基于SenecaValley病毒的组合物以及疾病的治疗方法

专利名称：基于 Seneca Valley 病毒的组合物以及疾病的治疗方法
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本申请要求2003年9月26日提交的U.S.序列号60/506,182的优先权，其在此处全部引入作为参考。
背景技术：
病毒治疗给癌症治疗带来巨大的希望。针对特异性结合以及杀伤癌细胞的肿瘤消解病毒，无论是天然的或者工程化的比诸如化疗以及辐射的选择性治疗更有效并且毒性较低。此外，肿瘤消解病毒治疗是已知可以扩大药理学目标位点的治疗的唯一治疗手段。
癌症治疗的一个关键方面是与正常细胞相比实现癌细胞的高效率杀伤。该目标由于多种原因很难实现，包括所含有的宽范围的细胞类型，由于转移引起的癌细胞的全身性扩散以及正常以及癌细胞之间较狭窄的生物差异。虽然已经取得了进展，但是仍然需要改进目前的癌症治疗。
过去，外科医生试图通过手术除去肿瘤，而且不显著伤害患者。即使完全除去原发肿瘤也不能确保存活，因为在身体内未知位点的早期转移常常不易被发现。还有一些研究暗示外科手术可能由于除去产生血管生成抑制剂的肿瘤细胞加强远距离转移的生长。最终，在很多情况下，肿瘤在外科手术除去后在初始位点又重新生长。放射的目的在于以其它损伤为代价选择性破坏最迅速增殖的细胞。然而，肿瘤细胞可能或者通过耐受或者通过在治疗期间处于不分裂状态逃避放射治疗。此外，放射对于许多主动分裂的正常细胞(胃肠细胞，毛囊等)并不总是选择性的，切所述的正常细胞由于治疗被杀伤。
与放射一样，化疗并不是完全选择性的因此破坏许多正常细胞，并且由于耐药性和/或细胞的分裂状态而不杀伤所有的肿瘤细胞。因此，化疗以及放疗利用正常和癌细胞之间存在的较小的微分灵敏度，从而产生较窄的治疗指数。较小的治疗指数很明显是任何癌症治疗方式不合需要的特性。因此，人们期望存在克服这些局限性的新的癌症治疗方法。
肿瘤消解病毒治疗是一种这样的新方法。最初，在试图治疗癌症中使用携带细胞毒转基因的复制缺陷型病毒。然而，发现所述病毒在转导肿瘤中效率较低并且不足以选择性针对癌症。为了克服这种局限性，或者修饰该病毒用于在肿瘤细胞中进行选择性复制或者去发现具有天然肿瘤选择性特性的病毒。通过对肿瘤块局部注射病毒或者通过全身递送病毒，这些肿瘤消解病毒因此具有选择性复制，扩散和杀伤肿瘤细胞的特性(图1)。
尽管这些新近定义种类的抗癌治疗很早就有治疗希望，但是仍然有几个局限性限制其作为癌症治疗的应用。
因此，目前需要可用于癌症治疗的新的肿瘤消解病毒。
发明概述本发明发现了新的微小RNA病毒(此后称为Seneca Valley病毒(″SVV″))，其天然特性包括能够选择性杀伤一些类型的肿瘤。如以下实施例中所述，SVV选择性杀伤具有亲神经特性的肿瘤系，在大多数情况下与正常细胞相比杀伤50％肿瘤细胞的所需病毒量(即，EC50值)具有大于10,000倍的差异。这个结果也适于体内，其中小鼠中的肿瘤外植体被选择性消除。此外，体内结果显示SVV对于正常细胞没有毒性，因为全身施用高达1×1014vp/kg(载体或者病毒粒子/kg体重)不引起免疫缺陷或者免疫活性小鼠的死亡并且没有可见的临床症状。
SVV在低达1×108vp/kg的剂量时仍有效力；因此，实现＞100,000的高治疗指数。SVV的效力非常强，因为小鼠体内100％的较大的预形成的肿瘤可被完全除去(参见实施例11)。该效力可以通过单一系统性注射SVV介导而无需任何附加治疗。此外，SVV注射的小鼠在注射后至少200天既不显示临床症状又不显示肿瘤的复发。SVV还可以被纯化至高滴度并且可在允许细胞系中以每细胞＞200,000病毒粒子来产生。基于SVV的病毒治疗因此显示出作为对于选型癌症治疗的安全，有效以及新类型治疗的重要前途。
此外，SVV具有较小并且容易操作的基因组，简单和快速的生命周期，以及被充分了解的衣壳，并且因此易于修饰。这些特性，至少部分可以允许利用产生修饰的SVVs的方法，所述修饰的SVVs具有新的细胞或者组织特异性趋性，因此基于SVV的治疗可由初始的SVV分离物导向耐受感染的新的肿瘤类型。
因此，本发明提供了包括与SEQ ID NOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者这些至少50个核苷酸长度的序列的任何一个相邻的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的核酸序列，或者与至少10，15或者20个核苷酸长度的这些序列的任何一个的相邻部分具有95％同一性的分离的核酸。本发明该分离的核酸可以是RNA或者DNA。
在其它的方面，本发明提供了在高，中等严格或者低严格条件下与SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者至少50个核苷酸长度的这些序列的任何一个的相邻部分杂交的分离的核酸。
在另一方面，本发明提供了包括与SEQ ID NOs 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者至少50个核苷酸长度的这些序列的任何一个的相邻部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的核酸序列的载体。
