水稻分蘖控制基因moc1及其应用的制作方法

专利名称：水稻分蘖控制基因moc1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种图位克隆技术克隆的MOC1(MoNo CULML)基因，以及利用转基因功能互补实验鉴定该基因；还涉及含有该基因和其具有类似功能的同源序列及其它物种的同源基因的的载体和涉及利用该基因或其功能类似物调控植株的分蘖或侧枝发生能力从而调节植株的群体结构提高农作物的产量、品质和养分光能利用效率。
稻秧生长至4个叶片时进入分蘖期。由于水稻的大部分营养器官如叶片、分蘖和根系都是在这个时期形成的，因此分蘖期是水稻生长发育过程中的重要时期。穗数是水稻产量的重要决定因素，而单株分蘖数又是决定穗数的重要因素，过低或过高的分蘖数都会影响产量(3)。因此，分蘖力是重要的农艺性状，是影响水稻产量重要因素。
过去对分蘖的研究主要集中在形态观察和栽培生理方面。水稻栽培生理学的研究对分蘖数量与环境条件的关系有较好的阐明，包括温度、光照、水分、耕作和矿质营养等因素对分蘖生长发育的调节，尤其是氮素营养水平和温度对分蘖的影响(4)。而从遗传学的角度开展的研究较晚，一般认为分蘖受多基因联合调节。基因间的加性作用对分蘖的贡献随植株生长而加强，起主导性作用，而基因间非加性作用与环境因素的影响占次要地位(5)。其他基因对分蘖能力也有影响如矮化基因，具有矮化基因表型的植株有很强的分蘖能力。对于分蘖调控的分子机理的研究较少，仅有Takamura和Kinoshita报道的经γ射线诱变的产生几种少分蘖突变体rcn1，2，3，4，5(rcn，reduced culm number)。这些突变体在高温下可恢复正常表型(6)。moc1(mono culm 1)突变体，是单基因隐性突变，符合孟德尔方式遗传规律。通过栽培手段调控水稻的分蘖数从而调节水稻的品质和产量在生产上已经得到足够的重视(7 8 9)。如能通过生物技术实现对水稻分蘖数的调控将是更经济有效的途径；迄今为止，有关控制植物侧枝发生的基因的研究仅见一篇报道(13)。本发明通过图位克隆技术得到控制水稻分蘖性状的基因MOC1，并通过转基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。
本发明的另一个目的是提供一种用MOC1进行高效的植物遗传转化的方法，具体地说，本发明提供了具有与Seq ID No.1和图7所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图5所示的PC8247、PC8247S，该载体可以表达由上述核酸序列编码的多肽或其同源类似物。本发明还提供了一种含有以上所述表达载体的转化子。转化子包括大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。
本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响单子叶植物分蘖或双子叶植物侧枝发生能力的方法。
实现本发明的具体技术步骤如下一水稻单分蘖突变体MOC1的分离和遗传分析通过大量筛选自然突变体，本发明得到一个水稻单分蘖突变体MOC1，通过与野生水稻正反交实验，我们得到一个符合单基因控制的遗传规律的隐性突变体，如

图1所示。
二、图位克隆控制水稻分蘖的MOC1基因MOC1基因的初步定位为了分离MOC1基因，本发明采用图位克隆的方法，首先建立一个大的多态性高的定位群体，由明恢63(indica，MOCL/MOC1)X moc1(japonica，moc1/moc1)F2中的隐性个体组成。并利用SSLP，CAPS和RFLP等分子标记对MOC1位点进行初步定位见图2.定位结果表明，MOC1初步定位在第6染色体长臂介于S1437和R1559两个标记之间。
MOC1基因的物理定位通过建立MOC1位点区域的YAC和BAC克隆重叠群以及分离相应的YAC和BAC末端进行精细定位将MOC1定位于BAC克隆4 cA11上见图3。
MOC1基因的精细定位通过对BAC克隆4cA11的亚克隆及序列分析，发展新的CAPS标记将MOC1精确定位于20kb范围之内(图4)，通过分析此区段的开放阅读框(ORF)推测候选基因。
MOC1基因的鉴定和功能分析通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻(见图6)，证明了本发明正确克隆了MOC1基因(图7)，氨基酸序列分析表明MOC1蛋白属于GRAS转录因子家族(图8)。
三、过量MOC1基因在水稻中的表达通过转基因技术过量表达MOC1基因，获得多分蘖的转基因水稻，其分蘖数是野生型水稻的3-5倍，证明MOC1基因能够促进水稻分蘖数的增加(图9)。
我国目前存在耕地面积大幅度减少、人口大幅度提高的矛盾，这迫切需要对单位面积耕地内农作物的产量和质量进行大幅度提高，其中合理的植物株型和植物群体结构是农作物产量和质量提高的重要基础，基因工程技术的发展使得应用MOC1基因调整植物株型以及形成合理的植物群体结构成为可能。
图1.水稻单分蘖突变体moc1的表型。
图2.MOC1在水稻第6染色体上的初步定位3.MOC1基因的物理定位图4.MOC1基因的精细定位图5.pC8247S和pC8247载体图谱图6.功能互补实验T1代转基因水稻的表型.左野生型H89025；中pC8247S质粒转化T1代；右pC8247质粒转化T1代.
