鉴定对用抗ErbB2抗体处理响应的肿瘤的方法

专利名称：鉴定对用抗ErbB2抗体处理响应的肿瘤的方法
技术领域：
本发明涉及鉴定对用抗HER2抗体处理响应的肿瘤的方法，以及治疗患有这种肿瘤的患者的方法。
背景技术：
受体酪氨酸激酶的ErbB家族是细胞生长、分化和存活的重要介导物。受体家族包括四个独特成员，包括表皮生长因子受体(EGFR或ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因编码的EGFR已被暗示与人的恶性肿瘤发生相关。特别地，已经在乳腺、膀胱、肺、头部、颈和胃癌症以及恶性胶质瘤中观察到EGFR表达升高。在通过自分泌刺激性路径引起受体激活的同一肿瘤细胞中，EGFR受体表达升高通常与EGFR配基——转化生长因子α(TGF-α)——的生成增多相关。Baselga和Mendelsohn Pharmac.Ther.，64127-154(1994)。此外，表皮生长因子受体相关蛋白(ERRP)已经被描述，其中1583bp的cDNA片段克隆与小鼠EGFR和截短的大鼠EGFR具有90-95％的序列同源性(美国专利号6,399,743；和美国公开号2003/0096373)。针对EGFR或其配基，TGF-α和EGF的单克隆抗体已经被评价为在治疗这种恶性肿瘤中作为治疗剂。参见，例如Baselga和Mendelsohn.，同上文；Masui et al.，CancerResearch，441002-1007(1984)；和Wu et al.，J Clin.Invest.，951897-1905(1995)。
ErbB家族的第二个成员p185neu最早被鉴定为来自化学处理的大鼠的成神经细胞瘤的转化基因的产物。Neu原癌基因的活化形式由所编码蛋白的跨膜区域中的点突变(缬氨酸变为谷氨酸)而产生。在乳腺和卵巢癌中观察到neu的人同系物(HER2)发生扩增，这与不理想的预后相关(Slamon et al.，Science，235177-182(1987)；Slamon et al，Science，244707-712(1989)；和美国专利号4,968,603)。迄今，还没有报道在人的肿瘤中具有与neu原癌基因中的点突变类似的点突变。ErbB2的过度表达(常常，但不是一律由于基因扩增)也在其他癌症中观察到，包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和膀胱癌。参见，以及其它文献，King etal.，Science，229974(1985)；Yokota et al.，Lancet，1765-767(1986)；Fukushigi etal.，Mol Cell Biol.，6955-958(1986)；Geurin et al.，Oncogene Res.，321-31(1988)；Cohen et al.，Oncogene，481-88(1989)；Yonemura et al.，CancerRes.，511034(1991)；Borst et al.，Gynecol.Oncol.，38364(1990)；Weiner et al.，Cancer Res.，50421-425(1990)；Kern et al.，Cancer Res.，505184(1990)；Parket al.，Cancer Res.，496605(1989)；Zhau et al.，Mol.Carcinog.，3354-357(1990)；Aasland et al.，Br.J.Cancer，57358-363(1988)；Williams et al.，Pathiobiology，5946-52(1991)；和McCann et al.，Cancer，6588-92(1990)。ErbB2可能在前列腺癌中过度表达(Gu et al.，Cancer Lett.，99185-9(1996)；Ross et al.，Hum.Pathol.，28827-33(1997)；Ross et al.，Cancer，792162-70(1997)；和Sadasivan et al.，J.Urol.，150126-31(1993))。ErbB2的过度表达可能会通过不依赖于配基地激活ErbB2或ErbB2同型二聚体，引起肿瘤生长。
针对大鼠p185neu和人ErbB2蛋白质产物的抗体已经被描述。Drebin及其同事已经制备出抗大鼠neu基因产物p185neu的抗体。参见，例如Drebinet al.，Cell，41695-706(1985)；Myers et al.，Meth.Enzym.，198277-290(1991)；和W094/22478。Drebin et al.，Oncogene，2273-277(1988)报道，与p185neu的两个不同区域反应的抗体的混合物对被植入裸鼠的neu转化的NIH-3T3细胞产生协同的抗肿瘤作用。还参见1998年10月20日授权的美国专利5,824,311。
Hudziak等，Mol.Cell.Biol.，931165-1172(1989)描述了一系列抗ErbB2抗体的制备，采用人乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3对其进行鉴定。通过在72小时后对单细胞层进行结晶紫染色，测定了SK-BR-3细胞在暴露于抗体后的相对细胞增殖。采用这种测定法，用称为4D5的抗体获得最大抑制作用，其抑制了56％的细胞增殖。在该测定中，该系列的其他抗体在较小程度降低细胞增殖。还进一步发现抗体4D5能够使过度表达ErbB2的乳腺肿瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性作用变得敏感。还参见1997年10月14日授权的美国专利号5,677,171。在Hudziak et al中被讨论的抗ErbB2抗体还在Fendlyet al.，Cancer Research，501550-1558(1990)；Kotts et al.，In Vitro，26(3)59A(1990)；Sarup et al.，Growth Regulation，172-82(1991)；Shepard et al.，JClin.Immunol.，11(3)117-127(1991)；Kumar et al.，Mol.Cell Biol.，11(2)979-986(1991)；Lewis et al.，Cancer Immunol.Immunother.，37255-263(1993)；Pietras et al.，Oncogene，91829-1838(1994)；Vitetta et al.，CancerResearch，545301-5309(1994)；Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994)；Scott et al.，J.Biol.Chem.，26614300-5(1991)；D′souza etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，917202-7206(1994)；Lewis et al.，Cancer Research，561457-1465(1996)；和Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997)中被进一步表征。
重组的人源化鼠抗ErbB2抗体4D5(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2或HERCEPTIN；美国专利号5,821,337)在过度表达ErbB2的转移性乳腺癌的患者中具有临床活性，这些患者接受了广泛的预先抗癌治疗(Baselga et al.，J Clin Oncol.，14737-744(1996))。1998年9月25日HERCEPTIN获得美国食品和药品管理局的销售许可，用于治疗患有转移性乳腺癌的患者，其肿瘤过度表达ErbB2蛋白。但是，并不是所有的过度表达ErbB2的肿瘤都对HERCEPTIN响应。(Brockhoffet al.，Cytometry，44338-48(2001))。此外，临床前的数据暗示，HERCEPTIN对于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)是治疗上有效的。HER2蛋白在20-66％的被切除NSCLC肿瘤中过度表达，并且被证明在多个系列中预测不理想的患者结局(Azzoli，C.G.et al.，Semin.Oncol.，29(Suppl4)59-65(2002))。
其他具有各种性质的抗ErbB2的抗体已经被描述在Tagliabue et al.，Int.J.Cancer，47933-937(1991)；McKenzie et al.，Oncogene，4543-548(1989)；Maier et al.，Cancer Res.，515361-5369(1991)；Bacus et al.，MolecularCarciaogenesis，3350-362(1990)；Stancovski et al.，PNAS (USA)，888691-8695(1991)；Bacus et al.，Cancer Research，522580-2589(1992)；Xu et al.，Int.J.Cancer，53401-408(1993)；W094/00136；Kasprzyk et al.，CancerResearch，522771-2776(1992)；Hancock et al.，Cancer Res.，514575-4580(1991)；Shawver et al.，Cancer Res.，541367-1373(1994)；Arteaga et al.，Cancer Res.，543758-3765(1994)；Harwerth et al.，J.Biol.Chem.，26715160-15167(1992)；美国专利号5,783,186；和Klapper et al.，Oncogene，142099-2109(1997)中。单克隆抗体2C4在WO 01/00245中描述，在此引入作为参考。已经证明2C4破坏HER2与其他ErbB受体家族成员发生二聚化(WO 01/00245)。
同源性筛选已经鉴定了两种其他的ErbB受体家族成员；ErbB3(美国专利号5,183,884和5,480,968，以及Kraus et al.，PNAS(USA)，869193-9197(1989))和ErbB4(欧洲专利申请号599,274；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)；和Plowman et al.，Nature，366473-475(1993))。这两种受体在至少某些乳腺癌细胞系中均表现为表达增加。
ErbB受体通常以各种组合的形式存在于细胞内，并且一般认为异二聚化增加细胞对各种ErbB配基反应的多样性(Earp et al.，Breast CancerResearch and Treatment，35115-132(1995))。然而，这些受体聚集以及如何作用于信号传递的机制还未被充分了解(Brennan，P.J.et al.，Oncogene，196093-6101(2000))。EGFR被六个不同配基结合；表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGF-α)，双调蛋白，肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)，β-动物纤维素(betacellulin)和上皮调节素(epiregulin)(Groenen et al.，GrowthFactors，11235-257(1994))。由对单个基因的可变剪接得到的heregulin蛋白家族是ErbB3和ErbB4的配基。Heregulin家族包括α、β和γheregulin(Holmes et al.，Science，2561205-1210(1992)，美国专利号5,641,869；和Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997))；neu分化因子(NDF)，神经胶质生长因子(GGFs)；乙酰胆碱受体诱导活性(acetylcholine receptor inducingactivity)(ARIA)；以及感觉和运动神经元衍生因子(sensory and motor neuronderived factor)(SMDF)。综述参见Groenen et al.，Growth Factors，11235-257(1994)；Lemke，G.，Molec.&Cell.Neurosci.，7247-262(1996)和Lee etal.，Pharm.Rev.，4751-85(1995)。最近，三种其他的ErbB配基被鉴定；神经调节蛋白-2(neuregulin-2)(NRG-2)，其被报道能结合ErbB3或ErbB4(Chang etal.，Nature，387509-512(1997)；和Carraway et al.，Nature，387512-516(1997))；神经调节蛋白-3(neuregulin-3)，其结合ErbB4(Zhang etal.，PNAS(USA)，94(18)9562-7(1997))；和神经调节蛋白-4(neuregulin-4)，其结合ErbB4(Harari et al.，Oncogene，182681-89(1999))HB-EGF、β-动物纤维素和上皮调节素也结合ErbB4。
虽然EGF和TGFα不结合ErbB2，但是EGF刺激EGFR和ErbB2形成异二聚体，该异二聚体激活EGFR并导致ErbB2在异二聚体中发生转磷酸作用。二聚化和/或转磷酸作用似乎能够激活ErbB2酪氨酸激酶。参见Earpet al.，同上文。同样地，heregulin不与ErbB2结合，但是当ErbB3与ErbB2共表达时，形成一种活性信号传递复合物(Nagy et al.，Cytometry，32120-31(1998)。针对ErbB2的抗体能够破坏这一复合物(Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994))。ErbB3是酪氨酸激酶缺陷的，因此需要异二聚化，优选与ErbB2异二聚化，来具备信号转换能力。(Graus-Porta et al.，EMBO J.，161647-55(1995))。此外，当与ErbB2共表达时，ErbB3对heregulin(HRG)的亲合性增加至较高的亲合状态。还参见Levi et al.，Journal of Neuroscience，151329-1340(1995)；Morrissey et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921431-1435(1995)和Lewis et al.，Cancer Res.，561457-1465(1996)对于ErbB2-ErbB3蛋白质复合物的描述。实际上，ErbB2是EGFR和ErbB3的优选异二聚化伴侣。(Graus-Porta et al.，同上文)。如同ErbB3一样，ErbB4与ErbB2形成活性信号传递复合物(Carraway和Cantley，Cell，785-8(1994))。ErbB2与EGFR或ErbB3的配基依赖的异二聚化可能促进表达ErbB2的肿瘤的生长。
已经在来自原发性乳腺癌患者的肿瘤样本中和膀胱癌中研究了ErbB受体和heregulin的表达以及HER2的磷酸化状况(Esteva et al.，Pathol.Oncol.Res.，7171-177(2001)；Chow et al.，Clin.Cancer Res.，71957-1962(2001))。Thor et al.，J.Clin.Oncology，183230-3239(2000)，和DiGiovanna et al.，Cancer Res.，626667-6673(2002)已经报道了在乳腺癌中，通过Her2/neu的活跃信号传递与临床病理和患者结局之间的相关性。
发明概述一个方面，本发明涉及鉴定对用抗HER2抗体处理有响应的肿瘤的方法。优选地，该抗HER2抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基激活。在一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体2C4，更加优选为rhuMAb 2C4。
获得肿瘤样本，并检测该样本中是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物。当检测到这种复合物时，肿瘤被鉴定为对用抗HER2抗体的处理有响应。
在一个实施方案中，通过用抗HER2抗体免疫沉淀任何含有HER2的蛋白质复合物来检测是否存在复合物。然后被免疫沉淀的复合物与选自由抗HER3抗体、抗HER1抗体和抗HER4抗体组成的组的抗体接触，确定任何结合。如果确定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4的抗体结合到被免疫沉淀的复合物上，即检测到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4复合物。
在另一个实施方案中，通过将肿瘤样本与包含第一荧光团的抗HER2的抗体接触来检测是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物。然后将肿瘤样本与选自由抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗体组成的组的抗体接触，其中所述抗体包含第二荧光团。然后测定荧光共振能量转移来确定第一荧光团与第二荧光团是否十分接近。如果第一荧光团与第二荧光团被确定十分接近，则检测到存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物。
在还有另一个实施方案中，通过将肿瘤样本与第一结合化合物接触来检测是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物。第一结合化合物包含特异地结合HER2的第一靶向结合部分。第一靶向结合部分优选是抗HER2抗体或抗体片段。第一结合化合物进一步包括通过可裂解接头连接到第一个结合结构域的可检测部分。
将肿瘤样本与第二结合化合物接触。第二结合化合物优选包含特异地结合HER3或HER1或HER4和优选不结合HER2的第二靶向结合部分。在另一个实施方案中，第二结合化合物结合HER3或HER1，并且不结合HER2或HER4。在另一个实施方案中，第二靶向结合部分包含抗HER3或抗HER1或抗HER4的抗体或抗体片段。第二结合化合物被激活时能够断裂第一结合化合物的可裂解接头，从而当第一结合化合物与第二结合化合物十分接近时产生游离的可检测部分。当鉴定到存在游离的可检测部分时，确定存在HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4蛋白质复合物。在一个实施方案中，通过毛细管电泳确定是否存在游离的可检测部分。
在另一个实施方案中，第一结合化合物包含特异地结合HER1或HER3或HER4的第一靶向结合结构域，并且第二结合化合物包含特异地结合HER2的第二靶向结合结构域。
在还有一个实施方案中，通过评价ErbB受体磷酸化，例如通过免疫沉淀HER2蛋白质，接着通过蛋白质印迹免疫检测磷酸酪氨酸，检测HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物，以及所引起的HER2活化。
用于分析是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物的肿瘤样本优选从患有该肿瘤的患者中获得。该样本例如可以通过活组织检查获得。在另一个实施方案中，该样本通过纯化来自患者的循环的肿瘤细胞来获得。在还有另一个实施方案中，该样本在从患者身上摘除肿瘤的手术过程中获得。
在另一个实施方案中，肿瘤样本是从哺乳动物而不是最先发生该肿瘤的患者之外的哺乳动物中获得。优选地，该样本得自小鼠或另一种啮齿类动物。更加优选地，该肿瘤是异种移植的肿瘤。该异种移植的肿瘤优选通过将人的肿瘤碎片移植到小鼠或另一种啮齿类动物来制备。
在一个实施方案中，肿瘤是肺肿瘤，更加优选是非小细胞肺癌肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是乳腺肿瘤。
在另一个方面，本发明涉及检测对用抑制HER2与ErbB受体家族另一成员结合的抗体的处理有响应的肿瘤细胞的方法，包括步骤(a)提供包含HER2阳性肿瘤细胞的生物学样本；和(b)检测生物学样本中的ErbB受体的磷酸化，其中所述磷酸化表明肿瘤细胞对用抗体处理有响应。在一个实施方案中，检测ErbB2(HER2)受体的磷酸化。
如前所述，与HER2相关的其他成员是HER3、HER1和/或HER4，例如HER2和/或HER1。该方法还可以另外包含检测是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物的步骤，基本上如上所述。
在另一个方面，本发明还涉及用于预测被诊断具有HER2阳性肿瘤的受检者对用抑制HER2与ErbB受体家族的另一个成员结合的抗体处理的反应的方法，通过检测在得自该受检者的包含HER2阳性肿瘤细胞的生物样本中HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物的形成和/或ErbB受体的磷酸化。存在这种蛋白质复合物和/或所述磷酸化表明个体可能对用抗体处理有响应。在一个实施方案中，检测到ErbB2(HER2)受体的磷酸化表明受检者可能对用该抗体处理有响应。
在还有另一个实施方案中，本发明涉及通过检测受检者的循环的肿瘤细胞中的ErbB受体的磷酸化，鉴定对用抗HER2抗体处理有响应的受检者。存在这种磷酸化表明受检者可能对用抗HER2抗体的处理有响应。在一个实施方案中，检测ErbB2(HER2)磷酸化。在另一个实施方案中，受检者是人。在还有另一个实施方案中，该方法还包含用抗HER2抗体治疗受检者，优选使用rhuMAb 2C4。
在另一个方面，本发明提供一种制品，其包含含有结合HER2的抗体的容器和关于将该抗体施用给患有肿瘤的患者中的说明书。优选地，该肿瘤已经被确定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4异二聚体。
在一个实施方案中，该容器含有阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化的抗体。在另一个实施方案中，该容器含有单克隆抗体2C4，更加优选为rhuMAb 2C4。
在还有一个方面，本发明提供治疗患者的方法，包含给患者施用治疗有效量的结合HER2的抗体。优选地，该患者患有被确定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4异二聚体的肿瘤。
在一个实施方案中，抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化。在另一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体2C4，更加优选为rhuMAb 2C4。
在另一个方面，本发明提供治疗患者的方法，包含给患者施用治疗有效量的结合HER2的抗体。优选地，该患者患有被确定具有被磷酸化的ErbB受体的肿瘤。
在一个实施方案中，被磷酸化的ErbB受体是HER2。在另一个实施方案中，抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化。在另一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体2C3，更加优选为rhuMAb 2C4。
附图简介附

图1A和1B描述鼠单克隆抗体2C4的轻链可变区(VL)(附图1A)和重链可变区(VH)(附图1B)结构域的氨基酸序列比对(分别为SEQ ID No.1和2)，2C4的人源化形式574的VL和VH结构域(分别为SEQ ID No.3和4)以及人VL和VH的共有片段(humκ1，轻链κ亚群I；humIII，重链亚群III)(分别为SEQ ID No.5和6)。星号表示在2C4的人源化形式574和鼠单克隆抗体2C4之间或者在2C4的人源化形式574和人框架之间的差异。互补决定区(CDR)在括号内。
附图2A和2B表示在表达低水平/正常水平ErbB2的MCF7细胞(附图2A)和表达高水平的ErbB2的SK-BR-3细胞(附图2B)中，单克隆抗体2C4、HERCEPTIN抗体或抗EGFR抗体对heregulin(HRG)依赖的ErbB2与ErbB3结合的影响；参见下面的实施例2。
附图3是表明在来自非小细胞肺癌异种移植外植体的蛋白质提取物中存在HER1/HER2和HER2/HER3异二聚体的免疫印迹。
附图4是表明在来自非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植外植体的蛋白质提取物中存在HER2磷酸化的免疫印迹。
优选实施方案的详述本发明部分地基于对抗HER2抗体rhuMAb 2C4的响应与肿瘤细胞中存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和或HER2/HER4异二聚体、和/或ErbB受体磷酸化相关的试验发现。因此，基于存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4异二聚体、和/或ErbB受体磷酸化，肿瘤可以被鉴定为对用抗HER2抗体的处理有响应，特别是具有抗HER2抗体2C4的一种或多种生物学活性的抗HER2抗体。HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4异二聚体，和/或ErbB受体磷酸化可以通过本领域已知的任何方法来鉴定。通过鉴定对用抗HER2的抗体处理响应的特定肿瘤和肿瘤类型，可以鉴定将可能会从这种处理中最获益的患者。此外，还可以鉴定可能无法从使用单克隆抗体2C4的治疗中获益的患者。
定义“ErbB受体”是受体蛋白酪氨酸激酶，其属于ErbB受体家族，包括EGFR(ErbB1)、ERRP、ErbB2、ErbB3和ErbB4受体以及将来将被鉴定的该家族的其他成员。ErbB受体通常包含可能结合ErbB配基的细胞外结构域；亲脂性跨膜结构域；保守的细胞内酪氨酸激酶结构域；和具有多个可以被磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号传导结构域。ErbB受体可以是“天然序列”的ErbB受体或其“氨基酸序列变体”。优选地，ErbB受体是天然序列的人ErbB受体。因此，“ErbB受体家族成员”是EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3、ErbB4或任何其他目前已知或者将来将被鉴定的ErbB受体。优选地，该成员是EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3、或ErbB4。
术语“ErbB1”、“表皮生长因子受体”、“EGFR”和“HER1”在此被互换使用，是指被公开在如Carpenter et al.，Ann.Rev.Biochem.，56881-914(1987)中的EGFR，包括其天然存在的突变形式(例如Humphrey et al.，PNAS(USA)，874207-4211(1990)中的缺失突变EGFR)。erbB1是指编码EGFR蛋白产物的基因。抗HER1的抗体被描述在例如Murthy et al.，Arch.Biochem.Biophys.，252549-560(1987)和WO 95/25167中。
术语“ERRP”、“EGF受体相关蛋白”、“EGFR相关蛋白”和“表皮生长因子受体相关蛋白”在此被互换使用，是指公开在例如美国专利号6,399,743和美国公开号2003/0096373中的ERRP。
表达法“ErbB2”和“HER2”在此被互换使用，是指在例如Semba et al.，PNAS(USA)，826497-6501(1985)和Yamamoto et al.，Nature，319230-234(1986)(Genebank登录号X03363)中被描述的人HER2蛋白。术语“erbB2”是指编码人ErbB2的基因，而“neu”是指编码大鼠p185neu的基因。优选的ErbB2是天然序列的人ErbB2。
“ErbB3”和“HER3”是指如在美国专利号5,183,884和5,480,968以及Kraus et al.，PNAS (USA)，869193-9197(1989)中公开的受体多肽。抗ErbB3的抗体在本领域是已知的，被描述在例如美国专利号5,183,884、5,480,968和WO97/35885中。
术语“ErbB4”和“HER4”在此是指在如欧洲专利申请号599,274；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)和Plowman et al.，Nature，366473-475(1993)中所描述的受体多肽，包括其同种型，例如被公开在1999年4月22日公开的WO 99/19488中。抗HER4的抗体被描述在例如WO 02/18444中。
ErbB受体的抗体可以从许多地方购买得到，包括例如Santa CruzBiotechnology，Inc.，California，USA有限公司。