本发明还提供了由包括与SEQ ID NOs 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者至少50个核苷酸长度的这些序列的任何一个的相邻部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的核酸编码的分离的多肽。
在一个方面，本发明提供了包括与SEQ ID NOs 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或者至少10个氨基酸长度的这些序列的任何一个的相邻部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的氨基酸序列的分离的多肽。
在另一方面，本发明提供了特异性结合包括与SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或者至少10个氨基酸长的这些序列的任何一个的相邻部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的氨基酸序列的多肽的分离的抗体。该分离的抗体的产生可以使其结合于SEQ ID NO2的任一蛋白质表位或者抗原。此外，该抗体可以是多克隆抗体，单克隆抗体或者嵌合抗体。
在一个方面，本发明提供了分离的SVV或者其具有包括与SEQ IDNO1有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的基因组序列的衍生物或者相关物。
在另一方面，本发明提供了具有美国典型培养物保藏中心(ATCC)专利保藏号PTA一5343的所有鉴定特性以及核酸序列的分离的病毒。本发明的一些病毒涉及PTA-5343分离物，PTA-5343分离物的变体，同系物，相关物，衍生物以及突变体，以及根据被确定为决定其肿瘤消解特性的SVV的序列(野生型以及突变体)修饰的其它病毒的变体，同系物，衍生物以及突变体。
本发明还提供了包括下列特性的分离的SVV-7.5千碱基(kb)的单链RNA基因组(阳性(+)有义链)；-27毫微米(nm)的直径；包括具有约31kDa，36kDa以及27kDa的分子量的至少3种蛋白的衣壳；在氯化铯(CsCl)梯度上大约1.34g/mL的浮力密度；以及肿瘤细胞中的复制能力。在该方面，31kDa衣壳蛋白(VP1)可以包含与SEQ ID NO8具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的氨基酸序列；36kDa衣壳蛋白(VP2)可以包含与SEQ ID NO4具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的氨基酸序列；以及27kDa衣壳蛋白(VP3)可以包含与SEQ ID NO6具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了包括下列特性的分离的SVV衍生物或者相关物肿瘤细胞中的复制能力，肿瘤-细胞趋性，以及正常细胞中缺少消解。在另一方面，病毒在具有神经内分泌特性的肿瘤细胞类型中具有复制能力。
在其它方面，本发明提供了包括有效量的本发明的病毒以及药用载体的药物组合物；包括本发明病毒的细胞；包含本发明的病毒抗原的病毒裂解物；以及获自本发明的病毒的分离的以及纯化的病毒抗原。
在另一方面，本发明提供了纯化本发明病毒的方法，包括用病毒感染细胞；收获细胞裂解物；将细胞裂解物进行至少一轮的梯度离心；以及从梯度分离病毒。
在另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，包括施用有效量的病毒或者其衍生物，以便治疗癌症，其中所述病毒具有包括与SEQ IDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者SEQ ID NO1的一部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的基因组序列。
在另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，包括施用有效量包括含有与SEQ ID NO3，5，7或者其相邻部分有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的编码衣壳的区域的病毒。本发明还提供了治疗癌症的方法，包括施用有效量包括含有与SEQID NO4，6，8或者其相邻部分有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的氨基酸序列的衣壳的病毒。
在一个方面，本发明提供了抑制癌症进展的方法，包括将癌细胞与病毒或者其衍生物接触，其中病毒或者其衍生物特异性结合癌细胞，其中所述病毒具有包括与SEQ ID NOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的基因组序列。
在另一方面，本发明提供了杀伤癌细胞的方法，包括将癌细胞与有效量的病毒或者其衍生物接触，其中所述病毒具有包括与SEQ IDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的基因组序列。
