C延伸 30 ~50s，30 ~40 个 循环;72°C延伸10min;4°C保存。
[0098]对5个黄牛品种共计454个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得454个个体的黄牛PPARa基因中包含该SNP位点的168bp的DNA片段。
[0099]d、HapΠ酶切消化PCR扩增的PPARa基因片段
[0100]l、HapII酶切反应消化体系（20yL):8yLPCR产物，10XM缓冲液 2.0yL，PvuII(10U/ 4〇0.3以1^，灭菌超纯水(!12〇)9.74匕
[0101] 2、酶切消化条件:37°C恒温培养箱中消化10~12h。
[0102]e、Hapn消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳分析
[0103] 1)制作12.0%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，250￥预电泳101^11，点样后200￥电压电泳 2h，电泳结束后硝酸银染色；
[0104] 2)根据聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳结果分析SNP多态性：
[0105]根据银染结果判断SNP的多态性：
[0106]PCR扩增基因产物时，当第53869位发生T>C突变，则会被HapΠ酶识别，突变型会被 切割为146bp和22bp。当第53869位不发生T>C突变，则不会被HapΠ酶识别，这样就可以对该 位点SNP多态性进行检测。
[0107] 因此，黄牛基因组的PPARa基因第53869位的SNP多态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳电 泳结果为：
[0108] 图1为黄牛PPARa基因包含第53869位的多态位点的168bpPCR产物电泳检测图；其 中，泳道1 一5为PPARa基因包含第53869位的多态位点的168bp片段的琼脂糖电泳检测图；泳 道Μ为MarkerD1000(lOOObp，750bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。
[0109] 图2(a)为HapIIPCR-RFLP方法检测黄牛PPARa基因第53869位SNP酶切电泳图。TT(正常型)基因型表现为168bp;TC(杂合型)基因型表现为168bp、146bp和22bp三条带;CC(突 变型)基因型表现为146bp和22bp两条带。
[0110] 其中，泳道 1:Μ道:DL500 (500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，50bp)。泳道2、 4:TC基因型个体（168bp，146bp与20bp);泳道3:CC基因型个体（146bp与20bp);泳道5:TT基 因型个体（148bp)。
[0111] 4)不同基因型个体PCR产物的测序验证
[0112] 由于引入的错配碱基位于正向引物内，所以对不同基因型个体的PCR产物进行了 反向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含168bp、146bp和22bp条带的杂合子TC基因 型个体其53869位的测序图的确表示为T或C，图2(b)所示，而TT基因型与CC基因型分别为T 与C，测序峰图为单一峰。
[0113] 图3为HapIIPCR-RFLP方法检测黄牛PPARa基因第五外显子SNP(AC_000162.1_g.53869T>C)序列分析图，其中带框分别表示上下游引物序列，单个字母加红色背景的位点 表示SNP位点，单个字母加蓝色背景的位点为引入的错配碱基；
[0114] 图4为PPARa基因第53847bp~54014bp的168bp的基因片段图，其序列表见序列表 1〇
[0115]f、黄牛PPARa基因SNP位点的频率统计分析
[0116] 1)基因和基因型频率
[0117]基因型频率在群体遗传学中，指的是在一个种群中某种基因型所占的百分比。
[0118] Ρω=Νω/Ν
[0119]式中，Pm表示一个SNP位点的为ΑΑ基因型的频率;Naa表示拥有ΑΑ基因型的个体数； N为整个群体的总个数。
[0120] 基因频率是某种基因在某个种群中出现的比例，是某基因个体数占全部基因数的 比例。
[01 21 ]Pa= ( 2NM+NAal+NAa2+NAa3+......NAai+......+NAan)/2N
[0122] 式中，PA表示等位基因A的频率，Naa表示群体中拥有AA基因型的数目，N/^表示拥有 Aai基因型的个体数目；ai_an表示等位基因A的η个不同的复等位基因。
[0123] 本研究所涉及的等位基因为Τ和C，所以具体的基因频率计算公式为：
[0124] Pt=(2Ntt+Ntc)/2N
[0125] Pc=(2Ncc+Nxc)/2N
[0126] 式中，PT，PC分别表示等位基因T和C等位基因的频率，Νττ、Ntc和Ncc分别表示TT、TC和 CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。