所用“ErbB配基”是指结合和/或激活ErbB受体的多肽。ErbB配基是天然序列的人ErbB配基，例如表皮生长因子(EGF)(Savage et al.，J.Biol.Chem.，2477612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt et al.，Science，2231079-1082(1984))；双调蛋白也称作雪旺氏瘤(schwanoma)或角质细胞自分泌生长因子(keratinocyte autocrine growth factor)(Shoyab et al.，Science，2431074-1076(1989)；Kimura et al.，Nature，348257-260(1990)；和Cook etal.，Mol.Cell.Biol.，112547-2557(1991))；β-动物纤维素(Shing et al.，Science，2591604-1607(1993)；和Sasada et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1901173(1993))；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama et al.，Science，251936-939(1991))；上皮调节素(Toyoda et al.，J.Biol.Chem.，2707495-7500(1995)；和Komurasaki et al.，Oncogene，152841-2848(1997))；heregulin(参见下面)；神经调节蛋白-2(NRG-2)(Carraway et al.，Nature，387512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，949562-9567(1997))；神经调节蛋白-4(NRG-4)(Harari et al.，Oncogene，182681-89(1999))或cripto(CR-1)(Kannan et al.，J.Biol.Chem.，272(6)3330-3335(1997))。结合EGFR的ErbB配基包括EGF、TGF-α、双调蛋白、β-动物纤维素、HB-EGF和上皮调节素。结合ErbB3的ErbB配基包括heregulin。能够结合ErbB4的ErbB配基包括β-动物纤维素、上皮调节素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和heregulin。ErbB配基还可以是合成的ErbB配基。合成的配基可以特异于特定的ErbB受体，或者能够识别特定的ErbB受体复合物。合成配基的一个例子是合成的heregulin/egf嵌合双调素(biregulin)(参见，例如Jones et al.，FEBS Letters，447227-231(1999)，在此引入作为参考)。
在此所用的“Heregulin”(HRG)是指由在美国专利号5,641,869或Marchionni et al.，Nature，362312-318(1993)中公开的heregulin基因产物所编码的多肽。Heregulin的例子包括heregulin-α、heregulin-β1、heregulin-β2和heregulin-β3(Holmes et al.，Science，2561205-1210(1992)；和美国专利号5,641,869)；neu分化因子(NDF)(Peles et al.，Cell，69205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls et al.，Cell，72801-815(1993))；神经胶质生长因子(GGF)(Marchionni et al.，Nature，362312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Ho et al.，J.Biol.Chem.，27014523-14532(1995))；γ-heregulin(Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997))。该术语包括天然序列的HRG多肽的生物学活性片段和/或氨基酸序列变体，例如其EGF样结构域片段(例如，HRGβ1177-244)。
“ErbB异低聚物”在此是包含至少两种不同ErbB受体的非共价结合的低聚体。“ErbB二聚体”是包含两种不同ErbB受体的非共价结合的低聚体。当表达两种或更多种ErbB受体的细胞被暴露于ErbB配基时，形成这种复合物。ErbB低聚体，例如ErbB二聚体，可以通过免疫沉淀来分离并通过例如在Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994)中描述的SDS-PAGE来分析。这种ErbB异低聚体的例子包括EGFR-ErbB2(也称作为HER1/HER2)，ErbB2-ErbB3(HER2/HER3)和ErbB3-ErbB4(HER3/HER4)复合物。此外，ErbB异低聚体可以包含两个或更多个与不同ErbB受体例如ErbB3、ErbB4或EGFR(ErbB1)结合的ErbB2受体。其他蛋白质，例如细胞因子受体亚单位(例如gpl30)可以被包括在异低聚体中。
“ErbB受体的配基活化”是指受结合到包含目的ErbB受体的ErbB异低聚体上的ErbB配基调节的信号转导(例如由ErbB受体的细胞内激酶结构域磷酸化ErbB受体或底物多肽中的酪氨酸残基所引起的)。一般地，这涉及ErbB配基结合到ErbB异低聚体上，激活异低聚体中的一个或多个ErbB受体的激酶结构域，从而导致一个或多个ErbB受体的中的酪氨酸残基发生磷酸化和/或在额外的底物多肽中的酪氨酸残基发生磷酸化。可以采用各种酪氨酸磷酸化分析来量化ErbB受体活化。
“天然序列”多肽是具有与来自自然界的多肽(例如ErbB受体或ErbB配基)相同的氨基酸序列的多肽。这种天然序列多肽可以从自然界中分离或者可以通过重组或合成方法制备。因此，天然序列的多肽具有天然发生的人多肽、鼠多肽或来自任何其他哺乳动物物种的多肽的氨基酸序列。
术语“氨基酸序列变体”是指具有在一定程度上与天然序列多肽有区别的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列变体将与天然ErbB配基的至少一个受体结合结构域或者与天然ErbB受体的至少一个配基结合结构域具有至少约70％同源性，和优选地至少约80％，更加优选地，与这种受体或配基结合结构域至少约90％同源。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的某些位点上具有取代、缺失和/或插入。
“同源性”被定义为在必要时进行序列比对和引入缺口以获取最大的百分比同一性后氨基酸序列变体中的相同残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域是已熟知的。一种这种计算机程序是“Align 2”，由Genentech，Inc.创作，已经在1991年12月10日在华盛顿，DC 20559，美国版权局与用户文档(user documentation)一起提交。
术语“抗体”在此以最广泛的意义被使用，特别地涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多重特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要其具有期望的生物学活性。
如在此所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同型的抗体的群体中获得的抗体，即包含群体的各个抗体除了以少量存在的可能天然发生的突变外，是相同的。单克隆抗体是高度特异的，针对单一的抗原位点。此外，与包含针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比的是，各个单克隆抗体针对抗原上的单一抗原决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体的优点在于可以不受其他抗体污染地被合成。修饰语“单克隆”表示从基本上同型的抗体群体中获得的抗体的特征，而不被解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，根据本发明将被使用的单克隆抗体可以通过最早由Kohler et al.，Nature，256495(1975)所描述的杂交瘤方法来制备，或者通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)来制备。还可以采用在例如Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
单克隆抗体在此特别地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或者属于特定的抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该链的剩余部分与来自另一物种或者属于另一抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或相似，以及这种抗体的片段，只要这些片段展示出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。在此的目的嵌合抗体包括含有衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴(Old World Monkey)，猿等)的可变结构域抗原结合序列和人的恒定区序列的“灵长类化”抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；微型双功能抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多重特异性抗体。
“完整的”抗体是包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1，CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列的恒定结构域(例如人天然序列的恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。
抗体的“效应子功能”是指那些可归结于抗体的Fc区域(天然序列的Fc区域或氨基酸序列变体的Fc区域)的生物学活性。抗体效应子功能的例子包括Clq结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。
根据重链的恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体抗原被分成不同“种类”。有五个主要的完整抗体的种类IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的部分还抗原进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、和IgA2。对应于不同抗体种类的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是已熟知的。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞的溶解。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达被总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92(1991)的第464页的表3中。为了评价目的分子的ADCC活性，进行例如在美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的体外ADCC分析。可用于这种分析的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选择地或者另外地，可以在体内评价目的分子的ADCC活性，例如在如Clynes et al.，PNAS(USA)，95652-656(1998)中披露的动物模型中。
“人的效应细胞”是白细胞，其表达一种或多种FcR并且行使效应子功能。优选地，该细胞至少表达FcγRIII并且行使ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；而PBMC和NK细胞是优选的。效应子细胞可以从其天然来源中分离，例如如在此描述地来自血液或PBMC。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述一种结合到抗体的Fc区域的受体。优选的FcR是人FcR的天然序列。此外优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRII A(“活化受体”)和FcγRII B(“抑制受体”)，具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。活化受体FcγRII A在其胞质结构域中含有一个以免疫受体酪氨酸为基础的活化基序(an immunoreceptor tyrosine-based activationmotif)(ITAM)。抑制受体FcγRII B在其胞质结构域中含有一个免疫受体酪氨酸为基础的抑制基序(an immunoreceptor tyrosine-based inhibitionmotif)(ITIM)。(参见综述，M.Daeron，Annu.Rev.Immunol.，15203-234(1997))。FcR在Ravetch和Kinet，Anne.Rev.Immunol.，9457-92(1991)；Capel et al.，，Immunomethods，425-34(1994)；和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.，126330-41(1995)中被评述。其他的FcR，包括将来将被鉴定的那些，都被包含在此处的术语“FcR”中。该术语还包括新生儿的受体，FcRn，其负责将母体的IgG转运到胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.，117587(1976)和Kim et al.，J.ImmunoL，24249(1994))。
“补体依赖的细胞毒性”或者“CDC”是指存在补体时，分子溶解靶点的能力。补体活化路径由补体系统的第一组分(Clq)结合到与关联抗原复合的分子(例如，一种抗体)上起始。为了评价补体活化，可进行如在Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods，202163(1996)中描述的CDC分析。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的异四聚糖蛋白。每条轻链通过共价二硫键连接到重链上，而且二硫键的数量随着不同免疫球蛋白同种型的重链而变化。每条重链和轻链还具有规则的间隔的链内二硫键。每条重链在其一端具有可变结构域(VH)，随后是大量的恒定结构域。每条轻链在其一端具有可变结构域(VL)，并在另一端具有恒定结构域。轻链的恒定结构域对准(align)重链的第一个恒定结构域，而轻链的可变结构域对准重链的可变结构域。一般认为，特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成一个界面。
术语“可变的”是指可变结构域的某些部分在抗体的序列中广泛地变化，被用于每一特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。但是，可变性不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。其集中在轻链和重链可变结构域上的称为高变区(hypervariable region)的三个片段上。可变结构域的更加高度保守部分称作骨架区(framework region)(FR)。天然重链和轻链的可变结构域每个都包含四个FR，大部分采用β片层构型，由三个高变区连接，形成环状连接，有时形成β片层结构的一部分。各条链中的高变区通过FR被紧密地固定在一起，并与其他链的高变区一起导致抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins ofimmunological Interest)，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与将抗体与抗原的结合，但是具有各种效应子功能，例如参与抗体在抗体依赖的细胞毒性(ADCC)中的作用。
当用于本文时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，以及重链可变结构域中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.，具有免疫学意义的蛋白质的序列，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变区环”(“hypervariable loop”)的那些残基(例如轻链可变结构域中的残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901-917(1987))。“骨架区”或“FR”残基是那些如在此所定义的高变区残基之外的可变结构域残基。
木瓜蛋白酶消化抗体生成两种相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，每个片段具有一个单一的抗原结合位点和残余的“Fc”片段，其名称反映其很容易结晶的能力。胃蛋白酶处理生成具有两抗原结合位点的F(ab′)2片段，并且仍能够与抗原交联。
“Fv”是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和抗原结合位点。该区域由以紧密和非共价连接的由一条重链和一个轻链可变结构域组成的二聚体组成。是在这一构型中，各个可变结构域的三个高变区相互作用来确定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总的来说，六个超变区将抗原结合特异性赋予给抗体。但是，即使是单个可变结构域(或者仅包含三个特异于抗原的高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，虽然其亲合性低于完整结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同在于在重链CH1结构域的羧基端增加少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在此是指恒定结构域中的半胱氨酸残基带有至少一个游离巯基的Fab′。F(ab′)2抗体片段最初以一对之间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段生成。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
根据恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”被划归入两种明显区别的种类之一，称作kappa(κ)和lambda(λ)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域在单一的多肽链中存在。优选地，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，使scFv形成期望的抗原结合结构。对scFv的综述，参见Plückthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113中的文章，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，269-315(1994)。抗ErbB2抗体的scFv片段被描述在WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458中。
术语“微型双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-VL)上连接到可变轻链结构域(VL)的可变重链结构域(VH)。通过使用接头，该接头非常之短，以致于无法使同一链上的两个结构域配对，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。微型双功能抗体在例如EP404，097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中被更充分地描述。
非人(例如啮齿类动物)抗体的“人源化”形式是含有来自非人类的免疫球蛋白的最短序列的嵌合抗体。人源化抗原的大部分是人的免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自具有期望特异性、亲合性和能力的非人类物种的高变区(供体抗体)的残基替代，非人类物种例如小鼠、大鼠、兔或非人类的灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的骨架区(FR)残基被相应的非人类的残基替代。此外，人源化抗体可能包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰来进一步改善抗体性能。一般地，人源化抗体将包含至少一个，和典型地两个可变结构域的基本上全部，其中对应于非人类的免疫球蛋白的高变区环的全部或基本上全部和FR的全部或基本上全部是人的免疫球蛋白序列的那些部分。人源化抗体可选择地还包含至少免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。更加详细的描述，参见Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
人源化的抗ErbB2的抗体包括在美国专利号5,821,337的表3中描述的huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，在此明确引入作为参考；在下面描述的人源化520C9(WO 93/21319)和人源化2C4抗体。
“分离的”抗体是从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是妨碍该抗体的诊断或治疗用途的物质，可能包括酶、激素和其他蛋白的或非蛋白溶解物。在优选实施方案中，抗体被纯化(1)如通过Lowry方法所测定的，至超过95％的抗体重量，最优选重量超过99％，(2)以达到足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个N-末端残基或内在氨基酸序列的程度，或(3)以在还原或非还原条件下采用考马斯兰或者优选银染通过SDS-PAGE测定达到均一性。被分离的抗体包括在重组细胞中的原位抗体，这是由于抗体天然环境中的至少一个组分将不存在。但是，一般地，被分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
“结合”目的抗原例如ErbB2抗原的抗体，是能够以足够的亲合性结合该抗原使得该抗体可用于靶向表达该抗原的细胞的抗体。如果抗体是结合ErbB2的抗体，该抗体通常将优先地结合ErbB2而不是其他ErbB受体，并且是不会显著地与其他蛋白例如EGFR，ErbB3或ErbB4交叉反应的抗体。在这样的实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)，抗体与这些非ErbB2蛋白质的结合程度(例如与内源受体的细胞表面结合)将小于10％。有时，抗ErbB2的抗体不会显著地与大鼠neu蛋白发生交叉反应，例如在Schecter et al.，Nature，312513(1984)和Drebin et al.，Nature，312545-548(1984)中所描述。
阻断ErbB受体的配基活化的抗体是降低或阻止上文定义的这种活化的抗体，其中该抗体实质上能够比单克隆抗体4D5更加有效地阻断ErbB受体的配基活化，例如，与单克隆抗体7F3或2C4或其Fab片段大约一样有效，和优选地与单克隆抗体2C4或其Fab片段大约一样有效。例如，阻断ErbB受体的配基活化的抗体是在阻断ErbB异低聚体形成上比4D5有效约50-100％的抗体。阻断ErbB受体的配基活化可以通过任何手段发生，例如，通过干扰配基结合ErbB受体、ErbB复合物形成、ErbB复合物中ErbB受体的酪氨酸激酶活性和/或ErbB中或者通过ErbB受体的酪氨酸激酶残基的磷酸化。阻断ErbB受体的配基活化的抗体的例子包括单克隆抗体2C4和7F3(其阻断ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4异低聚体的HRG活化；和EGFR/ErbB2异低聚体的EGF，TGF-α，双调蛋白，HB-EGF和/或上皮调节素活化)；和L26，L96和L288抗体(Klapper et al.，Oncogene，142099-2109(1997))，其阻断EGF和NDF结合到表达EGFR，ErbB2，ErbB3和ErbB4的T47D细胞上。
具有指定抗体例如称作2C4的单克隆抗体的“生物学特征”的抗体，是具有一种或多种使其区别于结合到相同抗原(例如ErbB2)上的其它抗体的生物学特征的抗体。例如具有2C4的生物学特征的抗体，可能阻断包含ErbB2和ErbB3，ErbB1或ErbB4的ErbB异低聚体的HRG活化；阻断包含EGFR和ErbB2的ErbB受体的EGF，TGF-α，HB-EGF，上皮调节素和/或双调蛋白的活化；阻断MAPK的EGF，TGF-α和/或HRG介导的活化；和/或结合到ErbB2的细胞外结构域的被2C4结合的相同表位上，(例如阻断单克隆抗体2C4结合到ErbB2上的抗体)。
除非另外指出，用语“单克隆抗体2C4”是指具有下面的实施例的鼠2C4抗体的抗原结合残基的或衍生自该鼠2C4抗体的抗体。例如，单克隆抗体2C4可以是鼠单克隆抗体2C4或其变体，例如人源化抗体2C4，具有鼠单克隆抗体2C4的抗原结合氨基酸残基。人源化2C4抗体的例子在本文和WO 01/00245中提供，WO 01/00245在此全文引入作为参考。除非另外指出，在此所用的用语“rhuMAb 2C4”是指包含被融合到任选由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达的人轻链和重链IgGl(非A同种异型)恒定区序列的，分别为SEQ ID No.3和4的可变轻链(VL)和可变重链(VH)序列的抗体。
除非另外指出，术语“单克隆抗体4D5”是指具有鼠4D5抗体(ATCC CRL10463)的抗原结合残基的或者衍生自该抗体的抗体。例如，单克隆抗体4D5可以是鼠单克隆抗体4D5或其变体，例如具有鼠单克隆抗体4D5的抗原结合残基的人源化4D5。示例性的人源化4D5抗体包括在美国专利号5,821,337中的huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，huMAb4D5-8(HERCEPTIN)是优选的人源化4D5抗体。
“生长抑制剂”用于此是指在体外或体内抑制细胞，特别是表达ErbB的癌细胞的生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂是在S期显著降低表达ErbB的细胞的比例的试剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(在S期之外的地方)的试剂，例如诱导G1停滞和M期停滞的试剂。经典M期阻断剂包括长春花碱(vincas)(长春新碱和长春碱)，紫杉烷二萜(taxane)，和II型拓扑抑制剂，例如阿霉素，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素，依托泊苷(etoposide)和博莱霉素。那些阻滞G1期的试剂还延伸到S期阻滞，例如DNA烷基化试剂例如三苯氧胺，强的松，氮烯米胺(dacarbazine)，双氯乙基甲胺，顺铂，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。更加详细的信息可见“癌症的分子基础”，Mendelsohn和Israel编辑，第1章，由Murakami等编写的标题为“细胞周期调控，癌基因和抗肿瘤药”，(WB SaundersPhiladelphia，1995)，特别是第13页。
“生长抑制”的抗体的例子是那些结合到ErbB2并且抑制过度表达ErbB2的癌细胞生长的抗体。优选的生长抑制抗ErbB2的抗体以大约0.5-30μg/ml的抗体浓度抑制细胞培养物中20％以上的SK-BR-3乳腺癌细胞的生长，优选超过50％(例如从约50％到约100％)，其中生长抑制作用是在将SK-BR-3细胞暴露于抗体6天后测定的(参见1997年10月14日授权的美国专利号5,677,171)。SK-BR-3细胞生长抑制分析在该专利和下面中被更加详细地描述。优选的生长抑制抗体是单克隆抗体4D5，例如人源化的4D5。
“诱导细胞死亡”的抗体是使活细胞不能存活的抗体。细胞通常是表达ErbB2受体的细胞，特别地该细胞过度表达ErbB2受体。优选地，该细胞是癌细胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、大肠、甲状腺、胰腺或膀胱细胞。在体外，细胞可以是SK-BR-3，BT474，Calu 3细胞，MDA-MB-453，MDA-MB-361或SKOV3细胞。可以通过在缺乏补体和免疫效应细胞的情况下测定体外细胞死亡，来区分由抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)或由补体依赖的细胞毒性(CDC)引起的细胞死亡。因此，可以采用加热灭活血清(即缺乏补体)和缺乏免疫效应细胞时进行细胞死亡的分析。为了确定抗体是否能够诱导细胞死亡，可以相对于未被处理的细胞评价膜完整性的缺失，通过碘化丙锭(PI)、台盼兰(参见Moore et al.，Cytotechnology，171-11(1995))或7AAD的摄取来评价膜完整性的丧失。优选的诱导细胞死亡的抗体是那些在BT474细胞中在PI摄取分析试验中诱导PI摄取的抗体(参见下文)。