在这些针对癌症的方法中，病毒可以是微小RNA病毒。微小RNA病毒可以是心脏病毒，erbovirus，口蹄疫病毒，kobuvirus，肝病毒，副肠孤病毒，teschovirus，肠道病毒或者鼻病毒。心脏病毒可以选自vilyuisk人脑脊髓炎病毒，Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒，脑心肌炎病毒以及SVV。脑心肌炎病毒可以选自如下分离物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695以及NC-88-23626。SVV可以是具有ATCC保藏号PTA-5343的病毒或者包括与SEQ ID NO1或者其相邻的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的核酸序列的病毒。
本发明还提供了杀伤异常增殖细胞的方法，包括将细胞与本发明的病毒接触。在一个方面，异常增殖的细胞是肿瘤细胞。在该方法的其他方面，肿瘤细胞选自人小细胞肺癌，人成视网膜细胞瘤，人成神经细胞瘤，人成神经管细胞瘤，小鼠成神经细胞瘤，维耳姆斯瘤以及人非小细胞肺癌。
本发明还提供了治疗受试者肿瘤病症的方法，包括给受试者施用有效量的本发明病毒至哺乳动物。一个方面，肿瘤病症是神经内分泌癌症。在另一方面，受试者是哺乳动物。在另一方面，受试者是人。
本发明还提供了产生本发明病毒的方法，包括在可以使病毒复制的条件下温育感染有病毒的细胞以及从细胞或者上清液回收病毒。在该方法的一个方面，细胞是PER C6细胞。在本方法的另一方面，细胞是H446细胞。在本方法的其它方面，该细胞可以每细胞产生超过200,000个的病毒粒子。
在另一方面，本发明提供了检测本发明病毒的方法，包括从怀疑含有本发明病毒的试验材料分离RNA；标记对应于SEQ ID NO1的至少15个相邻核苷酸的RNA；用标记的RNA探测试验材料；以及检测标记的RNA与分离自试验材料的RNA的结合，其中结合显示病毒的存在。另一方面，本发明提供了包括对应于SEQ ID NO1或者其互补序列的至少15个相邻核苷酸的核苷酸序列的核酸探针。
本发明还提供了制备肿瘤消解心脏病毒的方法，该方法包括(a)将SVV基因组序列与试验病毒基因组序列相比较；(b)至少鉴定由SVV基因组序列编码的多肽以及由试验病毒基因组序列编码的多肽之间第一个氨基酸的差异；(c)对试验的病毒基因组序列进行突变使得由试验病毒基因组序列编码的多肽与由SVV基因组序列编码的多肽具有至少一个氨基酸的差异；(d)将突变的试验病毒序列转染至肿瘤细胞中；以及(e)确定肿瘤细胞是否被突变的试验病毒基因组序列消解性感染。在一个方面，在试验病毒中突变的氨基酸是结构区域中诸如编码衣壳的区域中的氨基酸。在另一方面，试验病毒中突变的氨基酸是非结构区域中的氨基酸。
在制备肿瘤消解病毒方法的一个方面，SVV基因组序列获自ATCC保藏号为PTA-5343的分离的SVV或者获自包括与SEQ IDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相邻的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的病毒。本方法的另一方面，使试验病毒基因组序列突变的步骤包括使具有试验病毒基因组序列的cDNA突变。该方法的另一方面，使突变的试验病毒基因组序列转染的步骤包括转染RNA，其中RNA由具有突变的试验病毒基因组序列的cDNA产生。
在制造肿瘤消解心脏病毒的方法的另一方面，试验病毒是微小RNA病毒。该试验的微小RNA病毒可以是teschovirus，肠道病毒，鼻病毒，心脏病毒，erbovirus，apthovirus，kobuvirus，肝病毒，副肠孤病毒或者teschovirus。在另一方面，试验病毒是心脏病毒。在另一方面，在制备肿瘤消解病毒方法中鉴定的氨基酸差异是在SVV衣壳蛋白以及试验的病毒衣壳蛋白序列之间。在制备肿瘤消解病毒的另一方面，试验病毒基因组序列选自Vilyuisk人脑脊髓炎病毒，Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒，以及脑心肌炎病毒。在另一方面，试验的病毒基因组序列选自脑心肌炎病毒。脑心肌炎病毒可以选自如下分离物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695以及NC-88-23626。在另一方面，脑心肌炎病毒或者任一其它的试验病毒可以选自具有包括与ATCC保藏号PTA-5343的SVV或SEQ IDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相邻的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的核酸序列的分离物。
在肿瘤消解心脏病毒制备方法的另一方面，试验病毒以及SVV之间的氨基酸差异是在SVV的衣壳蛋白区域，其中氨基酸差异与SVVSEQ ID NO4，6或者8对准。
本发明还提供了制备改变细胞类型趋性的突变体病毒的方法，所述方法包括(a)产生病毒突变体文库，包括大量核酸序列；(b)将病毒突变体文库转染到允许的细胞中，由此产生大量的突变体病毒；(c)分离大量的突变体病毒；(d)用分离的大量突变体病毒温育不允许的细胞；以及(e)回收在不允许的细胞中产生的突变体病毒，由此制备改变趋性的突变体病毒。在一个方面，该方法还包括如下步骤(f)在不允许的细胞中温育回收的突变体病毒；以及(g)回收在不允许的细胞中产生的突变体病毒。在另一方面，该方法还包括反复重复步骤(f)以及(g)。在另一方面，病毒突变体的文库由包括SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相邻部分的亲本序列产生。
