一种检测黄牛PPARα基因单核苷酸多态性的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性（SingleNucleotide Polymorphism,SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛PPARa基因第53869位单核苷酸多态性 的方法。
【背景技术】
[0002]随着基因组学新方法和新技术的不断涌现，通过对各项技术进行整合，使我们可 以从基因即分子水平上进行设计来重构畜禽新品种。基于DNA遗传标记的产生和应用，开创 了分子育种的新领域，为动物育种和改良提供了新的技术支撑，给动物遗传育种带来了美 好的前景。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。 [0003] 单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP)主要是指在基因组水 平上的特定位点由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。SNP在人类基因组中广泛 存在，可能存在着300万~1000万个SNP在人类基因组中，不同的人群有着不同的SNP分布特 征。它是一种最常见的人类可遗传变异。SNP所表现出的多态性是由单个碱基发生转换或颠 换所引起。在基因组DNA中，任何碱基均有发生变异的可能，因此SNP既有可能存在于基因序 列内，也有可能位于非编码序列上。SNP在富含CG的序列上出现的频率最高，而且多是胞嘧 啶C转换为胸腺嘧啶T，原因是CG中的C在发生甲基化后会自发地脱氨成为胸腺嘧啶。
[0004]SNP作为第三代分子遗传标记，具有以下特征：（1)密度大。SNP是基因组DNA中普遍 存在且频率最高的遗传标记。已有研究表明，SNP出现的频率在1/1000~10/1000之间，人类 30亿个碱基中共有300万以上的SNPs，其密度高于微卫星DNA标记。（2)易实现自动化分析。 组成DNA的碱基有4种，但SNP-般只有两种碱基组成，所以SNP标记为双等位标记。因此在检 测时表现为非此即彼，在基因组筛选时不用分析片段的长度，往往只需+/-的分析，这就利 于实现自动化技术筛选与检测SNPS<3(3)用途广泛。SNP作为分子遗传标记的一种，在动物遗 传育种中具有广泛的功能。主要用于遗传作图、疾病检测、位点标识和进化分析等。
[0005]目前，检测SNP的方法可以分为两大类:一类是基于凝胶电泳的传统方法，另一类 是利用高通量、自动化较高。高通量的检测方法包括直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱 等。直接测序是检测SNP最直接可靠的方法，DNA芯片可以对SNP进行大规模的筛查，但二者 的检测费用都是极其昂贵。变性高效液相色谱方法对于试剂和环境要求较高，不能检测出 纯合突变，所以不是检测SNP的首选方法。基于凝胶电泳的传统方法主要包括PCR-SSCP与 DNA测序结合法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、变性梯度凝胶电泳等。PCR-SSCP的实验过程比较 长，操作比较繁琐，只适合长度小于500bp的小DNA片段，如果DNA片段太长，DNA单链很难形 成稳定发夹结构，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段;AS-PCR 方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，但由于特异性引物的稳定性差，对 扩增条件要求比较严格，所以操作比较繁琐，因此不适于高通量SNP的检测。变性梯度凝胶 电泳也只能对突变进行较为粗略地检测，不能确定突变位置和类型。PCR-RFLP由于位点特 异性高、操作较简单和成本较低等，因此被广泛运用于植物基因分型、基因定位、分子鉴定 等方面的研究。综上所述，利用PCR-RFLP法可能是当前检测SNP最理想的遗传标记方法。
[0006] 过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome Proliferator Activated Recept〇r，PPAR)属于类固醇/甲状腺/维甲酸受体超家族，对于胰岛素敏感性、体内的糖平 衡以及脂肪分化和生成方面具有重要调节作用，是目前研究的热点。该家族可分为三个成 员，PPARaj和γ WPARa能够影响多种脂肪酸转运以及代谢基因的转录，有研究表明PPARa 所有已知的靶基因都参与脂质代谢。PPARa在体内主要分布在线粒体脂肪酸氧化效率高的 组织，如肝脏、棕色脂肪组织等，而在白色脂肪组织和软骨中表达量较低。目前，有大量的研 究证明PPARa在肝脏脂质代谢、机体能量代谢、肥胖发生及胰岛素抵抗等发面发挥着重要作 用。
[0007]然而，PPARa基因的研究绝大多数是在人和小鼠等模型动物上进行，在牛方面的报 道不多，中国地方黄牛PPARa基因遗传变异的研究也不是很广泛。因此，该基因的功能研究 及其遗传变异与生长性状指标(如:体重、日增重、体高、坐骨端宽、胸围等)关联的研究，可 为进一步改良我国地方黄牛品种提供理论基础。
【发明内容】
[0008] 本发明解决的问题在于提供一种检测的黄牛PPARa基因单核苷酸多态性的方法， 寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。
[0009]本发明是通过以下技术方案来实现：