[0127] 如表3所示的基因频率分布表，在不同黄牛品种PPARa基因SNP中的T等位基因频率 变化幅度在46.7%~70.6%，C等位基因频率变化幅度在29.4%~53.3%之间。符合等位基 因频率大于1.0%的SNP的定义，故本位点为单核苷酸多态位点。
[0128] 表3黄牛PPARa基因第53869位SNP位点的HapIIPCR-RFLP的频率分布表
[0129]
[0130] g、黄牛PPARa基因SNP位点基因效应的关联分析
[0131] 基因型数据:HapΠ识别的基因型(TC和CC)
[0132] 生产数据：鲁西牛成年体尺性状，包括体高、体斜长、胸围、腹围、腰角宽、坐骨端 宽、十字部高、体重、重高比；南阳和郏县红牛牛初生重，以及6月龄、12月龄、18月龄和24月 龄的体重、体高、体斜长、胸围、坐骨端宽、日增重。
[0133] 关联分析模型：
[0134] 先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正； 根据数据特征，应用SPSS(17.0)软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进 行分析时采用了固定模型：
[0135] Yijki=y+BFi+Monthj+Gk+eijki
[0136] 其中：YijklS性状观察值，μ为总体均值，BFi为第i个品种和农场的固定效，Monthj 为第j个月观测的固定效应，Gk为第k个单SNP标记基因型的固定效应，eljkl为随机误差，具体 见表4和表。
[0137] 表4PPARa基因第53869位多态位点与鲁西牛生长性状指标间的方差分析
[0138]
[0139]表5PPARa基因第53869位多态位点与南阳牛、郏县牛不同月龄生产指标间的方差分析
[0142]从表4和表5的结果表明，在成年鲁西牛的体尺性状中TT与TC基因型个体的体高和 十字部高显著高于CC基因型。在南阳牛和郏县牛群体中，CC基因型个体的胸围（6月龄)显著 高于TT和TC基因型(？〈0.05);1'1'基因型个体的体重（18月龄）、体高（18月龄）、体斜长(24月 龄)显著高于TC基因型个体(P〈0.05或P〈0.01);TT基因型个体的体高（24月龄)显著高于CC 基因型(Ρ〈0.05)。关联分析结果说明ΤΤ基因型可以作为一个提高黄牛体高、十字部高和早 期胸围、体重、体高及体斜长的候选分子遗传标记。
【主权项】
1. 一种检测黄牛PPARa基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含PPARa基因的 待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR法扩增黄牛PPARa基因；用限制性内切 酶HapΠ消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;根据 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PPARa基因第53869位的单核苷酸多态性为:TT基因型表 现为168bp;TC基因型表现为168bp、146bp和22bp三条带;CC基因型表现为146bp和22bp两条 带； 所述的引物对PS: P1 上游引物：5 ' -TTTCAGTTGGGATGTCCCATAg-3 ' 22bp P2 下游引物：5 '-TTACTTTCTTAGGCTCTCGTGTTAC-3 ' 25bp〇2. 根据权利要求1所述的检测黄牛PPARa基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所 述的PCR扩增反应程序为： 95°(3预变性1011^11;94°(3变性30~508,58°(3退火308,72°(3延伸30~508,30~40个循环； 72°C延伸10min;4°C保存。3. 根据权利要求1所述的检测黄牛PPARa基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所 述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
【专利摘要】本发明公开了一种检测黄牛PPARα基因单核苷酸多态性的方法，以包含PPARα基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P(包含P1和P2)为引物，用PCR法扩增黄牛PPARα基因，然后用限制性内切酶HapⅡ消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳结果鉴定黄牛PPARα基因第53869位的单核苷酸多态性。由于PPARα基因功能对生长发育性状具有重要生物学功能，为该基因的SNP与生长性状关联的建立奠定了基础。PPARα基因单核苷酸多态性对黄牛体高、十字部高及早期胸围、体重、体高、体斜长有显著影响，可用于黄牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105463104
【申请号】CN201610003946
【发明人】马云, 张琼琼, 李芬, 郝瑞杰, 李俊雅, 马福军, 李何, 石奎林
【申请人】信阳师范学院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月4日