在制备改变细胞类型趋性的突变体病毒的方法的一个方面，在多孔高通量平台中进行温育，其中该平台在每一孔中包括不同类型的不允许的细胞。在该方面，所述方法可以更进一步包含筛选平台鉴定哪些孔包含杀伤细胞的突变体病毒。在另一方面，筛选由分析每一孔中的吸光度进行。
在制备具有改变的细胞类型趋性的突变体病毒的制备方法的另一方面，不允许的细胞是肿瘤细胞。
在制备改变细胞类型趋性的突变体病毒的方法的另一方面，产生病毒突变体文库的步骤包括(i)提供与病毒的基因组序列的一部分具有同一性的序列的多核苷酸；(ii)使多核苷酸突变以便产生大量不同的突变体多核苷酸序列；以及(iii)将大量的突变的多核苷酸连接到除步骤(i)中所含的多核苷酸的病毒的基因组序列的部分病毒的基因组序列的载体中，由此产生病毒突变体的文库。在一个方面，病毒的基因组序列来自微小RNA病毒。在另一方面，病毒的基因组序列包括与SEQ IDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相邻的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的序列的病毒。在另一方面，在产生病毒突变体文库的步骤中，步骤(ii)的突变由将核苷酸随机插入多核苷酸进行。在一个方面，核苷酸的随机插入由三核苷酸-致诱变(TRIM)进行。在另一方面，插入多核苷酸的至少一部分核苷酸编码附加表位。另一方面，在产生病毒突变体文库的步骤中，步骤(ii)的突变是在多核苷酸的编码衣壳的区域进行的。
本发明还提供了制备改变细胞类型趋性的突变体心脏病毒的方法，所述方法包括(a)产生心脏病毒突变体多核苷酸序列文库，其中该产生包括提供编码心脏病毒衣壳区域的多核苷酸；对多核苷酸突变以便产生大量编码不同的突变体衣壳-多核苷酸序列；以及将大量突变的编码衣壳的多核苷酸连接到除了编码衣壳的区域的心脏病毒的基因组序列的载体中，由此产生心脏病毒的突变体多核苷酸序列的文库；(b)将突变体多核苷酸序列的文库转染进入允许的细胞，由此产生大量的突变体病毒；(c)分离大量的突变体病毒；(d)用分离的大量突变体病毒温育不允许的细胞；以及(e)回收在不允许的细胞中产生的突变体病毒，由此制备改变趋性的突变体心脏病毒。在一个方面，该方法还包括如下步骤(f)在不允许的细胞中温育回收的突变体病毒；以及(g)回收在不允许的细胞中产生的突变体病毒。在另一方面，该方法还包括反复重复步骤(f)以及(g)。在另一方面，该突变由将核苷酸随机插入编码衣壳的多核苷酸进行。在另一方面，随机插入编码衣壳的多核苷酸的核苷酸的至少一部分编码附加表位。在另一方面，核苷酸的随机插入由TRIM进行。在另一方面，大量不同突变体编码衣壳的多核苷酸序列包括大于108或者109个不同的编码衣壳的多核苷酸序列。
在一个方面，制备改变细胞类型的趋性的突变体SVV的方法包括(a)产生SVV突变体的cDNA文库；(b)由SVV突变体的cDNA文库产生SVV RNA；(c)将SVV RNA转染入允许的细胞，由此产生大量突变体SVV；(d)分离大量的突变体SVV；(e)用分离的大量突变体SVV温育不允许的肿瘤细胞；以及(f)回收消解性感染不允许的肿瘤细胞的突变体SVV，由此制备改变趋性的突变体SVV。在另一方面，该方法还包括如下步骤(f)在不允许的肿瘤细胞中温育回收的突变体SVV；以及(h)回收消解性感染不允许的肿瘤细胞的突变体SVV。另一方面，该方法还包括反复重复步骤(f)以及(h)。一个方面，在多孔高通量平台中进行温育，其中该平台在每一孔中包括不同类型的不允许的肿瘤细胞。在另一方面，所述方法更进一步包括筛选平台鉴定哪些孔包括消解性感染细胞的突变体SVV。在另一方面，筛选由分析每一孔中的吸光度进行。在一个方面，SVV突变体的cDNA文库包括大量的突变体SVV衣壳多核苷酸序列。在另一方面，大量的突变体SVV衣壳多核苷酸序列由随机插入核苷酸产生。在另一方面，随机插入的至少一部分核苷酸的序列编码附加表位。在另一方面，核苷酸的随机插入由TRIM进行。在另一方面，SVV突变体的cDNA文库由ATCC保藏号PTA-5343的SVV产生。在另一方面，SVV突变体的cDNA文库由包括与SEQ IDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19或者21具有至少99％，95％，90％，85％，80％，75％，70％，或者65％序列同一性的序列的SVV产生。在另一方面，不允许的肿瘤细胞是肿瘤细胞系或者由患者分离的肿瘤细胞类型。
本发明还提供了制备体内肿瘤细胞类型趋性的突变体病毒的方法，该方法包括(a)产生包括大量核酸序列的病毒突变体的文库；(b)将病毒突变体的文库转染允许的细胞，由此产生大量的突变体病毒；(c)分离大量的突变体病毒；(d)将分离的大量突变体病毒施用给患有肿瘤的哺乳动物，其中哺乳动物不是突变体病毒的未突变形式的天然寄主；以及(e)回收在肿瘤中复制的病毒，由此制备具有体内肿瘤细胞类型趋性的突变体病毒。在一个方面，产生病毒突变体文库的步骤包括提供编码病毒的衣壳区域的多核苷酸；对多核苷酸突变以便产生大量不同的编码突变体衣壳的多核苷酸序列；以及将大量突变的编码衣壳的多核苷酸连接至病毒除了编码衣壳区域的基因组序列的载体，由此产生病毒突变体的文库。在另一方面，步骤(e)中回收的病毒消解性感染肿瘤的细胞。在制备体内肿瘤细胞类型趋性的突变体病毒方法的另一方面，肿瘤是异种移植，同系基因肿瘤，同位肿瘤或者转基因肿瘤。在另一方面，哺乳动物是小鼠。