图7.MOC1基因的DNA序列图8.MOC1基因编码的氨基酸序列图9.过量表达MOC1转基因水稻的分蘖数
3、分析和定位群体纯合的moc1突变体和原始野生型品种H89025进行正交和反交，F1代自交，在F2代的分蘖高峰期，统计野生型和单蘖表型个体的数目，并用统计学方法计算分离比例。F2定位群体是由突变体moc1(粳稻)和籼稻品种明恢63杂交获得的，总共鉴定出2010个单蘖表型的F2个体，在分蘖高峰期每株取了2克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
4、通过SSLP，RFLP，和CAPS标记定位MOC1基因采用改进的CTAB方法(10)从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约100mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取总DNA，获得的DNA沉淀溶解于100μl超纯水中。每一个SSLP和CAPS反应用1μl DNA样品，而每个RFLP分析用30μl DNA样品。
在MOC1基因的初步定位阶段，对由280个F2个体组成的小群体进行SSLP和RFLP分析。根据前人的报道，合成了90对SSLP引物(11)，并按照报道的条件进行PCR扩增，然后经4％琼脂糖凝胶电泳分离和EB染色，检测PCR产物的多态性。进行RFLP(和本文其余部分的Southern)分析时，分别用不同的限制性内切酶完全消化基因组DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，转移到Hybond N+尼龙膜(Amersham)上。用Prime-a-Gene Labeling System(Cat.No.U1100，Promega)和α-32P-dCTP标记探针。杂交后的尼龙膜用磷屏分子成像仪(PhosphorImager，Molecular Dynamics)检测多态性。所用的RFLP探针，一部分来自于Nipponbare-Kasalath高密度分子连锁图，另一部分则是物理定位MOC1基因时分离到的YAC和BAC克隆的末端DNA片段。
在精细定位MOC1基因时，对由2010个F2个体组成的大群体进行CAPS分析(12)。根据BAC克隆4cA11的序列，我们设计了4对PCR引物(引物15’GACCACTTGATCTCTCATCGAC3’，5’GAGATCGAACAAGATGGGGAC3’；引物25’GCCACTTGATCTCCTAAGTG 3’，5’GATGAGACGTCTGATCACAG 3’；引物35’GTTTGACACTCCCACTGATGG 3’，5’GGATCATATCCACCATGCATG 3’；引物4，5’GTAACGGGAGGTAGCTCTTGAG 3’，5’AAAGAATCAAGCAGCAGGTGG 3’)分别以两个亲本MOC1和明恢63的基因组DNA为模板进行PCR扩增。两个亲本的PCR产物分别用100多种不同的限制酶消化，经2％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测酶切产物的多态性。一旦发现了新的CAPS标记，就对2010个F2个体进行连锁分析，筛选出在该CAPS标记和MOC1基因之间发生了交换的个体。5、MOC1基因的物理定位在已发表的水稻品种Nipponbare的YAC物理图谱中(http//rgp.dna.affrc.go.jp/Publicdata.html)，有11个YAC克隆位于MOC1区域内。我们采用iPCR(inverse Polymerase ChainReactions)的方法分离了一些YAC末端如Y2242R，Y2242L，Y4149R和Y4149L，其中的Y2242R被成功地用作RFLP探针。然后，分别用MOC1的两侧的RFLP探针(R1559和Y2242R)筛选水稻品种Nipponbare的BAC文库(由Clemson University Genomics Institute，CUGI提供)。根据CUGI提供的BAC克隆的指纹图谱，将这些阳性克隆排列成一个BAC重叠群。根据CUGI STC测序计划产生的BAC末端序列(http//www.genome.clemson.edu/projects/rice/rice_bac_end/)设计引物，采用PCR方法分离了一些BAC末端，其中两个BAC末端即18dD02R和45cD09F被成功地用作RFLP探针。包含MOC1基因的BAC克隆4cA11用超声波打断成1.5-3.0kb的片段，末端补平后克隆到质粒载体pUC19中，从而建立了用于BAC测序的4cA11的随机文库，并测序。6、基因的预测和比较分析侯选区域的基因组序列用GENSCAN软件(http/genes.mit.edu/GENSCAN.html)预测可能的编码区(ORF)，然后将预测的ORFs在GenBank中的蛋白质数据库中进行BLASTX分析。用DNAStar软件(Lasergene)MegAlign程序中的Clustal方法进行蛋白质序列比较和进化树分析。根据BAC克隆4cA11的序列设计引物，采用PCR方法分别从突变体moc1和野生型H89025的基因组DNA中扩增出MOC1基因片段。将来自三个独立反应的PCR产物分别测序，都含有MOC1突变体中的1.9kb的逆转座子。