“诱导凋亡”的抗体是那些诱导细胞程序性死亡的抗体，由膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网扩张、细胞破裂和/或膜泡形成(称作凋亡小体)确定细胞程序性死亡。细胞通常是过度表达ErbB2受体的细胞。优选地，细胞是肿瘤细胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、大肠、甲状腺、胰腺或膀胱细胞。在体外，细胞可以是SK-BR-3，BT474，Calu 3细胞，MDA-MB-453，MDA-MB-361或SKOV3细胞。有多种方法可用于评价与凋亡相关的细胞事件。例如，通过膜联蛋白结合检测磷脂酰丝氨酸(PS)的转移；通过DNA梯(laddering)评价DNA断裂；并且核/染色质浓缩以及DNA断裂可通过亚二倍体细胞中的任何增加来评价。优选地，诱导凋亡的抗体是在BT474细胞的膜联蛋白结合分析中，引起相对于未处理细胞约2-50倍，优选约5-50倍，和最优选约10-50倍的膜联蛋白结合的诱导(见下文)。有时，前凋亡抗体(pro-apoptotic antibody)是还会进一步阻断ErbB受体的ErbB配基活化的抗体(例如7F3抗体)；即与单克隆抗体2C4具有共同生物学特征的抗体。在其他情形下，抗体是不会显著地阻断ErbB受体的ErbB配基活化的抗体(例如7C2)。此外，抗体是如7C2的抗体，其在诱导凋亡时，不诱导在S期的细胞百分率的大量减少(例如相对于对照，仅诱导这些细胞的百分率的0-10％的减少)。
“表位2C4”是抗体2C4结合的ErbB2的细胞外结构域中的区域。为了筛选结合2C4表位的抗体，可以进行常规的交叉阻断分析，例如在“抗体，实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和DavidLane(1988)”中描述的分析。此外，可进行表位作图来评价抗体是否结合到ErbB2的2C4表位上(例如，ErbB2的从约残基22到约残基584中的任何一个或多个残基，包括残基22和残基584；参见附图1A-B)。
“表位4D5”是抗体4D5(ATCC CRL 10463)结合的ErbB2的细胞外结构域中的区域。该表位邻近ErbB2的跨膜结构域。为了筛选结合4D5表位的抗体，可以进行常规的交叉阻断分析，例如在“抗体，实验室手册，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)”中描述的分析。此外，可进行表位作图来评价抗体是否结合到ErbB2的4D5表位上(例如，从约残基529到约残基625中的任何一个或多个残基，包括残基529和残基625；参见附图1A-B)。
“表位3H4”是抗体3H4结合的ErbB2的细胞外结构域中的区域。该表位包括在ErbB2的细胞外结构域中的氨基酸序列中的从约541到约599的残基，包括残基541和残基599，参见附图1A-B。
“表位7C2/7F3”是在ErbB2的细胞外结构域的N末端的区域，被7C2和/或7F3抗体(都保藏在ATCC中，见下文)结合。为了筛选结合到7C2/7F3表位的抗体，可以进行常规的交叉阻断分析，例如在“抗体，实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)”中描述的分析。此外，可以进行表位作图来确定该抗体是否结合到ErbB2上的7C2/7F3表位上(例如，在ErbB2的约残基22到约残基53的区域上的任何一个或多个残基；参见附图1A-B)。
用于处理目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人，家养动物和役使动物，和动物园、比赛、或宠物动物，例如狗、马、猫、奶牛等。优选，该哺乳动物是人。
“对处理有响应”的肿瘤在公认的动物模型或人临床试验中，表现出对抗ErbB的抗体处理的响应相对于与未处理或用安慰剂处理具有统计学上意义的显著改善，或者对抗ErbB的抗体的最初处理有响应，但是继续处理时仍然生长。
术语“处理”(treat)或“处理”(treatment)是指治疗性处理和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的在于防止或减缓(减轻)不期望的生理变化或紊乱，例如癌症发生或扩散。对于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括，但是不限于，无论是可检测的或不可检测的，症状缓和，疾病程度降低，疾病状态稳定(即，未恶化)，延迟或减缓疾病进展，改善或减轻疾病状态，和消除(无论部分地或完全地)。“处理”还指相对于未接受处理的预期存活时间，延长存活。那些需要处理的包括那些已经患有病症或者紊乱的以及那些倾向于患有病症或者紊乱的或者那些其中这些病症或紊乱将被预防的。
“紊乱”是将从本发明的处理中获益的任何病症。这包括慢性和急性的病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所述紊乱的病理症状。在此将被处理的紊乱的非限制性例子包括良性和恶性肿瘤；白血病和淋巴恶性肿瘤，特别是乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、大肠、甲状腺、胰腺、前列腺或膀胱癌；神经元的、神经胶质的、星形胶质的、下丘脑的和其他腺体、巨噬细胞的、上皮的、基质的和囊胚的紊乱；和炎症性的、血管生成的和免疫学的紊乱。按照本发明的将被处理的优选紊乱是恶性肿瘤。
术语“治疗有效量”是指足以有效治疗哺乳动物中的疾病或紊乱的药物含量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可能减少癌细胞的数量；降低肿瘤的大小；抑制(即减缓到一定程度和优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即减缓到一定程度和优选阻止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与癌症相关的症状。在药物可能阻止生长和/或杀死存在的癌症细胞的程度上，它可以是抑制细胞性的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，例如可以通过估计疾病进展时间(TTP)和/或测定反应率(RR)来测量效率。
术语“癌症”和“癌症的”是指或者描述哺乳动物中的一种生理状态，其典型特征在于不受调控的细胞生长。“肿瘤”包含一种或多种癌细胞。癌症的例子包括，但是不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这种癌症的更加特别的例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)，肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃的或胃癌包括胃肠癌，胰腺癌，恶性胶质瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾脏或肾的癌，前列腺癌，阴门癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，以及头部和颈部癌。
“表达ErbB的癌症”是包含细胞表面存在ErbB蛋白的细胞的癌症。“表达ErbB2的癌症”是在其细胞表面生成足够水平ErbB2的癌症，使得抗ErbB2的抗体可以结合到那里并对该癌症具有治疗作用。
“特征在于过度活化”ErbB受体的癌症是在癌症细胞中ErbB受体活化的程度显著超过该受体在相同组织类型的非癌症细胞中的活化水平的癌症。这种过度活化可能由ErbB受体的过度表达、和/或在癌症细胞中可用于激活ErbB受体的ErbB配基高于正常水平所导致的。这种过度活化可能引起癌细胞的恶性状况和/或由癌细胞的恶性状态引起。在一些实施方案中，对癌症进行诊断或预测分析来确定是否发生会导致ErbB受体的这种过度活化的ErbB受体的增殖和/或过度表达。可选择地，或另外地，对癌症进行诊断或预测分析来确定癌症中是否发生会导致受体过度活化的ErbB配基的扩增和/或过度表达。在这种癌症的亚群中，受体的过度活化可能源自自分泌刺激路径。
在“自分泌”刺激路径中，通过既生成ErbB配基也生成其关联ErbB受体的癌症细胞发生自我刺激。例如，癌症可能表达或过度表达EGFR，以及还表达或过度表达EGFR配基(例如，EGF，TGF-α或HB-EGF)。在另一个实施方案中，癌症可能表达或过度表达ErbB2，以及表达或过度表达heregulin(例如γ-HRG)。
“过度表达”ErbB受体的癌症是相对于相同组织类型的非癌症细胞，在该细胞表面上具有显著较高水平的ErbB受体，例如ErbB2。这种过度表达可能通过基因扩增或通过转录或翻译增强而引起。ErbB受体过度表达可以通过评价存在于细胞表面的ErbB蛋白质水平的升高在诊断或预测分析中被确定(例如通过免疫组织化学分析；IHC)。可选择地或另外地，可以测量细胞中编码ErbB的核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公开的WO 98/45479)，DNA印迹，或聚合酶链式反应(PCR)技术，例如实时定量PCR(RT-PCR)。可以通过评价患者中，例如肿瘤活组织检查中的配基水平(或者编码其的核酸)，或通过各种诊断分析例如IHC，FISH，DNA印迹，PCR或上述的体内分析来诊断性地确定ErbB配基的过度表达。还可以检测生物学液体例如血清中的脱落抗原(shed antigen)(例如ErbB的细胞外结构域)来研究ErbB受体的过度表达(参见例如1990年6月12日授权的美国专利号4,933,294；1991年4月18日公开的WO 91/05264；1995年3月28日授权的美国专利号5,401,638；和Sias et al.，J.Immunol.Methods，13273-80(1990))。除了上述分析，各种其他的体内分析对熟练技术人员来说是可获得的。例如，可以将患者体内的细胞暴露于抗体，该抗体可选择地用可检测标记，例如放射性同位素标记，并可以评价抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或者通过分析从预先暴露于抗体的患者中获得的活组织检查。
过度表达HER2的肿瘤可以通过对应于每个细胞表达的HER2分子的拷贝数的免疫组织化学分值来估计，可以从生物化学上测定0＝0-10,000拷贝/细胞，1+＝至少约200,000拷贝/细胞，2+＝至少约500,000拷贝/细胞，3+＝至少约2,000,000拷贝/细胞。水平为3+的HER2的过度表达会引起酪氨酸激酶发生不依赖于配基的活化(Hudziak et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847159-7163 )，在大约30％的乳腺癌中发生，并且在这些患者中，不复发存活和总存活下降(Slamon et al.，Science，244707-712 ；Slamonet al.，Science，235177-182 )。
相反，“不具有ErbB2受体过度表达特征”的癌症是在诊断性分析中与相同组织类型的非癌症细胞相比不表达高于正常ErbB2受体水平的ErbB2受体的癌症。
“不依赖于激素”的癌症是其增殖不依赖于与由癌症中细胞表达的受体结合的激素存在与否。在施用降低肿瘤中或附近的激素浓度的药物或手术方案时，这种癌症不会发生临床退化。不依赖于激素的癌症的例子包括不依赖于雄激素的前列腺癌，不依赖于雌激素的乳腺癌，子宫内膜癌和卵巢癌。这种癌症可能开始于激素依赖的肿瘤，并在抗激素治疗后由激素敏感阶段发展到激素难治的肿瘤。
如在此所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的一种物质。该术语想要包括放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素)，化学治疗剂，和毒素例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
“化学治疗剂”是在癌症治疗中有用的化学化合物。化学治疗剂的例子包括烷基化剂例如三胺磷和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐例如白消安，二丙胺磺酯和哌泊舒凡；氮丙啶例如苄替哌(benzodopa)，卡巴醌(carboquone)，四甲尿烷亚胺(meturedopa)，和乌瑞替哌(uredopa)；氮丙啶methylamelamine和包括六甲嘧胺(altretamine)，曲他胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，塞替哌(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥例如苯丁酸氮芥，萘氮芥(chlomaphazine)，cholophosphamide，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸甲氧氮芥，苯丙氨酸氮芥，新氮芥，苯芥胆固醇，松龙苯芥(prednimustine)，三芥环磷酰胺，尿嘧啶芥；亚硝基脲(nitrosurea)例如亚硝基脲氮芥，氯脲霉素，福泰氮芥(fotemustine)，罗莫司丁(lomustine)，尼莫司啶(nimustine)，雷尼司啶(ranimustine)；抗生素例如阿克拉霉素，放射菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，cactinomycin，加利车霉素，carabicin，洋红霉素，嗜癌菌素(carzinophilin)，色霉素，放线菌素D，柔红霉素，二乙氧醋酰阿霉素，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，表柔比星，去羟阿霉素，伊达比星，麻西罗霉素，丝裂菌素，霉酚酸，诺加拉霉素，橄榄霉素，培来霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，quelamycin，rodorubicin，链黑菌素，链脲霉素，杀结核菌素，百士欣，新制癌素，佐柔比星；抗代谢物例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸，氨甲蝶呤，蝶酰三谷氨酸，曲美沙特；嘌呤类似物例如氟达拉宾(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫唑鸟嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如环胞苷(ancitabine)，氮杂胞苷(azacitidine)，6-氮杂尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他宾(enocitabine)，氟尿嘧啶脱氧核苷(floxuridine)，5-FU；雄性激素例如卡鲁睾酮，羟甲雄酮丙酸酯，环硫雄醇(epitiostanol)，甲环硫甾烷，睾内脂(testolactone)；抗肾上腺素例如氨基苯乙哌啶酮，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充物例如frolinic acid；醋葡内酯；aldophosphamide glycoside；氨基乙酰丙酸；胺苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比山群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；脱羰秋水仙碱(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；醋酸羟哔咔唑；环氧甘醚；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；丙米腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹达谋(mopidamol)；二胺硝吖啶；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；足叶草肼；2-足叶草肼；甲基苄肼；PSK；丙亚胺(razoxane)；西作非兰；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯乙胺；氨基甲酸乙酯(urethan)；长春地辛(vindesine)；氮烯米胺；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；三胺硫磷；紫杉烷二萜(taxane)，例如泰素(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他赛(docetaxel)(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂(carboplatin)；长春碱；铂；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂菌素C；米托蒽醌；长春新碱；失碳长春碱(vinorelbine)；异长春花碱(navelbine)；盐酸米托蒽醌；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊本膦酸钠(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨(capecitabine)；以及任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在该定义中还包括的是作为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素试剂，例如抗雌激素，包括例如三苯氧胺，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶(aromatase)抑制性4(5)-咪唑，4-羟基三苯氧胺，曲奥昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奥那斯酮(onapristone)，和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄性激素的例如氟他胺(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡鲁胺(bicalutamide)，利普安(leuprolide)和性瑞林(goserelin)及其任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
如在此所用，术语“靶向EGFR的药物”是指结合到EGFR和任选地抑制EGFR活化的治疗剂。这种试剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合到EGFR的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb455(ATCC CRL HB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL8509)(参见美国专利4,943,533，Mendelsohn等)及其变体，例如嵌合的225(C225或Cetuximab；ERBUTIX)和改造的人225(H225)(参见WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；结合II型突变EGFR的抗体(美国专利5,212,290)；结合EGFR的人源化的和嵌合的抗体被描述在美国专利5,891,996；以及结合EGFR的人抗体，例如ABX-EGF(参见WO 98/50433，Abgenix)。抗EGFR的抗体可以与细胞毒性剂偶联，从而产生一种免疫偶联物(参见，例如EP659，439A2，Merck Patent GmbH)。结合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)，CP-358774(TARCEVATM；Genentech/OSI)和AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)。
“酪氨酸激酶抑制剂”是在一定程度上抑制酪氨酸激酶例如ErbB受体的酪氨酸激酶活性的分子。这种抑制剂的例子包括在前面的段落中指出的靶向EGFR的药物以及喹唑啉，例如PD153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉，吡啶并嘧啶(pyridopyrimidines)，嘧啶并嘧啶(pyrimidopyrimidines)，吡咯并嘧啶(pyrrolopyrimidines)，例如CGP 59326，CGP 60261和CGP 62706，和吡唑啉酮嘧啶(pyrazolopyrimidines)，4-(苯胺)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，姜黄色素(二阿魏酰甲烷，4，5-二(4-氟苯胺基)苯邻二甲酰亚胺)，含有硝基噻吩成分的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如，那些结合到编码ErbB的核酸上的分子)；喹喔啉(美国专利5,804,396)；tryphostins(美国专利5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛-ErbB抑制剂例如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；Imatinibmesylate(Gleevac；Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxanib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或在任何下列专利申请中描述的美国专利5,804,396；WO 99/09016(AmericanCyanimid)；WO 98/43960(American Cyanamid)；WO 97/38983(WarnerLambert)；WO 99/06378(Warner Lambert)；WO 99/06396(Warner Lambert)；WO 96/30347(Pfizer，Inc)；WO 96/33978(Zeneca)；WO 96/3397(Zeneca)；和WO 96/33980(Zeneca)。
“抗血管生成剂”是指阻断或在一定程度上干扰血管发育的化合物。抗血管生成的因子例如可以是结合到参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体上的小分子或抗体。优选的抗血管生成的因子在此是一种结合到血管内皮生长因子(VEGF)上的抗体。
术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放并作为细胞间的介体作用于另一种细胞的蛋白质的通称。这种细胞因子的例子为淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。在细胞因子中所包括的有生长激素例如人生长激素，N-甲硫氨酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促滤泡激素(FSH)，促甲状腺素(TSH)，和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；米勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素例如干扰素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)例如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；肿瘤坏死因子例如TNF-α或TNF-β；和其他的多肽因子包括LIF和试剂盒配基(kitligand)(KL)。如在此所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列的细胞因子的生物活性等价物。
用在本申请中的术语“前体药物”是指药学活性物质的前体或衍生物形式，其相对于亲本药物(parent drug)对肿瘤细胞的细胞毒性较小，能够被酶催化激活或者被转化为更有活性的亲本药物形式。参见，例如Wilman，“癌症化学治疗中的前体药物”Biochemical Society Transactions，14，375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“前体药物用于靶向药物递送的化学方法”，Directed Drug Delivery，Borchardt等编辑，247-267，Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括，但是不限于可以被转化为更有活性的无细胞毒性的药物的，含有磷酸盐的前体药物，含有硫代磷酸盐的前体药物，含有硫酸盐的前体药物，含有肽的前体药物，D-氨基酸修饰的前体药物，糖基化的前体药物，含有β-内酰胺的前体药物，含有任选被取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或者含有可选择地被取代的苯基乙酰胺的前体药物，5-氟胞嘧啶以及其他的5-氟尿嘧啶药物前体。可以被衍生为前体药物形式用于本发明的细胞毒性药物的例子包括，但是不限于那些上面描述的化学治疗剂。
“脂质体”是由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小泡，其可被用于将药物(例如在此公开的抗ErbB2的抗体和，任选地化学治疗剂)递送给哺乳动物。脂质体的组分通常以双分子层的结构排列，类似于生物膜的脂排列。
术语“包装插入物(package insert)”是用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用方法、禁忌征候的信息和/或关于使用该治疗性产品的警告。
“心脏防护剂”是一种防止或减少与给患者施用药物相关的心肌机能障碍(即心肌病和/或充血性心力衰竭)的化合物或组合物，这些药物例如蒽环霉素抗生素和/或抗ErbB2的抗体。心脏防护剂可能例如阻断或降低自由基介导的心脏毒性作用和/或防止或减少氧化应激损伤。包括在本定义中的心脏防护剂的例子包括铁离子螯合剂右丙亚胺(ICRF-187)(Seifert et al.，TheAnnals of Pharmacotherapy，281063-1072(1994))；降脂剂(lipid-loweringagent)和/或抗氧化剂例如丙丁酚(Singal et al.，J.Mol.Cell Cardiol.，271055-1063(1995))；阿米斯丁(氨基硫羟基2-[(3-氨丙基)氨基]乙硫醇-二氢磷酸酯，也称作WR-2721，及其脱磷酸化的细胞摄取形式称作WR-1065)和S-3-(3-甲氨基丙氨基)丙基硫代磷酸(WR-151327)，参见Green et al.，CancerResearch，54738-741(1994)；地高辛(Bristow，M.R.在Bristow MR，编辑.药物诱导的心脏病.纽约Elsevier 191-215(1980))；β-阻断剂例如美托洛尔(Hjalmarson et al.，Drugs47Suppl 431-9(1994)；和Shaddy et al.，Am.Heart J.，129197-9(1995))；维生素E；抗坏血酸(维生素C)；自由基清除剂例如石竹素，乌索酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；自旋捕获化合物例如α-苯基-叔-丁基硝酮(PBN)；(Paracchini et al.，Anticancer Res.，131607-1612(1993))；硒代有机化合物例如P251(Elbesen)；等。
“被分离的”核酸分子是从至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离出的核酸分子，在该抗体核酸分子的天然来源中，该分子通常与污染物核酸分子结合在一起。被分离的核酸分子不再是其在自然界中存在的形式或状态。因此，被分离的核酸分子区别于存在于天然细胞中的核酸分子。但是，被分离的核酸分子包括被包含在通常表达抗体的细胞中的核酸分子，在这样的细胞中，例如，核酸分子位于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置上。
用语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达被可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的调控序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一种核酸序列处于一种功能性关系中时，被“可操纵地连接”。例如，如果用作前序列或分泌前导序列的DNA作为参与多肽分泌的蛋白前体被表达，则被可操纵地连接到表达多肽的DNA上；如果启动子或增强子影响序列的转录，则被可操作地连接到编码序列上；或者如果核糖体结合位点被放置在促进翻译的位置上，则其被可操作地连接到编码序列上。一般地，“被可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在为分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读状态。但是，增强子不一定非得是连续的。结合是在便利的限制性位点上通过连接实现。如果不存在这种位点，按照常规操作，使用合成的寡核苷酸连接物或接头。
如在此所用，用语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”互换使用，所有这种命名都包括后代。因此，用语“转化体”和“被转化的细胞”包括原代主体(subject)细胞以及由此产生的不论传递多少次的培养物。还应当理解，由于有意的或无意的突变，所有的后代在DNA含量上并不是完全相同的。还包括在最初转化细胞中被筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。当使用不同的命名时，其包括哪些内容可以很清楚地从上下文中获知。
鉴定对用抗HER2的抗体处理有响应的肿瘤的方法肿瘤和肿瘤细胞的来源肿瘤可以被表征为对用2C4或者功能性等价的抗体治疗响应，功能性等价的抗体具有抗体2C4的一种或多种生物学特征，例如，基于作为活化的度量，在细胞表面上存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3异二聚体。通过本领域知晓的任何方法分析肿瘤样本中是否存在异二聚体。优选地，通过下文描述的一种或多种方法来确定是否存在异二聚体。