对本发明的所有方法，病毒可以是微小RNA病毒。微小RNA病毒可以是心脏病毒，erbovirus，口疮病毒，kobuvirus，肝病毒，副肠孤病毒，teschovirus，entrovirus，或者鼻病毒。心脏病毒可以是SVV。SVV可以是ATCC保藏号PTA-5343的SVV或者包括与SEQ ID NO1，3，6，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相邻的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的SVV。更进一步，心脏病毒可以选自vilyuisk人脑脊髓炎病毒，Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒以及脑心肌炎病毒。在一个方面，脑心肌炎病毒选自如下分离物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695以及NC-88-23626。在另一方面，本发明包含任一选自与ATCC保藏号PTA-5343的SVV或者SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相邻的部分具有至少99％，95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％序列同一性的分离物或者换句话说由序列同源性与SVV相关的任一病毒。
本发明还提供了由在这里公开的突变体病毒的任一制备方法制备的肿瘤消解病毒。在一个方面，本发明提供了用肿瘤消解病毒治疗患者的方法，该方法包括(a)灭活通过在这里公开的突变体病毒的任一制备方法制备的肿瘤消解，使得肿瘤消解病毒不具感染性并且肿瘤消解病毒的趋性是不受影响；以及(b)将辐射的肿瘤消解病毒施用给肿瘤患者。在另一方面，患者的治疗方法更进一步包括将毒素与灭活的肿瘤消解病毒连接。
在另一方面，本发明提供了用SVV治疗肿瘤患者的方法，该方法包括(a)灭活SVV，使得病毒不具感染性并且趋性不受影响；以及(b)给肿瘤患者施用灭活的SVV。在另一方面，用SVV治疗肿瘤患者的方法更进一步包括将毒素与灭活的SVV连接。
在另一方面，本发明提供了包括灭活的SVV的SVV组合物。在另一方面，本发明提供了包括整合入衣壳区域的附加表位的SVV。
本发明还提供了用SVV治疗肿瘤患者的方法，该方法包括(a)产生包括在衣壳中编码的附加表位的突变体SVV；(b)将毒素与附加表位连接；以及(c)给肿瘤患者施用具有连接的毒素的突变体SVV。在一个方面，该产生包括将编码附加表位的寡核苷酸插入SVV的编码衣壳的区域的多核苷酸致。在一个方面，突变体SVV不改变细胞的类型趋性。在另一方面，该方法更进一步包括灭活突变体SVV，使得突变体SVV不具感染性。
本发明还提供了检测样品中肿瘤细胞的方法，包括(a)由患者分离肿瘤样品；(b)用已附加表位的SVV温育肿瘤样品；以及(c)通过检测附加表位筛选结合SVV的肿瘤样品。
在一个方面，本发明提供了体内检测肿瘤细胞的方法，包括(a)给患者施用灭活的已附加表位的SVV，其中标记与附加表位结合；以及(b)检测患者体内的标记。在检测本发明的肿瘤细胞的方法中，SVV可以是由在这里公开的方法产生的突变体SVV。
更进一步，本发明的治疗肿瘤病症的方法，检测肿瘤病症的方法以及产生SVV的方法适用于野生型SVV，突变体(包括修饰的或者变体)SVV，SVV的相关物及其他本发明的肿瘤特异性病毒。
本发明的病毒，及其组合物可被用于生产用于治疗在这里提到的疾病的药物。更进一步，本发明的病毒及其组合物可用于治疗在这里提到的疾病。因此，在本发明的一个方面，本发明提供了SVV(或者其突变体，衍生物，相关物以及组合物)在治疗癌症或者生产用于治疗癌症的药物中的应用。
保藏信息下列材料已经根据布达佩斯条约对于国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的规定保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，美国。在专利授权后对于保藏物的可利用性的所有限制均可不可逆地除去。材料SenecaValley病毒(SVV)。ATCC专利保藏号PTA-5343。保藏日期2003年7月25日。


图1显示了利用肿瘤消解病毒进行病毒治疗的示意图。通过对肿瘤块局部注射病毒或者通过全身递送病毒，肿瘤消解病毒因此具有选择性复制，扩散和杀伤肿瘤细胞的特性。
图2显示了用乙酸双氧铀染色以及由透射电子显微术试验的纯化的SVV。球状病毒粒子直径为约27nm。
图3是具有较大晶状包涵体以及较大泡囊状体的SVV-感染的PER.C6细胞的电子显微照片。