实施例2植物转化P4123和P4124是用于测定BAC克隆4cA11序列的随机文库中的两个质粒克隆，通过共有的SacI位点将它们连接成一个3.2kb片段，其中包括MOC1完整的ORF区，1.5kb上游序列和0.3kb下游序列。同时用SacI酶切P4123，产生一个2.4kb片段，只含有MOC1部分的ORF，在C-末端缺失掉了188个氨基酸。3.2kb和2.4kb片段分别克隆到双元载体pCAMBIA1300中，获得了用于转化的质粒pC8247和pC8247S(图5)。这两个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系LBA4404中转化水稻。将moc1突变体的成熟种子脱壳灭菌，接种到诱导愈伤的培养基中。培养3周后，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤，用作转化的受体。用含有双元质粒载体的LBA4404菌株侵染水稻愈伤，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，几天后移栽到水田(图6)。
Moc1 DNA sequence.ST25SEQUENCE LISTING<110>中科院遗传与发育生物学研究所<120>水稻分蘖控制基因moc1及其应用<130>patent<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1326<212>DNA<213>Oryza sativa<220><221>CDS<222>(1)..(1326)<223><400>1atg ctc cgg tca ctc cac tcc tcg tcg tct tct gac acg gat aac aac 48Met Leu Arg Ser Leu His Ser Ser Ser Ser Ser Asp Thr Asp Asn Asn1 5 10 15age ggt ggc tgc aag aac aat ggc ggc ggc ggt ggc gag gcc gcc gcc 96Ser Gly Gly Cys Lys Asn Asn Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Ala Ala20 25 30gcc gtt gag ggt ggc ggt gat cag cgt gcc gtt gcg gcg gcg gcg ccg 144Ala Val Glu Gly Gly Gly Asp Gln Arg Ala Val Ala Ala Ala Ala Pro35 40 45tcg acg cgg gac ttg ctg ctg gcg tgc gcg gac ctg ctg cag agg ggg 192Ser Thr Arg Asp Leu Leu Leu Ala Cys Ala Asp Leu Leu Gln Arg Gly50 55 60gac ctg ccg gcg gcg agg cga gcg gcg gag atc gtc ttg gcg gcg gcg 240Asp Leu Pro Ala Ala Arg Arg Ala Ala Glu Ile Val Leu Ala Ala Ala65 70 75 80gcg tcg ccg cgg ggc gac gcg gcg gac cgc ctg gcg tac cacttc gcc 288Ala Ser Pro Arg Gly Asp Ala Ala Asp Arg Leu Ala Tyr His Phe Ala85 90 95cgc gcg ctg gcg ctc cgg gtg gac gcc aag gcc ggc cat ggc cac gtc 336Arg Ala Leu Ala Leu Arg Val Asp Ala Lys Ala Gly His Gly His Val100 105 110gtc gtc ggc ggc ggc gcg gcg cgg ccg gcg tcg tcc ggg gcg tac ctg 384Val Val Gly Gly Gly Ala Ala Arg Pro Ala Ser Ser Gly Ala Tyr Leu115 120 125gcg ttc aac cag atc gcg