由于HER2活化是受体异二聚化和磷酸化的结果，一种特别重要的用于鉴定对用2C4或功能性等价抗体治疗响应的肿瘤的方法是检测ErbB受体磷酸化，例如ErbB2(HER2)受体磷酸化，如下文所述。
可被分析的肿瘤细胞的来源包括，但是不限于，肿瘤活组织检查，循环的肿瘤细胞，循环的血浆蛋白，腹水，异种移植肿瘤以及其他肿瘤模型，原代细胞培养物或者从肿瘤衍生的或者展示肿瘤样特性的细胞系，以及被保存的肿瘤样本，例如福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤样本。本发明计划筛选EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3异二聚体和/或ErbB受体磷酸化的大量不同的肿瘤细胞类型。对于与被检测为异二聚体和/或ErbB受体如ErbB2(HER2)受体磷酸化阳性的肿瘤细胞相同类型的肿瘤细胞可用2C4治疗。下面描述的肿瘤模型作为实施例被提供，而不应该被解释为限制本发明。
在一个实施方案中，来源于正患有一种肿瘤的患者的肿瘤细胞被分析是否对用2C4治疗响应。如果基于存在HER2/HER3和/或HER2/HER1异二聚体或者通过证实ErbB受体发生了磷酸化，确定该细胞是有响应的，那么随后可以用具有2C4的一种或多种生物学特征的抗体处理该患者。优选地，用rhuMAb 2C4处理该患者。
在另一个实施方案中，分析来自特定类型的肿瘤的肿瘤细胞或被认为具有特定类型肿瘤的特征的细胞中是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3异二聚体，或者ErbB受体是否磷酸化，优选ErbB2(HER2)受体。如果检测到EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3异二聚体和/或ErbB受体磷酸化，一般认为该类型的肿瘤是用具有2C4的一种或多种生物学特征的抗ErbB2的抗体处理的优良的候选。然后可用这种抗体处理患有这种肿瘤的患者。
细胞系异种移植可以通过将细胞直接植入到目的位点上来将体外繁殖的肿瘤细胞，例如在培养物中生长的肿瘤细胞和肿瘤细胞系，异种移植到小鼠中。这种方法是本领域技术人员熟知的。分析细胞，以鉴定是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3异二聚体，或者ErbB受体磷酸化，例如ErbB2(HER2)受体磷酸化。
在一个实施方案中，将肿瘤细胞皮下植入到小鼠中，优选无胸腺的裸鼠。在另一个实施方案中，肿瘤细胞被植入到生理相关的位置上来建立一个适当的原位肿瘤模型。例如，来自乳腺癌细胞系的细胞以不同的浓度被植入到无胸腺的裸鼠的乳腺脂肪垫中来更加精确地模拟乳腺癌的生物学。可以在移植之前或之后，分析肿瘤细胞是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体，或ErbB受体磷酸化。优选地，在被植入的细胞已经发育为具有预期大小的肿瘤后再分析肿瘤细胞。还用2C4或功能性等价抗体来治疗小鼠，用未被处理的小鼠作为对照。
还可以给任何类型的肿瘤建立类似的模型，已经从这些肿瘤中获得了被培养的细胞或细胞系。肿瘤类型包括，但是不限于，膀胱，脑，乳腺，大肠，食道，肾，白血病，肝，肺，黑素瘤，卵巢，胰腺，前列腺，肉瘤，胃，睾丸和子宫。在一个实施方案中，过度表达ErbB2的肿瘤细胞或细胞系被用于移植，而在另一个实施方案，表达正常或低于正常含量的ErbB2的肿瘤细胞或细胞系被用于移植。在还有另一个实施方案中，不对HERCEPTIN响应的肿瘤细胞或细胞系被用于移植。
在一个特定实施方案中，大约2千万个MDA-175乳腺肿瘤细胞被植入小鼠的生殖腺的脂肪垫中。例如通过下述的方法之一，在异种移植的细胞的表面上检测HER2/HER1和/或HER2/HER3二聚体的表达。还可用0，3mg/kg，10mg/kg，30mg/kg或100mg/kg的2C4处理被这样移植的小鼠。其他剂量方案可以由本领域的普通技术人员来确定。
虽然本发明适合于任何表达HER2的肿瘤的类型，固体瘤例如乳腺癌，卵巢癌，肺癌，前列腺癌和结直肠癌尤其适合遵循本发明来分析和处理。
肿瘤异种移植可以获取哺乳动物肿瘤样本，优选人肿瘤样本并植入到小鼠中，优选无胸腺的裸鼠。可以通过任何本领域已知的方法来获得肿瘤样本。在一个实施方案中，手术切除肿瘤样本，例如在活组织检查中或者在外科手术中，以从哺乳动物摘下肿瘤。在另一个实施方案中，通过从哺乳动物血液中纯化循环的肿瘤细胞来获得肿瘤样本。
在一个特定的实施方案中，将直径为大约5×5×0.5-1mm的人固体肿瘤切片植入无胸腺的裸鼠的胁部中，通常为每只小鼠四个切片。当被植入的肿瘤达到10-15mm的中值直径时，通常通过使用较小的肿瘤碎片进行连续传代。用于生成和研究人肿瘤异种移植的方法被描述在如下参考文献中，在此全文引入作为参考Fiebig等，“人肿瘤异种移植新抗癌试剂的可预测性、表征和发现”，投稿于“肿瘤学用于抗癌药物开发的肿瘤模型相关性”，Fiebig和Burger编辑(Basel，Karger1999)，vol54，29-50；Berger等，“人肿瘤异种移植在胸腺发育不全的裸鼠中的建立和表征”，在“肿瘤学中的免疫缺陷小鼠”中，Fiebig和Berger编辑(Basel，Karger 1992)，23-46；Fiebig和Burger，“人肿瘤异种移植和外植体”，在“癌症研究模型”中，Teicher编辑(Humana Press 2002)113-137。
当异种移植以固体瘤生长，分化，并发展出基质、脉管系统和中央坏死时，人异种移植被认为对供体患者体内的肿瘤行为具有高度预见性。在大多数情况下，异种移植物保留刚自患者获得的肿瘤的大部分分子的、组织学的和病理生理学特征。来自含有最初或者连续传代的肿瘤的小鼠的肿瘤细胞被分析是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3异二聚体，或ErbB受体是否发生磷酸化。还用2C4或者功能性等价抗体来治疗小鼠。
在一个实施方案中，对一组新创建或建立的人肿瘤异种移植进行筛选，筛选是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体，或者ErbB受体是否磷酸化。Fiebig和Burger，同上文，描述了从多种常规癌症类型中建立的一组300个以上的人肿瘤异种移植，常规癌症类型例如膀胱，脑，乳腺，结肠，食道，肾，白血病，肝，肺，黑素，卵巢，胰腺，前列腺，肉瘤，胃，睾丸和子宫。在一个实施方案中，全组被筛选是否具有异二聚体，或ErbB受体例如ErbB2(HER2)受体是否磷酸化。还可以筛选该组的亚群是否具有异二聚体，或ErbB受体是否磷酸化，其中该亚群是基于例如组织类型，过度、低或正常表达ErbB2，或者不对HERCEPTIN响应。以这种方式，基于是否存在异二聚体，或者通过证实ErbB受体例如ErbB2(HER2)受体发生磷酸化，肿瘤可被分类为用2C4治疗的候选肿瘤。同样地，具有如此分类的肿瘤的患者可被更迅速地认为适合用2C4或功能性等价抗体治疗。
在移植之前或之后，可分析肿瘤样本中是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体，或ErbB受体是否磷酸化。在一个实施方案中，大约1g来自最初和/或被连续传代的异种移植的肿瘤被从分子学上进一步表征异二聚体，或者在液氮中迅速冷冻并存储在-80℃下，用于以后进行表征。进一步分析异种移植肿瘤还可以采用双层软琼脂分析，也称作克隆发生分析，如例如在Fiebig和Burger中，同上文中所描述。人固体肿瘤异种移植通过机械的方式和蛋白水解的方式分解为单细胞悬浮液，该细胞悬浮液被铺板到如所述铺了软琼脂的多孔平板中。肿瘤细胞体外生长导致集落形成，可以进一步分析该集落的分子特征，例如异二聚体，或ErbB受体磷酸化，或其他的组织化学的和形态学的特征。
B.检测EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3异二聚体本领域已知的任何方法可以被用于检测肿瘤中的EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体。几个优选的方法在下面进行了描述。这些方法检测非共价的蛋白-蛋白的相互作用或者另外表明目的蛋白之间的接近性。下面描述的方法作为实施例被提供，而不应当被解释为限制本发明。
共免疫沉淀和免疫印迹以免疫亲合为基础的方法，例如免疫沉淀或ELISA，可以被用于检测EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体。在一个实施方案中，抗ErbB2的抗体被用于免疫沉淀包含来自肿瘤细胞的ErbB2的复合物，然后通过免疫印迹检测生成的免疫沉淀物中是否存在EGFR或ErbB3。在另一个实施方案中，EGFR或ErbB3抗体可被用于免疫沉淀步骤，然后用ErbB2抗体检测免疫沉淀物。在另一个实施方案中，特异于HER1，HER3，HER2/HER1复合物或HER2/HER3复合物的ErbB配基被用于沉淀复合物，然后检测复合物中是否存在HER2。例如，配基被用于与抗生物素蛋白偶联，并在生物素柱上纯化复合物。
在另一个实施方案中，例如ELISA或抗体“三明治”型分析中，针对ErbB2抗体被固定在固体支持物上，与肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物接触，洗涤，然后暴露于抗EGFR或ErbB3的抗体中。后一种抗体的结合，该结合可以直接地或者通过偶联到可检测标记上的第二种抗体来检测，表明存在异二聚体。在某些实施方案中，EGFR或ErbB3的抗体被固定，而ErbB2抗体被用于检测步骤。在另一个实施方案中，ErbB受体的配体被用于替代或者组合抗ErbB受体的抗体。
用EGFR，ErbB2，或ErbB3抗体进行免疫沉淀后，可随后进行异二聚体的功能性分析，作为免疫印迹的替代或补充。在一个实施方案中，用ErbB3抗体进行免疫沉淀后，分析免疫沉淀物中的受体酪氨酸激酶活性。由于ErbB3不具有内在酪氨酸激酶活性，免疫沉淀物中存在酪氨酸激酶活性表明ErbB3最有可能与ErbB2结合。Graus-Porta et al.，EMBO J.，161647-55(1997)；Klapper et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，964995-5000(1999)。该结果可通过使用ErbB2抗体的免疫印迹来证实。在另一个实施方案中，用ErbB2抗体进行免疫沉淀后，分析EGFR受体酪氨酸激酶活性。在该分析中，免疫沉淀与放射性ATP以及模拟ErbB2被EGFR转磷酸化的体内位点的肽底物接触。肽发生磷酸化表示共免疫沉淀，从而EGFR与ErbB2发生异二聚化。受体酪氨酸激酶活性分析在本领域是熟知的，包括检测靶点底物的磷酸化的分析，例如，通过磷酸酪氨酸抗体和活化关联的信号传导路径，例如MAPK路径。
对上述方法和分析进行的改变对于本领域普通技术人员来说是显而易见和常规的。
化学的或UV交联可以被用于共价连接活细胞表面的异二聚体。Hunteret al.，Biochem.J.，320847-53。化学交联剂的例子包括二硫代双(琥珀酰亚胺基)丙酸(DSP)和3，3′-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基)丙酸(DTSSP)。在一个实施方案中，来自化学交联的肿瘤细胞的细胞提取物通过SDS-PAGE分析并用EGFR和/或ErbB3的抗体进行免疫印迹。由于ErbB2是EGFR和ErbB3的优选异二聚化伴侣，合适分子量的超位移条带最有可能代表EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体。该结果可通过随后用ErbB2抗体进行免疫印迹来证实。
FRET和以荧光为基础的方法荧光共振能量转移(FRET)也被用于检测EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体。FRET根据能量从供体荧光团转移到受体荧光团，在体内和体外检测蛋白质构型变化和蛋白质-蛋白质相互作用。Selvin，Nat.Struct.Biol.，7730-34(2000)。能量转移仅在供体荧光团与受体荧光团足够相近时发生。在典型的FRET实验中，两种蛋白或者单一蛋白上的两个位点用不同的荧光探针标记。探针中的一个，供体探针，用特定波长的入射光激发到较高的能量状态。然后供体探针将其能量转移到第二个探针上，即受体探针，导致供体荧光强度下降和受体荧光发射增强。为了测定能量转移的程度，供体在用供体和受体探针标记的样本中的强度与其在仅用供体探针标记的样本中的强度比较。任选地，比较在供体/受体的样本中和在仅含受体的样本中的受体强度。合适的探针在本领域是已知的，并包括例如可透过膜的染料，例如荧光素和罗丹明，有机染料，例如花青染料，和镧系原子。Selvin，同上文。用于检测和测量能量转移的方法和仪器在本领域也是已知的。Selvin，同上文。
适合于检测和测量单个细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用的以FRET为基础的技术在本领域也是已知的。例如，供体光漂白荧光共振能量转移(pbFRET)显微镜和荧光寿命成像显微镜(FLIM)可以被用于检测细胞表面受体的二聚化。Selvin，同上文；Gadella和Jovin，J.Cell Biol.，1291543-58(1995)。在一个实施方案中，pbFRET被在“悬浮液”中或“原位”用在细胞上来检测和测量EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体的形成，如被描述在Nagy et al.，Cytometry，32120-131(1998)中。这些技术测量由于能量转移造成的供体荧光寿命的缩短。在一个特别的实施方案中，流式细胞计数Foerster型FRET技术(FCET)可被用于研究EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3异二聚化，如在Nagy et al.，同上文，和Brockhoff et al.，Cytometry，44338-48(2001)中所描述。
FRET优选与标准的免疫组织化学标记技术联合使用。Kenworthy，Methods，24289-96(2001)。例如，与合适的荧光染料偶联的抗体可以被用作标记两种不同蛋白质的探针。如果蛋白质与另一蛋白质接近，该荧光染料作为FRET的供体和受体。通过标准手段来检测能量转移。可以通过流式细胞计数手段或者通过数码显微镜系统检测能量转移，例如共焦显微镜或连接到电荷偶联装置(charge-coupled device)(CCD)照相机的宽视野荧光显微镜。
在本发明的一个实施方案中，ErbB2抗体或者EGFR或ErbB3抗体直接用两种不同荧光团标记，例如如在Nagy et al.，同上文中所描述。肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物与进行区别标记的抗体接触，这些抗体在检测是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体的FRET中作为供体和受体。此外，未被标记的抗ErbB2的和或者抗EGFR或者抗ErbB3的抗体与被区别标记来作为供体和受体的第二抗体一起使用。参见，例如Brockhoffet al.，同上文。如果发现标记非常接近，那么检测到能量转移，并确定存在异二聚体。
在另一个实施方案中，特异于HER2和或者特异于HER1或者特异于HER3的ErbB受体的配体被荧光标记，并用于FRET研究。
在本发明的还有其他实施方案中，采用标准的直接或间接免疫荧光技术和共焦激光扫描显微镜，通过共定位(co-localization)ErbB2与或者EGFR或者ErbB3来证明在肿瘤细胞的表面上存在异二聚体。此外，激光扫描成像(LSI)被用于在高通量格式(high-throughput format)例如微孔平板中，检测抗体结合以及ErbB2与或者EGFR或者ErbB3共定位，如被描述在Zuck etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9611122-27(1999)。
在还有一个实施方案中，通过鉴定依赖于异二聚体组分的相近性的酶活性来确定存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3异二聚体。ErbB2抗体与一种酶偶联，而EGFR或ErbB3抗体与第二种酶偶联。加入用于第一种酶的第一种底物，该反应产生用于第二种酶的第二种底物。这导致与另一种分子的反应来生成可检测的化合物，例如染料。另一个化学药品的存在分解了第二种底物，使得与第二种酶的反应被阻断，除非第一种和第二种酶，因此也就是两种抗体，十分接近。在一个特别的实施方案中，将肿瘤细胞或细胞裂解物与用葡萄糖氧化酶偶联的ErbB2抗体，以及用辣根过氧化酶偶联的ErbB3或ErbB1抗体接触。将葡萄糖以及染料前体，例如DAB，和过氧化氢酶加入到反应中。产生对DAB染色的颜色确定存在异二聚体。
eTagTM分析系统可以采用基于eTagTM分析系统(Aclara Bio Sciences，Mountain View，CA)的方法检测异二聚体，如被描述在例如WO 83502和2001年12月6日公开的美国专利申请2001/0049105中，两者都清楚地全文引入作为参考。eTagTM或“电泳标记”包含可检测的报道分子部分，例如荧光团。其还可以包含“迁移率调节物”，迁移率调节物基本上由具有独特的电泳迁移率的部分组成。这些部分使得可以在限定的电泳条件下，例如毛细管电泳(CE)，从复杂的混合物中分离和检测eTagTM。包含报道分子部分以及，任选的，迁移率调节物的eTagTM的部分通过可裂解连接基团被连接到第一个靶向结合部分上，生成第一种结合化合物。第一个靶向结合部分特异地识别特定的第一个靶点，例如核酸或蛋白质。第一个靶向结合部分无论如何是不被限制的，并且可以是例如多核苷酸或多肽。优选地，第一个靶向结合部分是一种抗体或抗体片段。另外，第一个靶向结合部分可以是ErbB受体的配体或其具有结合能力的片段。
连接基团优选包含可裂解部分，例如一种酶底物或在限定条件下可以被裂解的任何化学键。当第一个靶向结合部分结合到其靶点时，裂解剂被导入和/或激活，而连接基团被断裂，从而释放包含报道分子部分和迁移率调节物的eTagTM的部分。因此，存在“游离”的eTagTM表示靶向结合部分结合到其靶点上。
优选地，第二种结合化合物包含裂解剂和特异地识别第二个靶点的第二个靶向结合部分。第二个靶向结合部分也是无论如何不是被限制的，并且可以是例如一种抗体或抗体片段或ErbB受体的配体或具有结合能力的配基片段。如果第一种结合化合物和第二种结合化合物十分接近，那么裂解剂将仅断裂第一种结合化合物中的连接基团。
在本发明的一个实施方案中，第一种结合化合物包含eTagTM，在eTagTM中ErbB2抗体作为第一个靶向结合部分。第二种结合化合物包含连接到能够断裂eTagTM的连接基团的裂解剂上的EGFR或ErbB3的抗体。优选地，裂解剂必须被激活以能够断裂连接基团。肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物与结合到ErbB2上的eTagTM接触，和与结合到细胞表面上的EGFR或ErbB3的被修饰的EGFR或ErbB3抗体接触。优选去除未被结合的结合复合物，并在需要时激活裂解剂。如果存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3异二聚体，由于裂解剂和连接基团相邻近，裂解剂将会断裂连接基团，并释放eTagTM。然后通过本领域已知的任何方法，例如毛细管电泳，检测游离的eTagTM。
在一个实施方案中，裂解剂是可激活的作用于连接基团的化学药品种类。例如，可以通过将样本暴露于光照下来激活裂解剂。
在另一个实施方案中，采用EGFR或ErbB3的抗体作为第一个靶向结合部分来构建eTagTM，而用ErbB2抗体构建第二种结合化合物。
检测ErbB受体的磷酸化存在ErbB受体磷酸化可被用来证明HER2活化。
在一个实施方案中，通过免疫沉淀一种或多种ErbB受体例如ErbB2(HER2)受体，以及蛋白质印迹分析来评价ErbB受体磷酸化。例如，采用抗磷酸酪氨酸抗体来检测被免疫沉淀的ErbB受体中的被磷酸化的酪氨酸残基，在凝胶上存在磷酸-HER2条带确定为阳性。抗磷酸酪氨酸的抗体可以从PanVera(Madison，WI)或Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)购买得到，PanVera(Madison，WI)是Invitrogen，Chemicon InternationalInc.(Temecula，CA)的子公司。缺乏该条带确定为阴性。
在另一个实施方案中，采用磷酸特异性抗HER2的抗体(克隆PN2A；Thor et al.，J.Clin.Oncol.，18(18)3230-3239(2000))，通过免疫组织化学评价ErbB2(HER2)受体磷酸化。用于检测ErbB受体磷酸化的其他方法包括，但是不限于，KIRA ELISA(美国专利号5,766,863；5,891,650；5,914,237；6,025,145；和6,287,784)，质谱法(比较磷酸化的和未磷酸化的HER2的大小)，和采用抗HER2的抗体进行e-tag邻近性分析(例如采用购自AclaraBioSciences(Mountain View，CA)的eTagTM分析试剂盒)。对于eTagTM分析的详细内容在上文中描述。
抗体制备下面的说明是关于制备按照本发明所用的治疗性和诊断性抗体的示例性技术。虽然该说明总体上针对抗ErbB2的抗体的制备，本领域的技术人员能够很容易地修改本公开来制备针对任何ErbB受体的抗体。
用于制备抗体的ErbB2抗原可以是，例如含有所需表位的ErbB2的细胞外结构域或其部分的可溶形式。或者，在细胞表面表达ErbB2的细胞(例如被转化来过度表达ErbB2的NIH-3T3细胞；或癌细胞系例如SK-BR-3细胞，参见Stancovski et al.，PNAS(USA)，888691-8695(1991))可以被用于生产抗体。可用于生产抗体的其他形式的ErbB2对于本领域技术人员来说是显然的。
多克隆抗体优选地通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中产生多克隆抗体。采用双功能或衍生化剂，例如马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基偶联)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基偶联)，戊二醛，琥珀酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基团，将相关抗原偶联到在将被免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质上是有用的，这些蛋白例如匙孔血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过组合例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂，并在多个部位皮内注射该溶液以针对抗原，免疫原性交联物或衍生物来免疫动物，一个月后，1/5-1/10的最初量的溶解在弗氏完全佐剂中的肽或偶联物在多个部位上进行皮下注射来加强免疫动物。7-14天后，给动物放血，分析血清中的抗体滴度。加强免疫动物直到该滴度达到稳定状态。优选地，用相同抗原但是偶联到不同蛋白质上和/或通过不同交联剂偶联的交联物来加强免疫动物。还可以蛋白质融合的形式在重组细胞培养物中制备偶联物。此外，凝集剂例如明矾适合被用于增强免疫反应。
单克隆抗体单克隆抗体是从实质上均一的抗体的群体中获得，即包含群体的各个抗体除了可能以最小量存在的可能天然发生的突变外，是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征，即不是无联系的抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可以通过最早在Kohler et al.，Nature，256495(1975)中描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法(如美国专利号4,816,567)来制备。
在杂交瘤方法中，小鼠或其他合适的宿主动物，例如仓鼠如上文所描述进行免疫来引发生产或能够生产抗体的淋巴细胞的产生，该抗体将特异地结合用于免疫接种的蛋白质。或者，在体外免疫淋巴细胞。然后，采用合适的融合试剂，例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，“单克隆抗体原理和实践”，59-103(Academic Press，1986))。
如此制备的杂交瘤细胞被接种并生长在合适的培养基中，培养基中优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些有效融合，通过所选择的生产抗体的细胞支持稳定高水平地生产抗体，并且对培养基例如HAT培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，例如那些来源于从Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤系，和得自美国典型培养物保藏中心Rockville，MarylandUSA的SP-2或X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和小鼠人异骨髓瘤细胞系也被描述用于制备人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；和Brodeur et al.，“单克隆抗体制备技术及应用”，51-63(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987))。
分析其中生长了杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的生产。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合分析，例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)，确定杂交瘤细胞制备的单克隆抗体的结合特异性。
例如，可通过Munson et al.，Anal.Biochem.，107220(1980)的斯卡查德分析来确定单克隆抗体的结合亲合力。
在杂交瘤细胞被鉴定出生产具有所需特异性、亲合力和/或活性的抗体后，通过有限稀释操作亚克隆该克隆，并通过标准方法来生长(Goding，“单克隆抗体原理和实践”，59-103(Academic Press，1986))。用于该目的的合适培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在动物中体内生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体采用传统的抗体纯化操作例如蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲合层析，从培养基、腹水液或血清中适当分离。
采用常规操作(例如通过采用能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。一旦被分离，DNA可被加入到表达载体中，然后将表达载体转染到宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者不另外生产抗体蛋白的骨髓瘤细胞，以获得单克隆抗体在重组的宿主细胞中的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可以采用在McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990)中描述的技术从所生成的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分别描述了采用噬菌体文库分离鼠和人的抗体。随后的出版物中描述了通过链改组来制备高亲合性(nM范围)的人抗体(Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))。因此，对于用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术来说，这些技术是可行的替代。
DNA还可以被修饰，例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列来替代同源的鼠序列(美国专利号4,816,567；和Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851(1984))，或者通过将全部或部分的非免疫球蛋白多肽的编码序列共价地连接到免疫球蛋白编码序列上。
典型地，用这种非免疫球蛋白多肽来替代抗体的恒定结构域，或者用它们来替代抗体的抗原结合位点的可变结构域，以建立包含对一个抗原具有特异性的抗原结合位点以及对一个不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点的嵌合双价抗体。
人源化抗体用于人源化非人类的抗体的方法已经在本领域被描述。
优选地，人源化的抗体具有从非人来源被导入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类的氨基酸残基通常被称作为“输入”残基，其通常来自“输入”的可变结构域。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988))，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，这种“人源化”的抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中比完整的人可变结构域小得多的部分被来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化的抗体典型地是人的抗体，其中有些高变区残基以及可能有些FR残基被来自啮齿类动物抗体的类似位点上的残基取代。
