条，然后对阳性材料进行扦插繁殖。2、根据权利要求1所述的农杆菌介导木本植物母体叶芽基因转化方法，其特征是对杨树叶芽进行基因转化。3、根据权利要求1所述的农杆菌介导木本植物母体叶芽基因转化方法，其特征是选刚萌动的杨树顶芽和侧芽，叶芽表面光滑，尚无绿叶出现时进行处理。4、根据权利要求1所述的农杆菌介导木本植物母体叶芽基因转化方法，其特征是对刚萌动的叶芽用锋利的刀片纵向划伤生长锥。5、根据权利要求1所述的农杆菌介导木本植物母体叶芽基因转化方法，其特征是将携带外源基因片段的农杆菌在叶芽处理的前一天进行培养，从平板上挑取单菌落于加有卡那霉素(50mg/ml)的YP(yeastpeptone)液体培养基中进行振荡培养，调节农杆菌悬浮液0D值至0.1—1.0，将其滴到幼芽伤口处，然后用封口膜包裹被处理后的叶芽保湿，2一3天后去膜。6、根据权利要求1所述的农杆菌介导木本植物母体叶芽基因转化方法，其特征是当受体为非农杆菌宿主或单子叶植物叶芽时，在农杆菌悬浮液中加入乙酰丁香酮作为农杆菌侵染诱导物。全文摘要一种农杆菌介导木本植物母体叶芽基因转化方法，属于植物基因转化方法，目的是提供一种以植物萌动叶芽作为农杆菌侵染受体，不需进行组织培养和植株再生的植物基因转化方法。本发明以木本植物叶芽为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在叶芽刚萌动时划伤生长点，并对划伤部位进行农杆菌侵染及保湿处理，将外源基因转移到受体基因组中，通过抗生素筛选、PCR扩增及Southern杂交，筛选阳性枝条，然后对阳性材料进行扦插繁殖。文档编号C12N15/11GK101225384SQ20081005454公开日2008年7月23日申请日期2008年2月4日优先权日2008年2月4日发明者毅孙,张一萍,杨利艳,谢莉琴申请人:山西省农业生物技术研究中心