ccg ttc ctg cgt ttc gcg cac ctc acg gcg 432Ala Phe Asn Gln Ile Ala Pro Phe Leu Arg Phe Ala His Leu Thr Ala130 135 140aac cag gcc atc ctc gag gcc gtc gac ggc gcg cgc cgc gtc cac atc 480Asn Gln Ala Ile Leu Glu Ala Val Asp Gly Ala Arg Arg Val His Ile145 150 155 160ctc gac ctc gac gcc gtc cac ggc gtg cag tgg ccg ccg ctg ctg cag 528Leu Asp Leu Asp Ala Val His Gly Val Gln Trp Pro Pro Leu Leu Gln165 170 175gcc atc gcc gag cgc gcg gac ccg gcg ctc ggc ccg ccc gag gtc cgc 576Ala Ile Ala Glu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Gly Pro Pro Glu Val Arg180 185 190gtc acc ggc gcc ggc gcc gac cgc gac acc ctc ctc cgc acc ggc aac 624Val Thr Gly Ala Gly Ala Asp Arg Asp Thr Leu Leu Arg Thr Gly Asn195 200 205
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权利要求
1.一种水稻分蘖或分枝控制基因MOC1编码的蛋白质，或其他物种中的功能类似蛋白，其氨基酸序列与Seq ID No.2所示的氨基酸序列具有至少30％的同源性。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，具有Seq ID No.2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所说的氨基酸序列还包括在Seq ID No.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
4.一种编码权利要求1、2或3任意一项所述的蛋白质或其功能类似物的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，它具有Seq.ID.No.1所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的基因，其中所述的核苷酸序列还包括在Seq.ID.No.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
7.一种含有权利要求4、5或6所述的基因的质粒。
8.一种含有权利要求4、5或6所述的基因的部分序列的质粒。
9.一种按照权利要求8所述的质粒是pC8247或pC8247S。
10.一种含有权利要求7、8或9所述质粒的植物表达载体。
11.一种含有权利要求10所述的基因序列的转化子。
12.据权利要求11所述的转化子，该细胞为大肠杆菌。
13.根据权利要求11所述的转化子，该细胞为农杆菌。
14.根据权利要求11所述的转化子，该细胞为植物。
15.一种培育植物分蘖或分枝的方法，包括用权利要求10，11，12，13所述的表达载体或宿主细胞转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。
全文摘要
本发明从水稻单分蘖突变体Mono culm 1(moc1)中克隆并鉴定了控制水稻分蘖的基因并将其命名为MOC1。转基因功能互补实验证明MOC1是控制水稻分蘖的基因。氨基酸序列比较分析表明该基因属于GRAS转录因子家族，尤其与控制侧枝发生的家族成员同源性最高。它高度保守的两个亮氨酸七聚体重复序列、VHIID结构域和类SH2结构域。在水稻中过量表达MOC1得到多分蘖的转基因水稻，表明可以利用基因工程技术调节水稻的分蘖性状。该基因在阐述基因转录水平调控植物发育过程方面；在利用生物工程技术有目的调控植物株型性状，调整植物群体结构以达到高产、优质高效利用养分与光能方面具有非常重要的应用价值。
文档编号C07K14/415GK1477112SQ0212919
公开日2004年2月25日 申请日期2002年8月20日 优先权日2002年8月20日
发明者李家洋, 钱前, 李学勇, 曾大力, 付志明, 王永红, 熊国胜, 王晓群, 刘新仿 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所