[0010] 一种检测黄牛PPARa基因单核苷酸多态性的方法，以包含PPARa基因的待测黄牛全 基因组DNA为模板，以引物对P(包含P1和P2)为引物，PCR扩增黄牛PPARa基因；用限制性内切 酶Hapn消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电 泳;根据聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳结果鉴定黄牛PPARa基因第53869位的单核苷酸多态性；
[0011]所述的引物对P为：
[0012] ?1(上游引物）：5'-1'1'1^611^6厶丁61^0^丁厶2-3'22匕口
[0013] ?2(下游引物）：5，-7^(：1'1'1'(：7^66(：1'(：111^67^(：-3，25匕口
[0014]注：引物中的表示为了形成酶切位点引入的错配碱基。
[0015]所述的PCR扩增反应程序为：
[0016] 95°C预变性lOmin; 94°C变性 30 ~50s，58°C退火 30s，72°C延伸 30 ~50s，30 ~40 个 循环;72°C延伸10min;4°C保存。
[0017]所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳为质量浓度为12%聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳。
[0018] 所述根据聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳结果鉴定黄牛PPARa基因第53869位的单核苷 酸多态性为：TT(正常型）基因型表现为168bp;TC(杂合型）基因型表现为168bp、146bp和 22bp三条带;CC(突变型)基因型表现为146bp和22bp两条带。
[0019]与现有技术相比，本发明具有以下独特的技术效果：
[0020] 本发明根据已公布牛PPARa基因(NCBI:AC_000162.1)的序列设计引物，分别以5个 黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛 PPARa基因的部分序列与NCBI公布的序列进行对比，发现在PPARa基因的第53869位存在SNP 多态性。
[0021] 针对上述的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，进行PCR扩增后，用特 定的限制性内切酶进行酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态 性：
[0022] PCR扩增PPARa基因产物时，该突变没有自然酶切位点，需在引物上引入一个错配 碱基使其在突变位点处可以形成HapII的酶切位点CCGG1CR扩增的片段大小为168bp，当第 53869位发生T>C突变，PCR扩增PPARa基因的第53868bp~53871bp为CgGG时，则会被HapII酶 识别，切割为146bp和22bp。当第53869位不发生T>C突变，PCR扩增PPARa基因的第53868bp~ 53871bp为q；GG时，则不会被HapΠ酶识别，这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。
[0023]由于PPARa基因功能涉及初生重、体重、体高、日增重、体斜长、坐骨端宽等生长性 状。本发明提供的检测方法为PPARa基因的SNP与黄牛部分生长性状(体高、体重和体斜长 等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛体高、十字部高和早期胸围、体重、体 高及体斜长的候选分子遗传标记，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)， 快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
【附图说明】
[0024]图1为黄牛PPARa基因包含第53869位的多态位点的168bpPCR产物电泳检测图；其 中，泳道1 一5为PPARa基因包含第53869位的多态位点的168bp片段的琼脂糖电泳检测图；泳 道Μ为MarkerD1000(lOOObp，750bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp);
[0025] 图2 (a)为HapΠPCR-RFLP方法检测黄牛PPARa基因第位SNP酶切电泳图。（b)为黄牛 PPARa基因第53869位点TT、TC和CC基因型个体的反向测序图；
[0026] 图3为HapIIPCR-RFLP方法检测黄牛PPARa基因第五外显子SNP(AC_000162.1_ g.53869T>C)序列分析图，其中带框分别表示上下游引物序列，单个字母加红色背景的位点 表示SNP位点，单个字母加蓝色背景的位点为引入的错配碱基；
[0027] 图4为PPARa基因第53847bp~54014bp的168bp的基因片段图。
【具体实施方式】
[0028]本发明通过对黄牛PPARa基因第53869位突变的单核苷酸多态性进行检测，以便用 于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。下面结合 具体样本的检测和性状关联对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是 限定。
[0029] a、以下实施例中所