图4A显示了SVV RNA的分析。SVV基因组RNA利用硫氰酸胍以及利用Trizol(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)的苯酚提取法提取。RNA通过1.25％变性琼脂糖凝胶溶解。由溴化乙锭(EtBr)染色以及照相目测条带。在泳道2，观察到SVV基因组RNA的一条主要条带，显示全长SVV基因组的大小为约7.5千碱基[确定]。
图4B是显示微小RNA病毒，包括SVV的基因组结构以及由多蛋白加工产生的蛋白产物的示意图。
图5A-5E显示了SVV的核苷酸序列(SEQ ID NO1)以及编码的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。终止子由5671-3位的“*”表示。通常，在包括确定的核苷酸精确位置的序列公开中，这些位置由“n”表示。因此，具有“n”的密码子中，相关氨基酸表示为“x”。
图6A-6D显示了SVV的全长基因组的大多数核苷酸序列(SEQ IDNO1)。核苷酸序列源自于ATCC专利保藏号PTA-5343的SVV分离物。保藏日期2003年7月25日。
图7A-7B显示了由SEQ ID NO1编码的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图8显示了SVV的部分1B或者VP2编码区域的核苷酸序列(SEQID NO3)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸4-429相一致。
图9显示由SEQ ID NO3编码的部分SVV VP2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。SEQ ID NO4中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸2-143相同。
图10显示了SVV的1C或者VP3编码区域的核苷酸序列(SEQ IDNO5)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸430-1146相一致。
图11显示由SEQ ID NO5编码的SVV VP3蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。SEQ ID NO6中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸144-382相一致。
图12显示了SVV的1D或者VP1编码区域的核苷酸序列(SEQ IDNO7)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸1147-1923相一致。
图13显示由SEQ ID NO7编码的SVV VP1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。SEQ ID NO8中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸383-641相一致。
图14显示了SVV的2A编码区域的核苷酸序列(SEQ ID NO9)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸1924-1965相一致。
图15显示由SEQ ID NO9编码的SVV 2A蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO10)。SEQ ID NO10中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸642-655相一致。
图16显示了SVV的2B编码区域的核苷酸序列(SEQ ID NO11)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸1966-2349相一致。
图17显示由SEQ ID NO11编码的SVV 2B蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。SEQ ID NO12中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸656-783相一致。
图18显示了SVV的2C编码区域的核苷酸序列(SEQ ID NO13)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸2350-3315相一致。
图19显示由SEQ ID NO13编码的SVV 2C蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO14)。SEQ ID NO14中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸784-1105相一致。
图20显示了SVV的3A编码区域的核苷酸序列(SEQ ID NO15)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸3316-3585相一致。
图21显示由SEQ ID NO15编码的SVV 3A蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO16)。SEQ ID NO16中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸1106-1195相一致。