选择人的轻链和重链的可变结构域，以用于制备人源化的抗体对于降低抗原性是非常重要的。按照所谓的“最佳适配(best-fit)”的方法，用已知的人的可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类动物抗体的可变结构域的序列。然后与啮齿类动物最接近的人序列被接受作为人源化抗体的人的骨架区(FR)(Sims et al.，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一种方法采用来自特定的轻链或重链亚群的所有人抗体的共有序列的特定骨架区。相同的骨架可以被用于几种不同的人源化抗体(Carteret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，1512623(1993))。
被人源化的抗体保留对抗原的高亲合力以及其他有利的生物学特性也是重要的。为了达到这个目的，按照优选的方法，通过采用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种构想的人源化产物的过程来制备人源化的抗体。三维的免疫球蛋白模型是一般可获得的，并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可获得的，其阐明和显示被选择的候选免疫球蛋白序列的很可能的三维构象结构。对这些显示的探查可以分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，来获得期望的抗体特性，例如增强对目标抗原的亲合力。总之，高变区的残基直接地和最实质性地参与影响抗原结合。
结合ErbB2并阻断ErbB受体的配基活化的示例性人源化抗ErbB2的抗体被描述在WO 01/0245，其在此引入作为参考。在此特别感兴趣的人源化抗体基本上与鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片段)一样有效地阻断EGF，TGF-α和/或HRG介导的MAPK的活化，和/或基本上与鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片段)一样有效地结合ErbB2。人源化抗体在此可以例如，包含被结合到人可变重链结构域的非人的高变区残基，并且可能在选自由69H，71H和73H组成的组中的一个位置上包含骨架区(FR)取代，采用的是在Kabat et al.，“具有免疫学意义的蛋白质的序列”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)中给出的可变结构域编号系统。在一个实施方案中，人源化的抗体在69H，71H和73H的两个或所有位点包含FR取代。
示例性的目的人源化抗体在此包含可变的重链结构域互补决定残基GFTFTDYTMX，其中X优选是D或S(SEQ ID NO7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ IDNO9)，任选地包含这些CDR残基的氨基酸修饰，例如，其中修饰基本上保持或改善抗体的亲合力。例如，目的抗体变体可在上述的可变重链CDR序列中具有从约1个到约7个或者约5个氨基酸取代。这种抗体变体可以通过亲和力成熟(affinity maturation)来制备，例如如下文所述。最优选的人源化抗体包含SEQ ID NO4中的可变的重链结构域氨基酸序列(附图1B)。
例如，除了在前述段落中的那些可变重链结构域CDR残基之外，人源化抗体还可以包含可变的轻链结构域互补决定残基KASQDVSIGVA(SEQID NO10)；SASYX1X2X3，其中X1优选为R或L，X2优选为Y或E，和X3优选为T或S(SEQ ID NO11)；和/或QQYYIYPYT(SEQ ID NO12)，这种人源化抗体任选地包含上述CDR残基的氨基酸修饰，例如，其中修饰基本上保持或改善抗体的亲合力。例如，目的抗体变体可能在上述的可变轻链CDR序列中具有从约1个到约7个或者约5个氨基酸取代。这种抗体变体可以通过亲和力成熟来制备，例如如下文所述。最优选的人源化抗体包含SEQ ID NO3中的可变的轻链结构域氨基酸序列(附图1A)。
本申请还考虑亲合力成熟的抗体，其结合ErbB2并阻断ErbB受体的配基活化。亲本抗体可以是人抗体或人源化抗体，例如包含分别为SEQ ID No3和4的可变轻链和/或重链序列(即变体574；附图1A和B)。亲合力成熟的抗体优选以高于鼠2C4或变体574的亲合力结合到ErbB2受体上(如采用ErbB2细胞外结构域(ECD)ELISA评价，例如亲合力改善从约2倍或约4倍到约100倍或约1000倍)。示例性的用于取代的可变重链CDR残基包括H28，H30，H34，H35，H64，H96，H99，或者两个或多个的组合(如这些残基中的2，3，4，5，6或7个)。用于改变的可变轻链CDR残基的例子包括L28，L50，L53，L56，L91，L92，L93，L94，L96，L97或两个或多个的组合(如这些残基中的2至3、4、5或直到约10个)。
还考虑了各种形式的人源化抗体或亲合力成熟的抗体。例如，人源化抗体或亲合力成熟的抗体可以是抗体片段，例如Fab，其任选地与一个或多个细胞毒性剂偶联来产生一种免疫偶联物。或者，人源化抗体或亲合力成熟的抗体可以是完整抗体，例如完整的IgGl抗体。
人抗体作为人源化的替代，可以制备人抗体。例如现在能够制备转基因动物(例如小鼠)，当缺乏内源性免疫球蛋白产物时，该转基因动物能够在免疫后产生人抗体的所有组分。例如，已经描述，在嵌合和种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链连接区(heavy-chain joining region)(JH)基因导致内源抗体生产的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变小鼠，将会导致在抗原激发时产生人抗体。参见，如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggennann et al.，Year in Immuno.，733(1993)；和美国专利号5,591,669；5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature，348552-553(1990))可以被用于体外从来自未被免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组成中生产人抗体和抗体片段。按照这种技术，抗体V结构域基因按照读框被克隆到丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并以功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性特性的选择还会导致对编码展示那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以各种形式实现；对于此的综述，参见如Johnson，Kevin S.和Chiswell，DavidJ.，Current Opinion in Structural Biology，3564-571(1993)。一些V-基因区段的来源可以被用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)从来源于被免疫小鼠的脾脏的一个小的随机组合V基因文库中分离到一系列不同的抗唑酮抗体。基本上按照Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)，或Griffith et al.，EMBO J.，12725-734(1993)中描述的技术可以构建来自未被免疫的人供体的V基因的所有组成成分，并且可以分离抗一系列不同抗原(包括自体抗原)的抗体。还可以参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
如上所讨论的，还可以通过体外激活的B细胞来产生人抗体(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。
人抗ErbB2的抗体被描述在1998年6月30日授权的美国专利号5,772,997和1997年1月3日公开的WO 97/00271中。
抗体片段各种技术已经被开发来生产抗体片段。
传统上，这些片段通过蛋白质水解消化完整的抗体来获得(参见，如Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods，24107-117(1992)；和Brennan et al.，Science，22981(1985))。但是，现在可以通过重组宿主细胞直接地制备这些片段。例如，可以从上面讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可以从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，并化学偶联，来形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10163-167(1992))。按照另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab′)2片段。用于生产抗体片段的其他技术对于本领域技术人员来说是显然的。在其他实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是线性抗体，如，在美国专利5,641,870中所描述的。这种线性抗体片段可以是单一特异性的或双特异性的。
双特异性抗体双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可能结合到ErbB2蛋白的两个不同的表位上。其他的这种抗体可能组合ErbB2结合位点与EGFR，ErbB3和/或ErbB4的结合位点。或者，抗ErbB2的臂可能与结合白细胞上的触发分子例如T细胞受体分子(如CD2或CD3)，或者IgG的Fc受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，来将细胞防御机制集中在表达ErbB2的细胞上。双特异性抗体还可以被用于将细胞毒性剂定位在表达ErbB2的细胞上。这些抗体具有ErbB2结合臂，以及结合细胞毒性剂(如皂草素，抗干扰素-α，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)被制备。
WO 96/16673中描述了一种双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，而美国专利号5,837,234公开了一种双特异性的抗ErbB2/抗FcγRI抗体。双特异性的抗ErbB2/Fcα抗体被示于WO 98/02463中。美国专利号5,821,337教导了一种双特异性的抗ErbB2/抗CD3抗体。
用于制备双特异性的抗体的方法在本领域是已知的。全长双特异性抗体的传统制备是基于共表达两种免疫球蛋白重链-轻链对，其中这两条链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链随机分类，这些杂交瘤(“四链瘤”quadromas)生成了10种不同抗体分子的可能混合物，其中只有一种抗体分子具有正确的双特异性结构。通常通过亲合层析步骤来纯化正确的分子，是非常繁琐的，并且产量很低。类似的操作被公开在WO 93/08829，和Traunecker et al.，EMBO J.，103655-3659(1991)中。
按照不同方法，具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)被融合到免疫球蛋白的恒定结构域序列上。优选与包含铰链区、CH2、和CH3区域的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。优选具有在至少一个融合体中出现的含有轻链结合必需位点的第一重链恒定区(CH1)。编码免疫球蛋白重链融合体以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA被插入到各自独立的表达载体中，并被共转染到合适的宿主生物体中。当构建中所用的三种多肽链的不相等比例产生最佳产量时，这给调整实施方案中三种多肽片段相互比例提供很大的灵活性。但是，当至少两种多肽链以相等比例表达获得了高产量时或者当该比例不是特别重要时，有可能在一个表达载体中插入两种或全部三种多肽链的编码序列。
在这种方法的优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，以及另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。已经发现，由于仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了一种便捷的分离途经，这种不对称结构便于从不期望的免疫球蛋白链组合中分离期望的双特异性化合物。这种方法被公开在WO 94/04690中。生产双特异性抗体的更加详细内容参见，例如Suresh et al.，Methods in Enzymology，121210(1986)。
按照在美国专利号5,731,168中描述的另一方法，可以工程化改造一对抗体分子之间的界面来使异二聚体的百分比最大化，该异二聚体从重组细胞培养物中回收。优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，来自第一抗体分子界面的一条或多条小氨基酸侧链用较大的侧链(如酪氨酸或色氨酸)替代。通过用较小的侧链(如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或类似大小的补偿“空穴”。这提供一种机制来提高异二聚体相对于其他不需要的终产物，例如同型二聚体的产量。
双特异性抗体包括交联的或“异偶联物”抗体。例如，异偶联物中的抗体之一可以被偶联到抗生物素蛋白上，另一个则偶联到生物素上。这种抗体被建议用于例如将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP 03089)。异偶联物抗体可以采用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂以及大量交联技术是本领域熟知的，被公开在美国专利号4,676,980中。
用于从抗体片段生产双特异性抗体的技术也在文献中被描述。例如，双特异性抗体可以采用化学连接制备。Brennan et al.，Science，22981(1985)描述了一种操作，其中完整抗体被蛋白质水解裂解产生F(ab′)2片段。这些片段在二硫酚络合剂亚砷酸钠的存在下被还原以稳定邻近的二硫酚，并防止分子间二硫化物的形成。生成的Fab′片段然后被转化为硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原，Fab′-TNB衍生物之一被再转化为Fab′-硫羟，与等克分子数的其他Fab′-TNB衍生物混合来形成双特异性抗体。生成的双特异性抗体可以被用作选择性固定酶的试剂。
最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段变得更加容易，这些片段可以被化学偶联来形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.，175217-225(1992)中描述了生产完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子。每个Fab′片段分别从E.coli中分泌，并在体外定向化学偶联来形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合到过度表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞上，并且触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶点的裂解活性。
各种用于直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的技术也已经被描述。例如已经采用亮氨酸拉链制备了双特异性抗体。Kostelnyet al.，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。通过基因融合，来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽被连接到两种不同抗体的Fab′部分上。抗体同型二聚体的铰链区被还原来形成单体，然后再次被氧化形成抗体异二聚体。这种方法还可以被用于生产抗体同型二聚体。被描述在Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中的“微型双功能”技术给制备双特异性抗体片段提供可供选择的机制。该片段包含通过接头被连接到轻链可变结构域(VL)上的重链可变结构域(VH)，该接头太短，以至同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，一个片段上的VH和VL结构域被迫与另一条片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。通过采用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一策略也已经被报道。参见Gruber et al.，J.Immunol.，1525368(1994)。
还考虑到具有二价以上的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.，14760(1991)。
其他的氨基酸序列修饰还考虑到抗ErbB2的抗体的氨基酸序列修饰。例如，有可能期望改善抗体的结合亲合力和/或其他的生物学特性。通过将适当的核苷酸改变引入抗ErbB2的抗体的核酸中，或者通过肽合成来制备抗ErbB2的抗体的氨基酸序列变体。这种修饰包括，例如，缺失和/或插入和/或取代抗ErbB2的抗体的氨基酸序列中的残基。进行缺失、插入和取代的任何组合来获得最终的构建体，只要最终的构建体具有所需的特征。氨基酸改变也可改变抗ErbB2抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量或位置。
用于鉴定作为诱变优选位置的抗ErbB2抗体的某些残基或区域的有用方法称作为“丙氨酸扫描诱变”，被描述在Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)中。在此，鉴定残基或目标残基组(如带电荷的残基，例如精氨酸，天冬氨酸，组氨酸，赖氨酸，和谷氨酸)，并且用中性或带负电荷的氨基酸(最优选为丙氨酸或多聚丙氨酸)替换，来影响该氨基酸与ErbB2抗原的相互作用。那些表明对取代具有功能性灵敏性的氨基酸位置通过在或对取代位点引入更多或其他变化来改善。因此，虽然用于导入氨基酸序列变化的位点被预先确定，但是不必预先确定突变本身的性质。例如，为了分析在特定位点上突变的进行，在目标密码子或区域上进行丙氨酸扫描或随机诱变，用所需活性筛选被表达的抗ErbB2抗体变体。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基到含有上百或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗ErbB2抗体或者融合到细胞毒性多肽上的抗体。抗ErbB2抗体分子的其他插入变体包括抗ErbB2抗体的N-或C-末端融合到报道分子，酶(例如ADEPT)或者延长抗体的血清半衰期的多肽上。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗ErbB2抗体中具有至少一个氨基酸残基被不同残基取代。对取代诱变来说最感兴趣的位点包括高变区，但FR改变也被考虑在内。保守性取代显示在表1的“优选取代”的标题下。如果这种取代导致生物学活性的变化，那么导入在表1中称作“示例性取代”或者如下文关于氨基酸分类中进一步描述的更实质性改变，并筛选产物。
表1


抗体生物学特性的实质性改变是通过选择取代来实现，这些取代在其保持如下方面的效果上具有显著区别(a)取代区域的多肽主链结构，例如折叠或螺旋构型，(b)靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。基于共同的侧链特性，天然存在的残基被分成几组(1)疏水的正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；(2)中性亲水的半胱氨酸；丝氨酸；苏氨酸；(3)酸性的天冬氨酸，谷氨酸；(4)碱性的天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸；(5)影响侧链定向的残基甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代将要求将这些种类之一的一个成员换成另一个种类的。
任何不参与维持抗ErbB2的抗体的正确构象的半胱氨酸残基也可被取代，通常用丝氨酸取代，来改善该分子的氧化稳定性，并防止异常的交联。相反，可以在抗体中加入半胱氨酸键来改善其稳定性(特别是当抗体为抗体片段例如Fv片段时)。
特别优选的一类取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基(例如人源化的或人抗体)。一般地，被选择用于进一步开发的生成抗体相对于产生其的亲本抗体，将具有改善了的生物学特性。用于生产这种取代变体的便捷方法涉及采用噬菌体展示的亲合力成熟。简而言之，几个高变区位点(如6-7个位点)被突变来在每一位点上产生所有可能的氨基酸取代。如此生产的抗体变体显示为从作为融合体的丝状噬菌体颗粒到被包装在每一颗粒中的M13的基因III产物的单价形式。然后如在此所公开，筛选噬菌体展示的变体的生物学活性(如结合亲合力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合作出显著贡献的高变区残基。可选择地或者额外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和人ErbB2的接触点是有益的。这种接触残基和邻近残基是用于按照在此详述的技术进行的取代的候选。一旦生成这种变体，对变体群体进行如在此所述的筛选，而一个或多个相关分析中具有优良特性的抗体可被选择用于进一步开发。
另一种类型的氨基酸变异改变抗体的原始糖基化模式。所谓改变是指删除一个或多个存在于抗体中的糖类部分，和/或增加一个或多个不存在于抗体中的糖基化位点。
抗体的糖基化典型的是N-联或0-联的。N-联是指糖部分附着到天冬氨酸残基的侧链上。三肽序列天冬氨酸-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸，是糖部分酶催化附着到天冬氨酸侧链上的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列中任何一种的存在产生了潜在的糖基化位点。0-联糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着到羟基氨基酸上，最通常为丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以采用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
将糖基化位点添加到抗体上方便地是通过改变氨基酸序列使其含有一个或多个上述的三肽序列(用作N-联糖基化位点)来实现。这种改变还可以通过增加或替换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基到原始抗体的序列上(作为0-联糖基化位点)。
编码抗ErbB2抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域知晓的各种方法来制备。这些方法包括，但是不限于，从天然来源中分离(在为天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或者通过早先制备的变体或非变体形式的抗ErbB2抗体的寡核苷酸介导(或定点)诱变，PCR诱变和表达盒诱变来制备。
有可能期望在效应子功能方面改变本发明的抗体，例如来增强抗体的抗原依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区导入一个或多个氨基酸取代来实现。作为选择或者另外地，半胱氨酸残基可以被导入Fc区，从而在该区域形成链间二硫键。如此生成的同型二聚抗体可能具有改进的内在化能力和/或提高补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞性细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.ExpMed.，1761191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.，1482918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体还可以采用如在Wolff et al.，Cancer Research，532560-2565(1993)中描述的异型双功能交联剂来制备。或者，可以改造抗体，使之具有双Fc区，从而具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al，Anti-Cancer Drug Design，3219-230(1989)。
为了延长抗体的血清半衰期，可以如在美国专利5,739,277中所描述在抗体(特别是抗体片段)中掺入补救受体结合表位。如在此所用，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(如IgGI，IgG2，IgG3，或IgG4)的Fc区的表位，该表位负责延长IgG分子的体内血清半衰期。
筛选具有期望特性的抗体用于生产抗体的技术已经在上面被描述。如果需要，还可以进一步选择具有某种生物学特性的抗体。
为了鉴定阻断ErbB受体的配基活化的抗体，可测定抗体阻断ErbB配基结合到表达ErbB受体(例如偶联到另一种ErbB受体上，该ErbB受体与目的ErbB受体形成ErbB异寡聚物)的细胞的能力。例如，天然地表达或者被转染来表达ErbB异寡聚物的ErbB受体的细胞可以与抗体一起孵育，然后暴露给被标记的ErbB配基。然后可评价抗ErbB2的抗体阻断配基结合到ErbB异寡聚物中的ErbB受体上的能力。
例如，通过抗ErbB2抗体抑制HRG结合到MCF7乳腺肿瘤细胞系上，可以基本上如WO 01/00245中所述，使用以在冰上以24孔平板的形式的单层MCF7培养物进行。将抗ErbB2的单克隆抗体添加到各个孔中，并孵育30分钟。然后可加入125I-标记的rHRGβ1177-224(25pm)，继续孵育4-16小时。绘制剂量反应曲线，计算目的抗体的IC50值。在一个实施方案中，阻断ErbB受体的配基活化的抗体在本分析中抑制HRG结合到MCF7细胞的IC50为约50nM或更低，更加优选为1OnM或更低。当抗体是抗体片段，例如Fab片段时，在本分析中抑制HRG结合到MCF7细胞的IC50可以是，例如约100nM或更低，更优选为50nM或更低。
可选择地或另外地，可评定抗ErbB2抗体阻断存在于ErbB异寡聚物中的ErbB受体的ErbB配基刺激的酪氨酸磷酸化的能力。例如，内源性地表达或被转染来表达ErbB受体的细胞可以与抗体一起孵育，然后使用抗磷酸酪氨酸单克隆(其任选地与可检测的标记偶联)来分析ErbB配基依赖的酪氨酸磷酸化活性。在美国专利5,766,863中所描述的激酶受体活化分析也可以用于测定ErbB受体活化和通过抗体对该活性的阻断。
在一个实施方案中，可以基本上如下面实施例1中所描述筛选抑制HRG刺激MCF7细胞中的p180酪氨酸磷酸化的抗体。例如，将MCF7细胞铺到24孔平板上，并将ErbB2的单克隆抗体加入每个孔中，在室温下孵育30分钟；然后可在每个孔中加入rHRGβ1177-244到0.2nM的最终浓度，继续孵育8分钟。从每个孔中吸走培养基，通过加入100μl SDS样本缓冲液(5％SDS，25mM DTT和25mM Tris-HCl，pH 6.8)来终止反应。可在4-12％梯度凝胶(Novex)中对每一样本(25μl)进行电泳，然后通过电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。可进行抗磷酸酪氨酸(以1μg/ml)免疫印迹，通过反射度光密度分析法量化Mr180,000的主要反应条带的强度。在本分析中，被选择的抗体优选显著地抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激至对照的约0-35％。可绘制由反射度光密度分析法确定的p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的剂量反应曲线，并可计算目的抗体的IC50。在一个实施方案中，阻断ErbB受体的配基活化的抗体在本分析中抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的IC50为约50nM或更低，更优选为1OnM或更低。当该抗体为抗体片段例如Fab片段时，在本分析中抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的IC50为，例如约100nM或更低，更加优选为50nM或更低。
还可以评价抗体对MDA-MB-175细胞的生长抑制作用，如基本上如Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997)中所述。按照本分析方法，用抗ErbB2单克隆抗体(10μg/mL)处理MDA-MB-175细胞4天，并用龙胆紫染色。用抗ErbB2的抗体孵育在这一细胞系上显示出与使用单克隆抗体2C4类似的生长抑制作用。在还有一个实施方案中，外源的HRG对这种抑制没有显著的逆转作用。优选地，无论是否存在外源HRG，该抗体抑制MDA-MB-175细胞的细胞增殖的程度超过了单克隆抗体4D5(并且任选地超过了单克隆抗体7F3)。
在一个实施方案中，目的抗ErbB2的抗体可阻断MCF7和SK-BR-3细胞中的heregulin依赖的ErbB2与ErbB3结合，实质上比单克隆抗体4D5更有效，和优选地实质上比单克隆抗体7F3更有效，这通过例如在实施例1中所描述的共免疫沉淀实验中确定。
为了鉴定生长抑制性抗ErbB2的抗体，可以筛选抑制过度表达ErbB2的癌症细胞生长的抗体。在一个实施方案中，在约0.5-30μg/ml的抗体浓度下，所选择的生长抑制抗体能够抑制细胞培养物中约20-100％，优选约50-100％的SK-BR-3细胞的生长。为了鉴定这种抗体，可以实施在美国专利号5,677,171中描述的SK-BR-3分析。按照这种分析，SK-BR-3细胞在F12和添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素链霉素的DMEM培养基的1∶1混合物中生长。将20,000个SK-BR-3细胞铺入35mm细胞培养皿中(2ml/35mm培养皿)。每个培养皿中加入0.5-30μg/ml抗ErbB2抗体。6天后，用电子COULTETRTM细胞计数器计数细胞数量，与未被处理的细胞比较。那些抑制约20-100％或约50-100％的SK-BR-3细胞生长的抗体被选择作为生长抑制抗体。
为了选择诱导细胞死亡的抗体，相对于对照可评价由例如PI，台盼兰或7AAD摄取指示的膜完整性的丧失。优选分析是采用BT474细胞的PI摄取的分析。按照该分析，BT474细胞(可从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)获得)被培养在Dulbecco′s Modified Eagle Medium(D-MEM)添加了10％热灭活的FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Ham′s F-12(50∶50)中。(因此，该分析在缺乏补体和免疫效应细胞下进行)。BT474细胞以3×106/皿的浓度被接种到100×20mm培养皿中，附着过夜。然后去除培养基，只用新鲜培养基或者用含有10μg/ml合适的单克隆抗体的培养液替换。孵育细胞3天。在每一处理后，用PBS洗涤单细胞层，用胰蛋白酶消化分离。然后在40℃下以1200rpm离心5min，将沉淀重悬在3ml冰冷的Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes，pH7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)中，并等分试样到35mm的加盖滤网的12×75试管中(1ml/管，3管/处理组)来去除细胞块。然后在管中加入PI(10μg/ml)。用FACSCANTM流式细胞计数仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(Becton Dickinson)来分析样本。通过PI摄取确定的那些引起统计学上显著水平的细胞死亡的抗体可被选择作为诱导细胞死亡的抗体。
为了选择诱导凋亡的抗体，可采用使用BT474细胞的膜联蛋白结合分析。如前面的段落所讨论培养BT474细胞并植入培养皿中。然后去除培养基，只用新鲜培养基或者含有10μg/ml单克隆抗体的培养基替换。在3天的孵育期后，用PBS洗涤单细胞层，用胰蛋白酶消化分离。然后如上讨论离心细胞，重悬在Ca2+结合缓冲液中，并等分试样到试管中用于细胞死亡分析。然后往试管中加入被标记的膜联蛋白(如膜联蛋白V-FTIC)(1μg/ml)。可用FACSCANTM流式细胞计数仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(BectonDickinson)来分析样本。那些相对于对照引起统计学上显著水平的膜联蛋白结合的抗体被选择作为诱导凋亡的抗体。
除了膜联蛋白结合分析，还可以采用BT474细胞进行DNA染色分析。为了进行该分析，已经如前面两段所述用目的抗体处理的BT474细胞与9μg/ml HOECHST 33342TM在37℃下孵育2小时，然后用MODFIT LTTM软件(Verity Software House)在EPIC S ELITETM流式细胞计数仪(CoulterCorporation)中进行分析。通过该分析，诱导比未处理细胞高2倍或更高(优选3倍或更高)的凋亡细胞百分比变化(达到100％凋亡细胞)的抗体被选作前凋亡(pro-apoptotic)抗体。
为了筛选结合到被目的抗体结合的ErbB2的一个表位上的抗体，可进行常规的交叉-阻断分析，例如被描述在“抗体，实验室手册，Cold SpringHarbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)”中的分析。可选择地或另外地，可以通过本领域已知的方法进行表位作图(参见，如本文的附图1A和1B)。
免疫偶联物(immunoconjugate)本发明还涉及包含被偶联到细胞毒性剂的抗体的免疫偶联物，细胞毒性剂例如化学治疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或经酶催化后有活性的毒素，包括其片段和/或变体)或放射性同位素(即放射偶联物)。
在生产这种免疫偶联物中有用的化学治疗剂已经在上文被描述。本文还考虑了抗体和一种或多种小分子毒素，例如加利车霉素，美登素(maytansine)(美国专利号5,208,020)，trichothene，和CC1065的偶联物。
在本发明的一个优选实施方案中，抗体被偶联到一个或多个美登素分子上(例如每个抗体约1-约10个美坦纳生分子)。美登素可以，例如被转化为May-SS-Me，其被还原为May-SH3，并与被修饰的抗体反应(Chari et al.，Cancer Research，52127-131(1992))来生成美登木素生物碱抗体免疫偶联物。
另一种目的免疫偶联物包含被偶联到一个或多个加利车霉素分子上的抗ErbB2抗体。抗生素的加利车霉素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可以被使用的加利车霉素的结构类似物包括，但是不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research，533336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research，582925-2928(1998))。还参见美国专利号5,714,586；5,712,374；5,264,586；和5,773,001，在此特别地引入作为参考。
可以被使用的经酶催化有活性的毒素及其片段包括白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)，蓖麻蛋白A链，相思豆毒蛋白A链，莫迪素(modeccin)A链，α-八叠球菌，油桐蛋白，dianthin蛋白，垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAP I，PAP II，和PAP-S)，苦瓜抑制剂，泻果素，巴豆毒素，sapaonaria officinalis抑制剂，gelonin，mitogellin，restrictocin，酚霉素，依诺霉素和tricothecene。参见，例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明还进一步考虑在抗体和具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶例如脱氧核糖核酸酶；DNase)之间形成的免疫偶联物。
各种放射性同位素可以用于制备放射偶联的抗ErbB2抗体。例子包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素。
可以采用各种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体与细胞毒性剂的偶联物，这些偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸盐(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐，亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(例如dimethyl adipimidateHCL，活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸盐)，醛(例如戊二醛)，二-叠氮化合物(例如二(p-叠氮苯甲酰)己二胺)，二-重氮衍生物(例如二-(p-重氮盐苯甲酰)-乙二胺，二异氰酸盐(例如亚苄基2，6-二异氰酸盐)，和二-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻蛋白免疫毒素可以如Vitetta等，Science，2381098(1987)中所述进行制备。14碳标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸偶联到抗体上的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。该接头可以是便于细胞毒性药物在细胞中释放的可裂解的接头。例如，可以采用酸不稳定接头，肽酶敏感的接头，二甲基接头或含有二硫化物的接头(Chari et al.，Cancer Research，52127-131(1992))。
或者，包含抗ErbB2抗体和细胞毒性剂的融合蛋白可以通过如重组技术或肽合成来制备。
在还有另一个实施方案中，抗体被偶联到一个在肿瘤预靶向中使用的“受体”(例如链霉抗生物素)上，其中抗体-受体偶联物被施用给患者，接着使用清除剂从循环中去除未被结合的偶联物，然后施用偶联到细胞毒性剂(例如放射性核苷酸)上的“配基”(如抗生物素蛋白)。
抗体依赖的酶介导的前体药物治疗(ADEPT)本发明的抗体还可以被用于ADEPT之中，通过将抗体偶联到激活前体药物的酶上，该酶将前体药物(如肽基化疗剂，参见WO 81/01145)转化为活性抗癌药物。参见，例如WO 88/07378和美国专利号4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括任何能够以将前体药物转化为其更有活性、细胞毒性的形式的形式作用于前体药物的酶。
可用于本发明的方法的酶包括，但是不限于，用于将含有磷酸的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含有硫酸盐的前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒性的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；蛋白酶，例如沙雷氏菌属蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)，可以用于将含肽前体药物转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，用于转化含有D-氨基酸取代的前体药物；糖裂解酶例如用于将糖基化的前体药物转化为游离药物的β-半乳糖苷酶和神经氨酸苷酶；用于将用β-内酰胺衍生化的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于将在氨基氮分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生化的药物转化为游离药物。或者，具有催化活性的抗体，在本领域也被称作“抗体酶”(abzyme)，也可以被用于将本发明的前体药物转化为游离的活性药物(参见，例如Massey，Nature，328457-458(1987))。抗体-抗体酶偶联物可以如在此所描述被制备来将抗体酶递送到肿瘤细胞群体中。
本发明的酶可以通过本领域熟知的技术被共价结合到抗ErbB2抗体上，例如使用上面讨论的异双功能交联剂。或者，可以采用本领域熟知的重组DNA技术来构建包含被连接到本发明的酶的至少一个功能性活性部分的至少本发明的抗体的抗原结合区的融合蛋白(参见，如Neuberger等，Nature，312604-608(1984)。
其他抗体修饰本文还考虑抗体的其他修饰。例如抗体可以被连接到各种各样非蛋白聚合物之一上，如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯或者聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗体还可以或者可选择地被连接到一个和多个各种各样的不同部分上，例如荧光标记，具有已知电泳迁移率的部分或者能够裂解特殊接头分子的部分。
抗体还可以被诱捕到所制备的微囊体中，例如通过凝聚技术或者通过界面聚合(例如，分别为羟甲基纤维素或者明胶微囊体和poly-(methylmethacylate)微囊体)，在胶质药物递送系统中(例如脂质体，白蛋白微球体，微乳状液，纳米颗粒和纳米胶囊)，或者在大分子乳液。这种技术被公开在雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Oslo，A.，编辑，(1980)中。
在此公开的抗ErbB2抗体还可以被配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法来制备，例如被描述在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公开的WO 97/38731中。循环时间延长的脂质体被描述在美国专利5,013,556中。
特别有用的脂质体可以采用包含卵磷脂、胆固醇和PEG-衍生磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发方法生成。可以通过特定孔径的滤器挤压来获得具有期望直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段可以如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)所描述通过二硫化物交换反应被偶联到脂质体上。化学治疗剂任选被包含在脂质体中。参见Gabizon等，J.National CancerInst.，81(19)1484(1989)。
载体，宿主细胞和重组方法本发明还提供编码抗体包括人源化的抗ErbB2抗体的分离核酸，包含核酸的载体和宿主细胞，和用于生产抗体的重组技术。
对于重组生产抗体，编码抗体的核酸被分离和插入到可复制的载体中，用于进一步克隆(DNA扩增)或用于表达。采用常规方法(如通过采用能够特异性地结合到编码抗体的重链和轻链的基因上的寡核苷酸探针)可以很容易分离和测序编码单克隆抗体的DNA。许多抗体是可以获得的。载体组分通常包括，但是不限于，下面的一种或多种信号序列，复制起点，一种或多种标记基因，增强子元件，启动子和转录终止序列。
信号序列组分不仅可以直接地，而且还可以用具有异源多肽的融合多肽形式重组生产抗ErbB2抗体，异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定可裂解位点的其他多肽。所选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶断裂)的序列。对于不识别和加工天然的抗ErbB2抗体的原核宿主细胞，信号序列被选自碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导序列的组的原核信号序列取代。对于酵母分泌物，天然信号序列可以被如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母和克鲁维氏酵母菌属α因子前导序列)，或者酸性磷酸酶前导序列，白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列，或者WO 90/13646中描述的信号序列取代。在哺乳动物细胞表达中，可以获得哺乳动物信号序列以及病毒性分泌前导序列，例如疱疹单纯gD信号序列。
这种前体区域的DNA可以读框的形式被连接到编码抗ErbB2抗体的DNA上。
复制起点组分表达和克隆载体都含有核酸序列，该核酸序列使得载体在一种或多种所选择的宿主细胞中是可复制的。一般地，在克隆载体中，这种序列是使载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，包括复制起点或者自动复制序列。这种序列在各种细菌、酵母和病毒中是已知的。质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)对于哺乳动物细胞中的克隆载体是有用的。一般地，复制组分的起点对于哺乳动物表达载体来说不是必需的(SV40起点仅仅是因为其含有早期启动子而通常被使用)。
选择基因组分表达和克隆载体可能含有选择基因，也称作选择标记。典型的选择基因编码蛋白，该蛋白(a)赋予抗生素或其他毒性，例如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四环素，(b)补体营养缺陷，或者(c)提供不能从复合培养基中获得的关键营养成分，例如为芽胞杆菌编码D丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子采用药物来阻滞宿主细胞生长。那些成功地用异源基因转化的细胞生产赋予药物抗性的蛋白，从而在选择方案中存活。这种显性选择的例子采用药物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
适合用于哺乳动物细胞的选择标记的另一个例子是那些能鉴定细胞的选择标记，这些细胞具有摄取抗ErbB2抗体核酸，例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选为灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等的能力。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞最初通过在含有氨甲蝶呤(Mtx)、DHFR的竞争性拮抗剂的培养基中培养所有转化体来鉴定。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
此外，用编码抗ErbB2的抗体的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)，野生型DHFR蛋白和其他可选择标记，例如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)，可以通过在含有选择试剂的培养基中的细胞生长来选择可选择标记，例如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418。参见美国专利4,965,199。
用于酵母中的合适选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。trp1基因提供一种选择缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株的选择标记，例如，ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，8512(1977)。在酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤，提供用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似地，Leu2缺陷的酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)用携带Leu2基因的已知质粒互补。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可以被用于克鲁维氏酵母的转化。可选择地，用于大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统被报道用于乳克鲁维氏酵母(K.lactis)。Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)。用于通过工业用克鲁维氏酵母菌株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体也已经被公开。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
启动子组分表达和克隆载体通常含有被宿主生物体识别的启动子，并且启动子被可操作地连接到抗ErbB2抗体核酸上。适合用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子特性和杂合启动子，例如tac启动子。但是，其他已知细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子也将含有被可操作地连接到编码抗ErbB2抗体的DNA上核糖体结合序列(SD序列)。
真核细胞的启动子序列是已知的。实际上所有真核基因具有富含AT的区域，位于转录起始位点上游约25-30个碱基处。另一种存在于许多基因的转录起始上游的70-80个碱基处的序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端为AATAAA序列，其可作为将聚腺苷酸尾加到编码序列的3′端的信号。所有这些序列被合适地插入到真核表达载体中。
用于酵母宿主的合适起始序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶的启动子，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。
其他酵母启动子，其是具有受生长条件控制的额外转录优势的可诱导启动子，是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。用于酵母表达的合适载体和启动子进一步被描述在EP 73,657中。酵母增强子还有利地与酵母启动子一起使用。
抗ErbB2抗体从哺乳动物宿主细胞的载体加以转录是受例如获自病毒基因组的启动子控制，这些病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物的启动子控制，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子的控制，只要该启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子方便地作为SV40的限制性片段获得，该片段还含有SV40病毒的复制起点。人巨细胞病毒的即刻早期启动子便利地作为HindIII E限制性片段获得。采用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统被公开在美国专利4,419,446中。该系统的改进在美国专利4,601,978中被描述。还可以参见Reyes等，Nature，297598-601(1982)关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下表达人β-干扰素cDNA的描述。可选择地，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列可以被用作启动子。
增强子元件组分经常通过将增强子序列插入载体来提高通过高等真核细胞转录编码本发明的抗ErbB2抗体的DNA。目前已经知晓许多来自哺乳动物基因的增强子序列(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，典型地可以使用来自真核细胞病毒的增强子。该例子包括位于复制起点的晚期侧(bp 100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，和腺病毒增强子。还可以参见Yaniv，Nature，29717-18(1982)关于激活真核启动子的增强元件的描述。增强子还可以被剪接到载体的抗ErbB2抗体编码序列的5′或3′位置上，但是优选位于启动子的5′位置上。
转录终止组分用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体也含有转录终止和稳定mRNA所需的序列。这种序列通常从真核或病毒DNA或cDNA的5′端和，偶尔从3′端，非翻译区获得。这些区域含有在编码抗ErbB2抗体的mRNA的非翻译部分作为多聚腺苷酸片段被转录的核苷酸片段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多聚腺苷酸区域。参见W094/11026以及其中描述的表达载体。
宿主细胞的选择和转化用于在载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞在此是上文描述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。用于该目的合适原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠细菌属(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属，如大肠杆菌，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏杆菌属(Erwinia)，克雷白氏杆菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺菌属(Shigella)，以及芽胞杆菌(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)(例如1989年4月12日公开在DD 266,710中的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌(Streptomyces)。虽然其他菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)是合适的，优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31，446)。这些例子是说明性的，而不是限制性的。
除了原核微生物，真核的微生物例如丝状真菌或者酵母是抗ErbB2抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母或者通常的面包(baker)酵母最普遍地被用于低等真核宿主微生物中。但是，大量其他属、种和菌株也是通常获得并在此有用的，例如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维氏酵母(Kluyveromyces)宿主例如乳克鲁维氏酵母、脆壁克鲁维氏酵母(ATCC 12，424)、保加利亚克鲁维氏酵母(ATCC 16，045)、威克曼氏克鲁维氏酵母(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC 56，500)、果蝇克鲁维氏酵母(ATCC 36，906)、耐热克鲁维氏酵母K.thermotolerans和马克斯克鲁维氏酵母；yarrowia(EP 402，226)；巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(EP183，070)；假丝酵母属(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244，234)；粗糙链胞霉(Neurosporacrassa)；许旺氏酵母例如西方许旺氏酵母；和丝状真菌例如脉胞菌(Neurospora)，青霉菌(Penicillium)，Tolypocladium，和曲霉菌(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉和黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化的抗ErbB2抗体的合适宿主来自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。许多来自例如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的杆状病毒菌株和突变体以及相应允许昆虫宿主细胞已经被确定。各种用于转染的病毒株是公众可以获得的，例如苜蓿银斜纹夜蛾(Autographa califomica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，而且这些病毒可以被用作按照本发明的病毒，特别地用于草地夜蛾细胞的转染。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可以被用作宿主。
但是，脊椎动物细胞是最令人感兴趣的，在培养物中繁殖脊椎动物细胞(组织培养)已经是常规操作。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293或在悬浮培养物中生长的亚克隆293细胞，Graham等，J.Gen Virol.，3659(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠滋养细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.，38344-68(1982))；MRC 5细胞；ES4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
宿主细胞用上面描述的用于抗ErbB2抗体生产的表达或克隆载体转化，并且培养在常规的营养培养基中，该培养基被改进以适合诱导启动子、选择转化体或者扩增编码期望序列的基因。