图22显示了SVV的3B编码区域的核苷酸序列(SEQ ID NO17)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸3586-3651相一致。
图23显示由SEQ ID NO17编码的SVV 3B蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO18)。SEQ ID NO18中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸1196-1217相一致。
图24显示了SVV的3C编码区域的核苷酸序列(SEQ ID NO19)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸3652-4284相一致。
图25显示由SEQ ID NO19编码的SVV 3C蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO20)。SEQ ID NO20中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸1218-1428相一致。
图26显示了SVV的3D编码区域的核苷酸序列(SEQ ID NO21)。该序列与SEQ ID NO1的核苷酸4285-5673相一致。
图27显示由SEQ ID NO21编码的SVV 3D蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO22)。SEQ ID NO22中列举的序列与SEQ ID NO2的氨基酸1429-1890相一致。
图28A-28H显示SVV SEQ ID NO2以及不同成员的心脏病毒，诸如脑心肌炎病毒(EMCV；种脑心肌炎病毒)，Theiler氏鼠脑心肌炎病毒(TMEV；种Theilovirus)，大鼠TMEV-类介质(TLV；种Theilovirus)，以及Vilyuisk人脑脊髓炎病毒(VHEV；种Theilovirus)之间的氨基酸序列比对。不同心脏病毒的特异性序列存在于SEQ IDNOs23(EMCV-R)，24(EMCV-PV21)，25(EMCV-B)，26(EMCV-Da)，27(EMCV-Db)，28(EMCV-PV2)，29(EMCV-Mengo)，30(TMEV/DA)，31(TMEV/GDVII)，32(TMEV/BeAn8386)，33(TLV-NGS910)以及34(VHEV/Siberia-55)。
图28中的编号位置不对应于序列表的编号。符号“/”显示多蛋白被切割成其最终的功能性产物的切割位点。例如，1和157位之间的比对是在1A(VP4)区域中。159和428位之间的对比是在1B(VP2)区域中；430和668位之间的比对在1C(VP3)区域中；670和967之间的比对在1D(VP1)区域中；969和1111位之间的比对在2A区域中；1112和1276位之间的比对在2B区域中；1278和1609之间的比对在2C区域中；1611和1700位之间的比对在3A区域中；1702和1723之间的比对在3B区域中；1725和1946之间的比对在3C区域中；1948和2410之间的比对在3D区域中。比对也显示可以由标准序列分析程序确定的病毒序列之间潜在保守或者相似性的区域。利用BioEdit 5.0.9和Clustal W1.81产生比对。
图29列举了SVV的最终的多肽产物，一些保守基序是粗体以及加下划线2A/2B“裂解”(NPGP)；2C ATP-结合(GxxGxGKS/T以及hyhyhyxxD)；3B(VPg)/RNA连接残基(Y)；3C(pro)活性位点残基(H，C，H)；3D(pol)基序(KDEL/IR，PSG，YGDD，FLKR)。
图30列举了用于序列分析确定SVV和这些微小RNA病毒之间系统发生关系的微小RNA病毒种(参见实施例4)。
图31显示了SVV(SEQ ID NO4)及其他微小RNA病毒鉴于VP2序列分析的系统发生关系。该图显示了模拟的邻近连接树(neighbor-joining tree)(参见实施例4)。
图32显示了SVV(SEQ ID NO6)及其他微小RNA病毒之间鉴于VP3的模拟的邻近相连树(参见实施例4)。
图33显示了SVV(SEQ ID NO8)及其他微小RNA病毒之间鉴于VP1的模拟的邻近相连树(参见实施例4)。
图34显示了SVV(即SEQ ID NO2的部分P1-氨基酸2-641)及其他微小RNA病毒之间鉴于P1(即1A，1B，1C以及1D)的模拟的邻近-相连树(参见实施例4)。
图35显示了SVV(SEQ ID NO14)及其他微小RNA病毒之间鉴于2C的模拟的邻近相连树(参见实施例4)。
图36显示了SVV(SEQ ID NO20)及其他微小RNA病毒之间鉴于3C(pro)的模拟的邻近相连树(参见实施例4)。
图37显示了SVV(SEQ ID NO22)及其他微小RNA病毒之间鉴于3D(pol)的模拟的邻近相连树(参见实施例4)。
图38显示了SVV(SEQ ID NO14)及其他微小RNA病毒之间VP2的实际的氨基酸百分比同一性(参见实施例4)。
图39显示了SVV(SEQ ID NO6)及其他微小RNA病毒之间VP3的实际的氨基酸百分比同一性(参见实施例4)。