培养宿主细胞用于生产本发明的抗ErbB2抗体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。商业上可以购买得到的培养液例如Ham′s F10(Sigma)、Minimal EssentialMedium((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium((DMEM)，Sigma)都适合用于培养宿主细胞。此外，任何在Ham等，Meth.Enz.，5844(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.，102255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中描述的培养基可以被用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可以必要地添加激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或相当的能量来源。还可以包括本领域技术人员知晓的合适浓度的任何其他需要的添加剂。培养条件，例如温度、pH等是先前用于被选择来表达的宿主的那些条件，并且对本领域技术人员来说是显然的。
抗ErbB2抗体的纯化当采用重组技术时，抗体在细胞内、周质间隙中生成，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，作为第一步，例如，通过离心或者超滤去除颗粒碎片，宿主细胞或者裂解碎片。Carter等，Bio/Technology，10163-167(1992)描述用于分离抗体的操作，抗体被分泌到大肠杆菌的周质间隙。简而言之，在存在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时，解冻细胞糊超过约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。当抗体被分泌到培养基中时，通常首先采用商业上可购买得到的蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元，浓缩得自该表达系统的上清液。在任何先前的步骤中可以包括蛋白酶抑制剂例如PMSF来抑制蛋白质水解，也可以包括抗生素来防止外来的污染物的生长。
制备自细胞的抗体组合物可以被纯化，采用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲合层析，亲合层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲合配基的合适程度取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以被用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.，621-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠的同种型和人γ3(Guss等，EMBO J，515671575(1986))。亲合配基附着的基质最普遍为琼脂糖，但是也可以使用其他基质。机械上稳定的基质例如控制孔的玻璃或者多聚(苯乙烯二乙烯)苯，具有比琼脂糖所能达到的更高的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)被用于纯化。根据回收的抗体，还可以采用其他用于蛋白质纯化的技术，例如在离子交换柱上进行分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅石上进行层析，在肝素琼脂糖上层析，在阴离子或阳离子交换树脂(例如多聚天冬氨酸柱)上层析，色谱聚焦，SDS-PAGE，以及硫酸胺沉淀。
在初步纯化步骤之后，包含目标抗体和污染物的混合物进行低pH的疏水相互作用层析，采用pH为约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度下进行(例如从约0-0.25M盐)。
药物制剂用于根据本发明的抗体的治疗制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合被制备来用于以冻干制剂形式或者水溶液形式进行存储。(雷明顿药物科学(Remington′s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.编辑(1980))，可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对于受者来说是无毒的，并且包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯胺；苄乙胺；苯酚，丁基或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲苯酚)；小分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或者免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子(salt-forming counter-ions)例如钠；金属复合物(例如Zn蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选的冻干抗ErbB2抗体制剂被描述在WO 97/04801中，特别地在此引入作为参考。
本文的制剂还可以含有受处理的特定适应症所需的一种以上活性化合物，优选是那些具有不会相互产生不利影响的互补活性的化合物。例如，期望在一个制剂中还进一步提供结合EGFR，ErbB2(例如结合到ErbB2的不同表位上的抗体)、ErbB3、ErbB4或血管上皮因子(VEGF)的抗体。可选择地或另外地，该组合物还进一步可以包含化学治疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、EGFR靶向药物、抗血管生成剂，和/或心脏保护剂。这种分子适合以有效用于所需目的的含量而结合存在。
在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或者在大分子乳剂中，活性成分还可以被包裹在例如通过凝聚技术或者通过界面聚合制备的微囊中，例如分别为羟甲基纤维素或者明胶微囊和poly-(methylmethacylate)微囊。这种技术被描述在雷明顿药物科学第16版，Osol，A.编辑，(1980)中。
可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半通透性基质，这种基质是成形物品的形式，例如，膜或者微囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如多聚(2-羟基乙基异丁烯酸)或者多聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解的乙烯乙烯基乙酸、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide acetate组成的可注射微球)，和多聚D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的制剂必须被灭菌。这很容易地通过灭菌滤膜过滤来实现。
用抗ErbB2的抗体治疗可以预期，按照本发明，抗ErbB2抗体可以被用于治疗各种疾病或紊乱。示例性的症状或紊乱包括良性的或恶性的肿瘤；白血病和淋巴恶性肿瘤；其他的紊乱例如神经元的、神经胶质的、星形胶质细胞的、下丘脑的、腺的、巨噬细胞的、上皮的、基质的、囊胚的、炎症性的、血管生成的和免疫学的紊乱。优选地，抗ErbB2的抗体被用于治疗被鉴定为对用这种抗体通过本文公开的方法治疗响应的肿瘤。
一般地，将被治疗的疾病或紊乱是癌症。在此将被治疗的癌症的例子包括，但是不限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或者淋巴恶性肿瘤。这种癌症的更加特别的例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃的或者胃癌包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾脏或肾癌，前列腺癌，阴门癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，以及头部和颈部癌。优选地，被治疗的癌症被鉴定为对用抗ErbB2的抗体处理响应，该响应是基于肿瘤样本中对HER2/HER3和/或HER2/HER1异二聚体的鉴定或者ErbB受体的磷酸化。其中HER2/HER3和/或HER2/HER1异二聚体形成和/或ErbB受体磷酸化期望被检测的特定的一组癌症包括，但是不限于肺乳腺癌、肺癌、卵巢癌，包括进展的、难治的或者周期性发生的卵巢癌、前列腺癌，结肠直肠癌和胰腺癌。
癌通常包含表达ErbB2的细胞，使得此处的抗ErbB2抗体能够结合到癌上。虽然癌可以被表征为过度表达ErbB2受体，本申请进一步提供一种用于治疗不被认为是过度表达ErbB2的癌症的方法。为了确定癌中的ErbB2表达，可以采用各种诊断的/预后的分析。在一个实施方案中，可以通过IHC分析ErbB2过度表达，例如采用HERCEPTEST(Dako)。来自肿瘤活组织检查的石蜡包埋的组织切片可以被用于IHC分析，并给予如下的ErbB2蛋白质染色强度标准分值0没有观察到染色或者在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。
分值1+在超过10％肿瘤细胞中检测到浅的/刚刚可察觉的膜染色。该细胞仅部分膜被染色。
分值2+在超过10％的肿瘤细胞中观察到微弱到中度的完整膜染色。
分值3+在超过10％的肿瘤细胞中观察到中度到强烈的完整膜染色。
那些在ErbB2过度表达评价中具有0或1+分值的肿瘤可被表征为不过度表达ErbB2，而那些具有2+或3+分值的肿瘤可被表征为过度表达ErbB2。
可选择地或者另外地，FISH分析例如INFORMTM(Ventana，Arizona销售)或PATHVISIONTM(Vysis，Illinois)可以在福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织上进行来确定肿瘤中ErbB2的过度表达(如果有)的程度。
在一个实施方案中，该癌症可以是表达(可能，但是不是必需，过度表达)EGFR的癌症。表达/过度表达EGFR的癌症的例子包括鳞状细胞癌症(例如上皮鳞状细胞癌症)，肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)，肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃的或胃癌包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾或者肾的癌，前列腺癌，阴门癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌以及头部和颈部癌症。
本发明特别适合用于鉴定乳腺癌、前列腺癌，例如阉割抗性前列腺癌(CRPC)，以及卵巢癌患者，这些患者可能对用抗HER2抗体治疗产生良好的应答，抗HER2抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化，例如单克隆抗体2C4或rhuMAb 2C4。
在此治疗的癌症可以是特征为ErbB受体例如EGFR过度活化的癌症。这种过度活化可能是由于ErbB受体或ErbB配基过度表达或者产量升高。在本发明的一个实施方案中，可以进行诊断的或者预后的分析来确定患者的癌症其特征是否为ErbB受体过度活化。例如，可以确定癌中ErbB基因扩增和/或ErbB受体过度表达。用于确定这种扩增/过度表达的各种分析在本领域是可以获得的，并且包括上面描述的IHC、FISH和脱落抗原(shedantigen)分析。可选择地或者另外地，肿瘤中或与肿瘤相关的ErbB配基的含量，例如TGF-a，可以按照已知的操作来确定。这种分析可以检测被检测的样本中的蛋白质和/或编码蛋白质的核酸。在一个实施方案中，可以采用免疫组织化学(IHC)确定肿瘤中的ErbB配基水平；参见例如，Scher等，Clin.Cancer Research，1545-550(1995)。可选择的或者另外地，可以例如通过FISH、DNA印迹或PCR技术评价被检测的样本中的ErbB配基编码核酸的水平。
此外ErbB受体或ErbB配基过度表达或者扩增可以采用体内诊断分析来评价，例如通过施用结合到将被检测的分子上并且用可检测标记(例如放射性同位素)标引的分子(例如抗体)，并从外部扫描患者来对标记定位。
当被治疗的癌症是不依赖于激素的癌症时，肿瘤中激素(例如雄性激素)和/或其相关受体的表达可以采用各种可以获得的分析方法中的任何方法来评价，例如上面所描述的方法。可选择地或者另外地，患者可能被诊断为患有不依赖激素的癌症，其中这些癌症不再对抗雄性激素的治疗有反应。
在一些实施方案中，包含被偶联到细胞毒性剂上的抗ErbB2抗体的免疫偶联物被施用给患者。优选地，免疫偶联物和/或其所结合的ErbB2蛋白被细胞内化，导致免疫偶联物杀死其所结合的癌细胞的治疗功效被提高。在优选实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。这种细胞毒性剂的例子包括美登木素生物碱、加利车霉素、核糖核酸酶和DNA核酸内切酶。
在特定实施方案中，被施用的抗体是rhuMAb 2C4，或其功能性等价物。RhuMAb 2C4是基于人IgGl骨架序列的人源化的单克隆抗体，由两条重链(449个残基)和两条轻链(214个残基)组成。RhuMAb 2C4在轻链和重链的表位结合区域上显著地区别于另一抗HER2抗体HERCEPTIN(Trastuzumab)。结果，rhuMAb 2C4结合到HER2上的完全不同的表位上。本发明提供用于检测对用rhuMAb 2C4或其功能性等价物处理响应的癌症的灵敏的方法。应当指出，这种对rhuMAb 2C4处理响应的癌症不要求是过度表达HER2。
按照已知的方法，例如静脉内给药，例如大药丸或者在一段时间内通过连续灌注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑液内、壳膜内、口服、局部或者吸入路径将抗ErbB2抗体或免疫偶联物施用给人类患者。静脉内或皮下施用抗体是优选的。
其他的治疗方案可以与施用抗ErbB2抗体组合。组合施用包括共施用，采用分离的制剂或者单一的药物制剂，以及以任何顺序的连续施用，其中优选存在一段两种(或全部)的活性试剂同时产生其生物学活性的时期。
在一个特定实施方案中，患者用两种不同的抗ErbB2抗体治疗。例如，患者可以用阻断ErbB受体的配基活化的第一抗ErbB2抗体或者具有单克隆抗体2C4的生物学特征的抗体，以及抑制生长的第二抗ErbB2抗体(例如HERCEPTIN)或诱导过度表达ErbB2的细胞凋亡的抗ErbB2抗体(例如，7C2，7F3或其人源化变体)处理。优选地，这种组合治疗方法导致协同的治疗作用。例如，可以用HERCEPTIN治疗患者，然后用rhuMAb 2C4治疗，例如当患者对HERCEPTIN治疗没有反应时。在另一个实施方案中，患者首先用rhuMAb 2C4治疗，然后接受HERCEPTIN治疗。在还有另一个实施方案中，患者可以同时用rhuMAb 2C4和HERCEPTIN治疗。
还期望将施用抗ErbB2抗体或多个抗体，与施用针对另一种肿瘤相关抗原的抗体组合。在这种情况下，其他抗体可以例如结合EGFR、ErbB3、ErbB4或血管内皮生长因子(VEGF)。
在一个实施方案，本发明的处理包括组合施用抗ErbB2抗体(或者多个抗体)以及一种或多种化疗剂或者生长抑制剂，包括共施用不同化学治疗剂的混合物，优选的化疗剂包括优选的化疗剂包括紫杉烷二萜(taxane)(例如泰素和多西他赛)和/或蒽环霉素抗生素。这种化疗剂的制备和剂量方案可以按照生产商推荐或者如通过熟练技术人员经验性确定来使用。用于这种化疗剂的制备和剂量方案也被描述在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中。
抗体可以以这种抗激素化合物的已知剂量与抗激素化合物组合；例如抗雌激素化合物如他莫西芬；抗孕酮如奥那斯酮(参见EP 616812)；或抗雄性激素例如氟他胺。当被治疗的癌症是不依赖于激素的癌症时，患者可以先进行抗激素治疗，在癌症变为激素不依赖后，给患者施用抗ErbB2抗体(以及任选地在此所描述的其他试剂)。
有时，给患者共施用心脏保护剂(来防止或者降低与治疗相关的心肌功能障碍)或者一种或多种细胞因子是有益的。还可以共施用EGFR靶向药物或者抗血管生成剂。除了上述治疗方案外，可以对患者手术去除癌细胞和/或放射治疗。
在此抗ErbB2抗体还可以与EGFR靶向的药物组合，这些药物如在定义部分中讨论的会产生互补的、和潜在的协同治疗作用的那些药物。
可以与抗体组合的其他药物的例子包括化疗剂，例如卡铂、紫杉烷二萜(taxane)(例如泰素或多西他赛)、吉西他滨、失碳长春碱、顺铂、奥沙利铂，或任何这些药物的组合例如卡铂/多西他赛；其他的抗HER2抗体(例如生长抑制性抗HER2抗体，例如HERCEPTIN，或诱导凋亡的抗HER2抗体，例如7C2或7F3，包括其人源化的或亲合成熟的变体)；法呢基转移酶抑制剂；抗血管生成剂(例如，抗VEGF抗体)；EGFR靶向药物(例如，C225或ZD1839)；细胞因子(例如，IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；或上面这些的组合。
任何上述的共施用的试剂的适合剂量是目前使用的那些，并且由于试剂和和抗ErbB2抗体的组合作用(协同作用)，可以被降低。
对于疾病的预防或治疗，适合的抗体剂量将取决于如上所定义的被治疗的疾病的类型，无论抗体被施用以用于预防或治疗目的的疾病的严重程度和进程，先前的治疗、患者的病史和对抗体的反应，以及主治医生的判断。抗体被一次或者经过一系列治疗被合理地施用给患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg到15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体是施用给患者的起始候选剂量，无论是，例如，通过一次或多次分开施用，或者通过连续灌注。典型的日剂量可以在1μg/kg到100mg/kg或更高的范围内，取决于上面提及的因素。对于在数天或更长时间内重复施用，根据症状，持续进行治疗直到产生期望的对疾病的抑制。优选的抗体剂量将在约0.05mg/kg到约10mg/kg范围内。因此，可以给患者施用一个或多个约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的剂量(或者它们的任意组合)。这种剂量可以被间断地施用，例如每周或每三周(例如，使得患者接受约2个到约20个，例如约6个剂量的抗ErbB2抗体)。施用起始的较高的载入剂量，接着施用一个或多个较小的剂量。示例性的剂量方案包括施用约4mg/kg的起始载入剂量，接着约2mg/kg抗ErbB2抗体的每周维持剂量。但是，其他剂量方案也是有用的。这种治疗的进展很容易通过常规技术和分析方法来监控。
在特定实施方案中，rhuMAb 2C4以420mg的固定剂量(相当于70kg体重的个体6mg/kg的剂量)被每三周施用。治疗以较高的载入剂量开始(例如840mg，相当于12mg/kg体重)以更加迅速地达到稳定状态的血清浓度。特定的剂量方案也被提供在下面的实施例中。
除了将抗体蛋白施用给患者，本申请还考虑了通过基因治疗来施用抗体。这种施用编码抗体的核酸包括在“施用治疗有效量的抗体”的表述中。参见，例如1996年3月14日公开的WO 96/07321，其涉及使用基因治疗来产生细胞内抗体。
有两种主要方法来将核酸(优选被含在载体中)体内和回体(ex vivo)地导入患者细胞中；对于体内递送，核酸被直接注射给患者，通常在需要抗体的部位。对于回体治疗，患者细胞被取出，将核酸导入到这些被分离的细胞中，被修饰的细胞被直接地或者例如被包囊在被植入患者中的多孔膜中，施用给患者，(参见例如，美国专利4,892,538和5,283,187)。有各种技术可以用于将核酸导入活细胞中。根据核酸被体外转化到培养细胞或者体内转化到预期宿主的体内细胞中，这些技术是不同的。适合用于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀方法等。用于基因回体递送的常用载体是逆转录病毒。
普遍优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(例如腺病毒，单纯疱疹I病毒或者腺伴随病毒)转染和以脂质为基础的系统(用于基因的脂质介导的转移的有用脂质是，例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)。在某些情况下，期望用靶向目标细胞的试剂提供核酸来源，例如特异于细胞表面膜蛋白或者目标细胞的抗体，目标细胞的受体的配基等。当采用脂质体时，结合到与细胞内吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白可以被用于靶向和/或方便摄取，例如趋向(tropic)特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段，在循环中进行内在化的蛋白质的抗体，和靶向细胞内定位和增强细胞内半衰期的蛋白质。受体介导的内吞作用的技术被描述，例如在Wu等，J.Biol.Chena.，2624429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873410-3414(1990)中。对目前已知的基因制备和基因治疗方案的评论参见Anderson等，Science，256808-813(1992)。还可以参见WO 93/25673和其中引用的参考文献。
制品在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗上面描述的紊乱的材料的制品。
制品包含一个容器和在容器上或者与容器关联的标签或包装插入物。合适的容器包括，例如瓶子、小管、注射器等。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。容器中装有有效治疗症状的组合物，可能具有无菌的存取口(access port)(例如该容器是静脉溶液袋或者具有可以被皮下注射针头穿过的塞子的小管)。组合物中至少一种活性试剂是抗ErbB2抗体。标签或包装插入物指明该组合物是用于治疗特定的症状，例如癌症。在一个实施方案中，标签或包装插入物指明包含结合ErbB2的抗体的组合物可以被用于治疗患有肿瘤的患者，该肿瘤中已经鉴定了存在HER2/HER1和/或HER2/HER3和/或HER2/HER4复合物，和/或已经检测到ErbB受体的磷酸化。而且，制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含结合ErbB2并抑制ErbB2过度表达的癌细胞生长的第一抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含结合ErbB2并阻断ErbB受体的配基活化的第二抗体。在本发明的这个实施方案中，制品可进一步包含指明第一和第二抗体组合物可以被用于治疗癌症的包装插入物，该癌症的特征在于存在HER2/HER1和/或HER2/HER3和/或HER2/HER4异二聚体，和/或ErbB受体磷酸化。而且包装插入物可能教导组合物(包含结合ErbB2并阻断ErbB受体的配基活化的抗体)的使用者将用抗体治疗以及任何在前面部分描述的辅助治疗(例如化疗剂，EGFR靶向药物，抗血管生成剂，抗激素化合物，心脏保护剂和/或细胞因子)组合。可选择地或者另外地，制品可进一步包含第二个(第三个)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格液和葡萄糖液。还可以进一步包括商业或用户角度期望的其他物质，包括其他的缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
抗体还可以被用于诊断分析。一般地，抗体如上面的方法所描述被标记。为了方便，本发明的抗体可以在试剂盒中提供，即试剂以预定的含量与实施诊断分析的说明书一起包装组合。当抗体用酶标记时，该试剂盒将包括底物和酶所需的辅助因子(例如提供可检测的生色团或荧光团的底物前体)。此外，可以包括其他添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液或溶解缓冲液)等。各种试剂的相对含量可以广泛地变化来在试剂液中提供一定浓度，该浓度充分地优化分析的灵敏度。特别地，试剂可以以通常是冻干的粉末形式提供，包括溶解后提供具有合适浓度的试剂液的赋形剂。
材料保藏如下的杂交瘤细胞系已经被保藏在美国典型培养物保藏中心，10801Univevsity Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，美国(ATCC)

前面所撰写的说明书足以使本领域技术人员实施本发明。由于保藏的实施方案用于说明仅仅是发明的某些方面，并且任何功能相当的构建体属于本发明的保护范围，本发明将不被限制在被保藏的构建体的范围内。此处的材料保藏并不是承认本文包含的所撰写的说明书不足以实现本发明的任何方面，包括其最佳实施方式，也不被解释为限制权利要求的范围。实际上，根据前面的描述，除了本文给出和描述的那些外，本发明的各种改进对本领域技术人员来说是显而易见的，并且落入附随的权利要求书的范围内。
应当理解，按照本文包含的教导，将本发明的教导应用于特定问题或情形属于本领域技术人员能力范围内的事。
本发明的更加详细内容将通过如下的非限制性实施例来阐明。所有在说明书中引用的文献的公开在此特别地被引入作为参考。
实施例1HRG依赖的ErbB2与ErbB3的结合被单克隆抗体2C4阻断WO 01/89566中描述了特异性地结合ErbB2的细胞外结构域的鼠单克隆抗体2C4，该文献公开的内容在此特别地全文引入作为参考。
在共免疫沉淀实验中检测ErbB3与ErbB2的联合能力。1.0×106MCF7或SK-BR-3细胞被植入含有10％胎牛血清(FBS)和10mM HEPES，pH 7.2的5050 DMEM/Ham′s F12培养基(生长培养基)的6孔组织培养平板中，并使其附着过夜。在开始实验前，细胞在无血清的生长培养基中饥饿2小时。用磷酸缓冲盐水(PBS)简单地洗涤细胞，然后与稀释在0.2％w/v牛血清白蛋白(BSA)、具有10mM HEPES，pH7.2的RPMI培养基(结合缓冲液)中100nM指定抗体，或者仅与结合缓冲液(对照)一起孵育。在室温下1h后，HRG以5nM终浓度加到半数孔中(+)。将类似体积的结合缓冲液加到其他孔中(-)。继续孵育约10分钟。
吸取以去除上清液，在含有0.2mM PMSF、10μg/ml亮抑酶肽和10TU/ml抑酶肽的RPMI，10mM HEPES，pH 7.2，1.0％v/v TRITON X-100TM，1.0％w/v CHAPS(裂解缓冲液)中裂解细胞。通过离心来去除裂解液中的不溶物质。
用共价偶联到亲合凝胶(Affi-Prep 10，Bio-Rad)上的单克隆抗体免疫沉淀ErbB2。这一抗体(Ab-3，Oncogene Sciences，USA)识别胞质结构域表位。通过往每一裂解物中加入10μl的含有约8.5μg固定抗体的凝胶浆液来进行免疫沉淀，样本在室温下混合2h。然后通过离心来收集凝胶。用裂解缓冲液批量洗涤凝胶三次来去除未被结合的物质。然后加入SDS样本缓冲液，在沸腾的水浴中简单地加热样本。
在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上对上清液进行电泳，电印迹到硝化纤维膜上。通过用抗ErbB3的胞质结构域表位的多克隆抗体(c-17，Santa CruzBiotech)探查印迹来评价是否存在ErbB3。用化学发光底物(ECL，Amersham)来观察印迹。
如在分别对应于MCF7和SK-BR-3细胞的附图2A和2B的对照泳道所示，ErbB3存在于仅当细胞用HRG刺激的细胞时的ErbB2沉淀物中。如果细胞首先用单克隆抗体2C4温育，ErbB3信号在MCF7细胞中消失(附图5A，泳道2C4+)或在SK-BR-3细胞中实质性地降低(附图5B，泳道2C4+)。如在附图2A-B中所示，在MCF7和SK-BR-3细胞中，单克隆抗体2C4阻断heregulin依赖的ErbB3与ErbB2的结合显著地比HERCEPTIN有效。用HERCEPTIN预孵育降低MCF7裂解产物中的ErbB3信号，但是对从SK-BR-3裂解产物中共沉淀的ErbB3的量的作用很小，或者不起作用。在任一细胞系中，用抗EGF受体的抗体(Ab-1，Oncogene Sciences，USA)预孵育对ErbB3共免疫沉淀ErbB2的能力没有影响。
实施例2细胞系和人肿瘤异种移植模型对2C4的反应性大约检测了40个肿瘤模型对2C4的反应性。这些模型代表了主要的癌症，例如乳腺、肺、前列腺和大肠。50-60％的模型对2C4处理产生反应。下面的表1列举所选择的被检测对2C4反应性的肿瘤模型。简而言之，将约3mm大小的人肿瘤异种移植碎片移植到无胸腺裸鼠的皮肤下。或者，从培养皿中分离体外生长的人肿瘤细胞，重悬在磷酸盐缓冲盐水中，并皮下注射到无免疫应答的小鼠的胁部。采用电测径器(electric caliper)每2-3天监控肿瘤的生长。
当肿瘤达到大约30-100mm大小时，动物随机地分成不同的处理和对照组。每周一次通过腹膜内注射施用2C4。对照动物按照与处理组相同的方案接受相同体积不含抗体的载体溶液。在约3-6周后，当对照组的肿瘤达到约1000-1500mm3的大小时，结束研究。对处理有反应被定义为肿瘤体积减小≥50％。
表1异种移植模型


该模型代表两种主要肿瘤模型，即非小细胞肺癌(NSCLC；模型#1-13)和乳腺癌(模型#14-18)。NSCLC模型中的9种(#1-9)和所有的乳腺癌模型是通过在免疫缺陷小鼠中连续体内传代人肿瘤碎片得到。剩下的NSCLC模型(#10-13)是以细胞为基础的模型，其中体内肿瘤生长是通过将体外繁殖的细胞移植到无免疫应答小鼠中来诱导。
Berger，D.P.，Winterhalter，B.R.，和Fiebig，H.H.(1992).在胸腺发育不全裸鼠中人肿瘤异体移植的建立和表征Immunodeficient Mice in Oncology，H.H.Fiebig和D.P.Berger，编辑(BaselKarger)，23-46.
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实施例3通过免疫沉淀检测2C4响应的肿瘤中的异二聚体对2C4反应和不反应的肿瘤进行抗ErbB2抗体免疫沉淀来分析是否存在ErbB2-ErbB3和EGFR-ErbB2异二聚体。除非另外说明，该方法按照“Maniatis T.等，分子克隆实验室手册，冷泉港，纽约，美国，冷泉港出版社，1982”来实施。
选择不发生交叉反应的抗HER2、抗HER3和抗HER1的抗体。为了确定抗体是否发生交叉反应，在人胚胎肾(HEK)293细胞中表达HER1、HER2、HER3和HER4受体。用含有HEPES缓冲液(pH 7.5)的TritonTMX100(1％w/v)裂解细胞。大约20μg来自对照细胞和表达HER1，HER2，HER3和HER4的细胞的细胞总蛋白在SDS凝胶上分离，并通过半干印迹操作被转移到硝化纤维膜上。用明胶阻断后，检测各种抗HER1、抗HER2和抗HER3的抗体针对其他ErbB受体的交叉反应性。被选择用于下面描述的实验的抗体不表现出任何显著的交叉反应性。
在冰上机械碾碎新鲜的肿瘤样本，并在含有50mM HEPES pH 7.5、150mMNaCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、10％(w/v)甘油、1％(w/v)TritonTMX-100、1mM PMSF、10μg/ml抑酶肽和0.4mM原钒酸盐的缓冲液中裂解。离心完全裂解的肿瘤数次，直到上清液完全清澈。通过在1.5ml Eppendorf反应管中，结合澄清的肿瘤裂解物(5-7mg蛋白/裂解物)、5μg抗ErbB2抗体(ab-3，小鼠单克隆；目录号OP15，Oncogene Inc.，USA)和50μl蛋白G偶联的琼脂糖来进行免疫沉淀。在加入1-2倍体积的含有0.1％(w/v)TritonTMX-100的50mM HEPES缓冲液，pH 7.5后，在4℃下转动试管3-4小时，接着进行离心。用500μl的含有0.1％(w/v)TritonTMX-100的50mM HEPES缓冲液pH7.5洗涤沉淀2-3次。将等量体积的2x Lammli样本缓冲液加入到被洗涤的免疫沉淀物中，在95℃下加热样本5分钟。通过SDS-PAGE分离样本，并转移到硝化纤维膜上。通过用抗EGFR抗体(抗EGFR的兔多克隆抗体，Upstate Inc.，USA；目录号06-847)和抗ErbB3的抗体(抗ErbB3的多克隆抗体；Santa Cruz Inc.，USA；目录号SC-285)探测印迹来评价是否存在EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3异二聚体。过氧化物酶(POD)标记的抗兔Fc抗体(BioRad Laboratories Inc.USA)被用作第二抗体。采用化学发光底物(ECL plus，Amersham)观察印迹。
附图3显示这些实验的结果。可以看出存在ErbB2-ErbB3和/或EGFR-ErbB2异二聚体。观察到如表1所示的2C4反应性与存在ErbB2-ErbB3和/或EGFR-ErbB2异二聚体之间的关联。
实施例4对rhuMAb 2C4的反应性与HER2磷酸化之间的关联已经在14个被植入小鼠中的人肿瘤(9个肺癌和5个乳腺癌)中研究了rhuMAb 2C4对肿瘤生长的作用。如实施例2所描述进行肿瘤外植和处理。如在实施例3中所描述检测HER2异二聚体。
通过免疫沉淀HER2和蛋白质印迹分析来评价HER2磷酸化。凝胶上存在磷酸HER2条带确定为阳性。不存在该条带确定为阴性。采用磷酸特异性抗HER2抗体(克隆PN2A，Thor等，J.Clin.Oncol.，183230-9(2000))通过免疫组织化学证实HER2磷酸化。
在被检测的肿瘤的5种(3种肺癌和2种乳腺癌)中，观察到肿瘤生长被显著地抑制，这与存在可检测的HER2与HER1或HER3的异二聚体，以及在所有情况下强烈的HER2磷酸化相关。观察到9种肿瘤中没有对rhuMAb 2C4处理的显著反应，没有检测到异二聚体，并且不存在HER2磷酸化。在非临床模型中，存在HER2异二聚体化或者显著的HER2磷酸化有力地指示对rhuMAb 2C4处理有反应。在由肿瘤细胞系产生的异种移植中也获得相似的观察结果。
实施例5在对2C4响应的肿瘤中检测HER2的磷酸化在9个已经建立的非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植的肿瘤模型(LXFE211，LXFA 289，LXFA 297，LXFE 397，LXFA 526，LXFL 529，LXFA 629，LXFA 1041，LXFL 1071，Oncotest GmbH，Freiburg，Germany)中评价rhuMAb2C4的功效。由于患者的肿瘤以固体瘤生长，产生基质、维管结构、中央坏死并且表现为圆顶分化，人肿瘤异种移植被认为是作为抗癌药物开发的最相关模型。此外，异种移植的肿瘤模型在组织学和化学敏感性上与原始肿瘤非常接近。
如实施例2中所描述评价生长抑制。显著的生长抑制活性被定义为相对于对照组，抑制处理组的＞50％的生长。在NSCLC模型中的三个中(LXFA297，LXFA 629，和LXFL 1072)，观察到显著的对rhuMAb 2C4处理的生长抑制反应。在蛋白质水平上还研究了配基活化HER2的多个特征。如附图4中所示，可以从9个NSCLC肿瘤中的8个的肿瘤提取物中免疫沉淀HER2。为了确定HER2的活化状态，然后用抗磷酸酪氨酸(抗PY)抗体探测这些印迹。如在附图4的下面组中所示，三个响应肿瘤(LXFA 297，LXFA 629和1072)显示强烈的HER2活化。
实施例6通过检测HER2异二聚体来鉴定用rhuMAb 2C4治疗的肺癌患者的临床研究如果来自患者的肿瘤被发现包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4复合物，该患者被鉴定为患有对用rhuMAb 2C4治疗响应的非小细胞肺癌(NSCLC)。
通过活组织检查或者在手术切除肿瘤的过程中获得肿瘤样本。然后分析该样本是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4异二聚体。
肿瘤细胞或细胞裂解物与特异结合HER2的eTagTM接触。该eTagTM包含可检测部分和特异于HER2的第一结合部分。可检测部分以可裂解接头被连接到第一结合部分上。在足够的结合时间后，去除多余的eTagTM。
肿瘤细胞或细胞裂解物与特异结合HER1或HER3或HER4的第二结合化合物接触。通过洗涤来去除未被结合的化合物。然后激活第二结合化合物。如果第一结合化合物和第二结合化合物十分接近，被激活的第二结合化合物断裂eTagTM中的可裂解接头来产生游离的可检测部分。鉴定样本中的游离部分指示该肿瘤包含HER2/HER1或HER2/HER3或HER2/HER4异二聚体。
在确定患者患有包含HER2/HER1和/或HER2/HER3和/或HER2/HER4异二聚体的肿瘤时，每周或者每3周分别静脉内(IV)施用2或4mg/kgrhuMAb 2C4，直到疾病进展。抗体以多剂量液体制剂形式(以20mg/mL或更高浓度装满20mL)被提供。主要的功效终点包括反应率和安全性。次要功效终点包括总存活率、疾病进展时间、生活质量和/或反应持续时间。
实施例7鉴定用rhuMAb 2C4治疗的癌症患者的临床研究包含癌细胞的生物样本从用于治疗的候选者中获得，例如通过肿瘤组织的活细胞检查，从腹水中抽吸肿瘤细胞或者临床实践中知晓的任何其他方法。通过上面描述的任何技术分析生物样本中的HER2磷酸化例如通过免疫沉淀和蛋白质印迹分析，和/或是否存在HER2/HER3、HER2/HER1和/或HER2/HER4异二聚体。生物样本中HER2磷酸化阳性和/或存在HER2/HER3，HER2/HER1和/或HER2/HER4异二聚体的个体对用rhuMAb2C4处理可能比肿瘤样本中不显示HER2磷酸化或没有检测到异二聚体的患者有更好的反应。
例如，被诊断具有卵巢癌的个体将进行肿瘤组织的活组织检查，或者从腹水液中抽吸肿瘤细胞。通过免疫沉淀和蛋白质印迹分析来分析组织中HER2的磷酸化。这需要最少约250mg肿瘤组织。
一旦确定患者患有为HER2磷酸化阳性的肿瘤(例如，阉割抗性的前列腺癌CRPC或卵巢癌)，在循环1(第一个21天的治疗阶段)的第一天，该患者将接受840mg载入剂量的rhuMAb 2C4，接着在每个后续的21天循环的第一天以持续的静脉灌注的形式接受420mg对于不表现疾病进展迹象的患者，通过每3周的静脉灌注继续治疗，直到1年(17个循环)。根据医生的判断，治疗可以在任何较早时期由于缺乏反应、副作用或者其他原因被停止。
在本公开中引用的全部参考文献，以及其中引用的参考文献在此特别地引入作为参考。
虽然本发明以某些实施方案被描述，本发明不是如此被限定。本领域技术人员将认识到，各种改进是可能的，而不从实质上改变本发明。不需要过度的实验而进行的所有这些改进被包含在本发明的保护范围内。
序列表<110>健泰科生物技术公司(Genentech，Inc.)(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)Koll，HansBossenmaier，BirgitMuller，Hans-JoachimSliwkowski，MarkKelsey，Stephen<120>鉴定对用抗ErbB2抗体处理响应的肿瘤的方法<130>39766-0114PC<150>US 60/396,290<151>2002-07-15<150>US 60/480,043<151>2003-06-20<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>107<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala65 70 75 80Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
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1.鉴定对用抗HER2抗体处理响应的肿瘤的方法，包含a)检测所述肿瘤的样本中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白质复合物的存在；c)当检测到复合物时，则将肿瘤鉴定为对用抗HER2抗体处理响应的肿瘤。
2.权利要求1的方法，其中抗HER2抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化。
3.权利要求1的方法，其中抗HER2抗体是单克隆抗体2C4。
4.权利要求1的方法，其中抗HER2抗体是rhuMAb 2C4。
5.权利要求1的方法，其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白质复合物的存在通过如下步骤检测a)用抗HER2抗体免疫沉淀任何包含HER2的蛋白质复合物；b)用选自由抗HER3抗体和抗HER1抗体组成的组中的抗体与被免疫沉淀的复合物接触；和c)确定抗HER3和/或抗HER1抗体是否与被免疫沉淀的复合物结合，其中如果确定抗HER3和/或抗HER1抗体与被免疫沉淀的复合物结合，则检测到HER2/HER3和/或HER2/HER1复合物。
6.权利要求1的方法，其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白质复合物的存在通过如下步骤检测a)将肿瘤样本与包含荧光团的抗HER2抗体接触；b)将肿瘤样本与选自由抗HER3和抗HER1抗体组成的组中的抗体接触，其中所述抗体包含第二荧光团；c)通过测量荧光共振能量转移确定第一荧光团和第二荧光团是否十分接近，其中如果第一和第二荧光团被确定十分接近，则检测到HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白质复合物的存在。
7.权利要求1的方法，其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白质复合物的存在是通过如下步骤检测的a)将肿瘤样本与第一结合化合物接触，其中所述第一结合化合物包含特异结合HER2的第一靶向结合部分，并且还进一步包含通过可裂解接头连接到第一靶向结合部分的可检测部分；b)将肿瘤样本与第二结合化合物接触，其中该第二结合化合物包含特异结合HER3或HER1的第二靶向结合部分和可活化的裂解剂；c)激活裂解剂，使得如果第一结合化合物和第二结合化合物十分接近，第二结合化合物断裂第一结合化合物中的可裂解接头来产生游离的可检测部分；和d)鉴定游离的可检测部分的存在，其中当鉴定到游离的可检测部分时，检测到HER2/HER3或HER2/HER1蛋白质复合物的存在。
8.权利要求7的方法，其中第一靶向结合部分包含抗HER2抗体或者抗体片段。
9.权利要求7的方法，其中第一靶向结合部分包含HER2受体的配体。
10.权利要求7的方法，其中第二靶向结合部分包含抗HER3抗体或者抗体片段。
11.权利要求7的方法，其中第二靶向结合部分包含HER3受体的配体。
12.权利要求7的方法，其中第二靶向结合部分包含抗HER1抗体或者抗体片段。
13.权利要求7的方法，其中第二靶向结合部分包含HER1受体的配体。
14.权利要求7的方法，其中样本从患有该肿瘤的患者中获得。
15.权利要求14的方法，其中样本通过肿瘤的活组织检查获得。
16.权利要求14的方法，其中样本通过纯化来自患者血液的循环的肿瘤细胞来获得。
17.权利要求14的方法，其中样本是在手术从患者中去除肿瘤的过程中获得。
18.权利要求1的方法，其中肿瘤样本从小鼠中获得。
19.权利要求18的方法，其中肿瘤是异种移植的肿瘤。
20.权利要求19的方法，其中异种移植的肿瘤是通过将人肿瘤碎片移植到小鼠中来制备。
21.权利要求1的方法，其中肿瘤是肺肿瘤。
22.权利要求1的方法，其中肿瘤是乳腺肿瘤。
23.鉴定对用抑制HER2与ErbB受体家族的另一成员结合的抗体处理响应的肿瘤细胞的方法，包含a)提供包含HER2阳性的肿瘤细胞的生物学样本；和b)检测在所述生物学样本中的ErbB受体的磷酸化，其中所述磷酸化指示所述肿瘤细胞对用所述抗体处理响应。
24.权利要求23的方法，其中ErbB2(HER2)受体磷酸化被检测。
25.权利要求23的方法，其中其他成员选自由HER3、HER1和HER4组成的组。
26.权利要求23的方法，其中抗体结合HER2。
27.权利要求26的方法，其中抗HER2抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化。
28.权利要求27的方法，其中抗体是rhuMAb 2C4。
29.权利要求25的方法，其中抗体结合HER3。
30.权利要求25的方法，其中抗体结合HER1。
31.权利要求25的方法，其中抗体结合HER4。
32.权利要求23的方法，另外还包含检测样本中至少一种选自由HER2/HER3、HER2/HER1和HER2/HER4组成的组中的蛋白质复合物的存在。
33.权利要求32的方法，其中通过如下来检测所述蛋白质复合物或多个蛋白质复合物的存在a)用抗HER2抗体免疫沉淀任何包含HER2的蛋白质复合物；b)将被免疫沉淀的复合物与选自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗体组成的组中的至少一种抗体接触；和c)确定所述抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗体是否与被免疫沉淀的复合物结合，其中如果确定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗体与被免疫沉淀的复合物结合，则检测到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4复合物。
34.权利要求32的方法，其中通过如下检测所述蛋白质复合物或多个蛋白质复合物的存在a)将肿瘤样本与包含荧光团的抗HER2抗体接触；b)将肿瘤样本与选自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗体组成的组中的抗体接触，其中所述抗体包含第二荧光团；c)通过测量荧光共振能量转移确定第一荧光团与第二荧光团是否十分接近，其中如果第一与第二荧光团被确定十分接近，则检测到存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物。
35.权利要求32的方法，其中通过如下检测所述蛋白质复合物或多个蛋白质复合物的存在a)将肿瘤样本与第一结合化合物接触，其中所述第一结合化合物包含特异结合HER2的第一靶向结合部分，还进一步包含通过可裂解接头被连接到第一靶向结合部分的可检测部分；b)将肿瘤样本与第二结合化合物接触，其中第二结合化合物包含特异结合HER3或HER1或HER4的第二靶向结合部分和可活化的裂解剂；c)激活裂解剂，使得如果第一结合化合物和第二结合化合物十分接近，则第二结合化合物断裂第一结合化合物的可裂解接头来产生游离的可检测部分；和d)鉴定游离的可检测部分的存在，其中当游离的可检测部分被鉴定时，检测到HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4蛋白质复合物的存在。
36.权利要求35的方法，其中第一靶向结合部分包含抗HER2抗体或抗体片段，或HER2受体的配体。
37.权利要求35的方法，其中第二靶向结合部分包含抗HER3抗体或抗体片段，或HER3受体的配体。
38.权利要求35的方法，其中第二靶向结合部分包含抗HER1抗体或抗体片段，或HER1受体的配体。
39.权利要求35的方法，其中第二靶向结合部分包含抗HER4抗体或抗体片段，或HER4受体的配体。
40.权利要求23的方法，其中生物学样本是从肿瘤活组织检查中获得的组织。
41.权利要求23的方法，其中生物学样本是包含循环的肿瘤细胞和/或循环的血浆蛋白的生物学液体。
42.权利要求23的方法，其中该肿瘤选自由乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌和卵巢癌组成的组。
43.权利要求23的方法，其中ErbB受体磷酸化通过ErbB受体的免疫沉淀和蛋白质印迹分析来确定。
44.权利要求43的方法，其中ErbB受体磷酸化通过凝胶上的磷酸ErbB受体条带的存在来指示。
45.权利要求43的方法，还进一步包含用磷酸特异的抗ErbB受体抗体通过免疫组织化学来证实ErbB受体磷酸化的步骤。
46.权利要求23的方法，其中通过免疫组织化学确定ErbB受体磷酸化。
47.用于预测个体对用抑制HER2与ErbB受体家族的另一成员联合的抗体处理的反应的方法，所述个体被诊断患有HER2阳性肿瘤，该方法包含a)提供从所述个体获得的生物学样本，包含HER2阳性肿瘤细胞；和b)检测所述生物学样本中的ErbB受体的磷酸化，其中所述磷酸化指示所述患者可能对用所述抗体处理有反应。
48.权利要求47的方法，其中所述ErbB受体是ErbB2(HER2)。
49.权利要求47的方法，其中其他成员选自由HER3、HER1和HER4组成的组。
50.权利要求47的方法，其中抗体结合HER2。
51.权利要求50的方法，其中抗HER2抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化。
52.权利要求51的方法，其中抗体是rhuMAb 2C4。
53.权利要求49的方法，其中抗体结合HER3。
54.权利要求49的方法，其中抗体结合HER1。
55.权利要求49的方法，其中抗体结合HER4。
56.权利要求47的方法，另外还包含检测在样本中至少一种选自由HER2/HER3、HER2/HER1和HER2/HER4组成的组中的蛋白质复合物的存在。
57.权利要求56的方法，其中通过如下检测所述蛋白质复合物的存在a)用抗HER2抗体免疫沉淀任何包含HER2的蛋白质复合物；b)将被免疫沉淀的复合物与选自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗体组成的组中的抗体接触；和c)确定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗体是否与被免疫沉淀的复合物结合，其中如果确定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗体与被免疫沉淀的复合物结合，则检测到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4复合物。
58.权利要求56的方法，其中通过如下检测HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物的存在a)将肿瘤样本与包含荧光团的抗HER2抗体接触；b)将肿瘤样本与选自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗体组成的组中的抗体接触，其中所述抗体包含第二荧光团；c)通过测量荧光共振能量转移确定第一荧光团与第二荧光团是否十分接近，其中如果第一荧光团和第二荧光团被确定十分接近，则检测到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物的存在。
59.权利要求56的方法，其通过如下检测HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白质复合物的存在a)将肿瘤样本与第一结合化合物接触，其中所述第一结合化合物包含特异结合HER2的第一靶向结合部分，还进一步包含通过可裂解接头连接到第一靶向结合部分的可检测部分；b)将肿瘤样本与第二结合化合物接触，其中第二结合化合物包含特异结合HER3、HER1或HER4的第二靶向结合部分和可活化的裂解剂；c)激活裂解剂使得如果第一结合化合物与第二结合化合物十分接近，第二结合化合物断裂第一结合化合物中的可裂解接头来产生游离的可检测部分；和d)鉴定游离的可检测部分的存在，其中当鉴定到游离的可检测部分时，则检测到HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4蛋白质复合物的存在。
60.权利要求59的方法，其中第一靶向结合部分包含抗HER2抗体或抗体片段，或HER2受体的配体。
61.权利要求59的方法，其中第二靶向结合部分包含抗HER3抗体或抗体片段，或HER3受体的配体。
62.权利要求59的方法，其中第二靶向结合部分包含抗HER1抗体或抗体片段，或HER1受体的配体。
63.权利要求59的方法，其中第二靶向结合部分包含抗HER4抗体或抗体片段，或HER4受体的配体。
64.权利要求47的方法，其中生物学样本是从肿瘤活组织检查中获得的组织。
65.权利要求47的方法，其中生物学样本是包含循环的肿瘤细胞和/或循环的血浆蛋白的生物学液体。
66.权利要求47的方法，其中肿瘤选自由乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌和卵巢癌组成的组。
67.权利要求47的方法，其中ErbB受体磷酸化通过ErbB受体的免疫沉淀和蛋白质印迹分析来确定。
68.权利要求67的方法，其中ErbB受体磷酸化通过凝胶上存在磷酸ErbB受体条带来指示。
69.权利要求67的方法，还进一步包含采用磷酸特异性抗ErbB受体抗体通过免疫组织化学来证实ErbB受体磷酸化的步骤。
70.权利要求47的方法，其中ErbB受体磷酸化通过免疫组织化学确定。
71.用于鉴定对用抗HER2抗体处理响应的个体的方法，包含a)检测所述个体的循环的肿瘤细胞中的ErbB受体磷酸化，和b)如果检测到所述磷酸化，则确定所述个体可能对用抗HER2抗体处理有反应。
72.权利要求71的方法，其中ErbB2(HER2)磷酸化被检测。
73.权利要求72，其中所述个体是人。
74.权利要求73的方法，还进一步包含用抗HER2抗体处理所述个体。
75.权利要求74的方法，其中所述抗HER2抗体是rhuMAb 2C4。
76.一种治疗患者的方法，包含给患者施用治疗有效量的结合HER2的抗体，其中该患者患有已被确定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4异二聚体的肿瘤。
77.权利要求76的方法，其中抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化。
78.权利要求77的方法，其中抗体是单克隆抗体2C4。
79.权利要求77的方法，其中抗体是rhuMAb 2C4。
80.一种制品，包含含有结合HER2的抗体的容器和用于施用抗体给患有肿瘤的患者的说明书，其中肿瘤已被确定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4异二聚体。
81.权利要求80的制品，其中抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化。
82.权利要求81的制品，其中容器包含单克隆抗体2C4。
83.权利要求81的制品，其中容器包含rhuMAb 2C4。
84.治疗患者的方法，包含给患者施用治疗有效量的结合HER2的抗体，其中患者患有已被确定具有磷酸化ErbB受体的肿瘤。
85.权利要求84的方法，其中ErbB受体是HER2。
86.权利要求84的方法，其中抗体阻断包含HER2的ErbB异二聚体的配基活化。
87.权利要求84方法，其中抗体是单克隆抗体2C4。
88.权利要求87的方法，其中抗体是rhuMAb 2C4。
全文摘要
通过在肿瘤细胞样品中检测HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白质复合物或者HER2磷酸化的存在来鉴定对用抗HER2抗体处理响应的肿瘤。用抗HER2抗体，例如rhuMAb 2C4治疗患有包含HER/2/HER1和/或HER2/HER3异二聚体和/或HER2磷酸化的肿瘤的患者。
文档编号G01N33/48GK1835768SQ03821625
公开日2006年9月20日 申请日期2003年7月11日 优先权日2002年7月15日
发明者汉斯·科尔, 伯吉特·博森梅尔, 汉斯-乔基姆·米勒, 马克·X·斯利科夫斯基, 斯蒂芬·M·凯尔西 申请人:健泰科生物技术公司, 霍夫曼-拉罗奇有限公司