图40显示了SVV(SEQ ID NO8)及其他微小RNA病毒之间VP1的实际氨基酸百分比同一性(参见实施例4)。
图41显示了SVV(SEQ ID NO2的部分衣壳或者P1-氨基酸2-641)及其他微小RNA病毒之间P1的实际氨基酸百分比同一性(参见实施例4)。
图42显示了SVV(SEQ ID NO14)及其他微小RNA病毒之间2C的实际氨基酸百分比同一性(参见实施例4)。
图43显示了SVV(SEQ ID NO20)及其他微小RNA病毒之3C(pro)的实际氨基酸百分比同一性(参见实施例4)。
图44显示了SVV(SEQ ID NO22)及其他微小RNA病毒之间3D(pol)的实际氨基酸百分比同一性(参见实施例4)。
图45显示了由SDS-PAGE分析的SVV的VP2(～36kDa)，VP1(～31kDa)以及VP3(～27kDa)蛋白。纯化的SVV进行SDS-PAGE并通过银染目测蛋白。泳道“MWt”是分子量标记；泳道“SVV”包含SVV的结构的蛋白。还给出3个分子量标记的大小以及病毒蛋白的名称。
图46A-46B显示了系统施用后血液以及肿瘤中SVV的量(实施例7)。具有H446肿瘤的裸鼠用SVV以1×1012vp/kg的剂量通过尾部静脉注射进行处理。在注射后第0，1，3，6，24，48，72小时以及第7天对小鼠取血，聚集后立即从血液分离血浆，稀释的在感染培养基中，并用于感染PER.C6细胞。注射后第6，24，48，72小时以及第7天收集肿瘤。将肿瘤切割成小切片并悬浮在1mL介质中并制备CVL。
图46C-46D显示与体内SVV清除有关的数据。该图显示SVV显示出与类似剂量i.v.腺病毒(实施例7)相比在血液中显著长的保留时间，因此SVV比腺病毒在体内具有较慢的清除率。静脉内(i.v.)单剂量施用后，SVV保存于血液中高达6小时(图46C；图46C是图46A的重复用于对比图46D的目的)，而在约1小时中腺病毒被从血液中清除或者耗尽(图46D)。
图47显示了H446异种移植切片的免疫组织化学以及苏木精和曙红(H&E)染色(实施例7)。具有H446肿瘤的裸鼠用Hank′s平衡盐溶液(HBSS)或者SVV以1×1012vp/kg的剂量通过尾部静脉注射进行处理。小鼠在注射后3天处死并收集肿瘤。肿瘤细胞中的病毒蛋白通过利用SVV-特异性小鼠抗体(上面的试验组)的免疫组织化学目测。由HBSS或者SVV处理的小鼠收集的H446肿瘤细胞的大概形态通过H＆E染料染色(下面的试验组)。
图48显示了初级人肝细胞中SVV介导的细胞毒性(实施例9)。平板接种在胶原蛋白涂敷的12-孔板中的初级人肝细胞用每细胞1，10以及100和1000个粒子的SVV感染(ppc)。感染后3天，分别测定结合乳酸脱氢酶(LDH)的细胞以及温育上清液中的LDH。细胞毒性百分比被测定为上清液中LDH的单位与最大细胞LDH加上清液LDH的比值。
图49显示了选择的细胞系中SVV的病毒产量。为了评价SVV的复制能力，将选择的正常细胞以及肿瘤细胞感染每细胞一个病毒粒子的SVV(ppc)(实施例9)。72小时后，收集细胞并分析CVL在PER.C6细胞上的滴度。对于每一细胞系，SVV复制的效力表示为每毫升的血小板形成单位(pfu/ml)。
图50显示了裸以及CD 1小鼠相对体重的毒性(实施例10)。病毒施用后不同天数测定每一处理组中的小鼠的平均体重。在第1天通过尾部静脉给小鼠注射单剂量的SVV或者PBS。
图51显示了H446异种移植模型中的效力。H446肿瘤在裸鼠以及被分为组(n＝10)并经尾部静脉注射HBSS或者6种不同剂量的SVV处理的裸鼠以及小鼠中得以建立(实施例11)。在研究的第20天，来自具有较大肿瘤(平均肿瘤体积＝2000mm3)的HBSS组的5只小鼠注射1×1011vp/kg(显示为箭头)。数据表示为平均肿瘤体积+标准偏差(SD)。
图52显示未经处理的或者用SVV处理的H446异种移植裸鼠的图(实施例11)。SVV的效力非常强，因为100％预形成的较大肿瘤被完全除去。SVV-处理的小鼠在-处理后至少200天既不显示临床症状又不显示肿瘤的复发。
图53显示了与SVV肿瘤特异性以及体外效力有关的数据(实施例11)。该图显示H446人小细胞肺癌(SCLC)肿瘤细胞(上图)或者正常人H460细胞(底部图)的温育后细胞的存活。SVV特异性杀伤肿瘤细胞，每细胞的EC50为大约10-3个粒子。相比之下，正常人细胞在任一SVV浓度都没有被杀伤。
图54显示了包含SVV的完全基因组的代表性质粒(实施例15)。T7启动子在SVV序列的上游载体上的存在允许SVV序列的体外转录由此可以产生SVV RNA分子。
图55显示了用于构建全长以及功能性基因组SVV质粒以及随后的SVV病毒产生的示意图(实施例16)。为了获得功能性基因组SVV克隆，SVV的完全基因组可以被克隆在具有T7启动子的载体中。这可以通过制备病毒的cDNA克隆，对其测序以及将相邻的片段克隆进入一个质粒，产生表述为“pSVV”的质粒实现。具有SVV的全部基因组的质粒可被逆转录产生SVV RNA。然后将SVV RNA转染允许的哺乳动物细胞，然后回收以及纯化SVV病毒粒子。
图56显示了用于构建包含SVV编码衣壳的序列(即，1A-1D的编码区)载体(″pSVV衣壳″)的示意图(实施例16)。pSVV衣壳可因此用来产生SVV衣壳突变体文库。
图57显示了SVV衣壳的一个突变方法用于产生SVV衣壳突变体的文库(实施例16)。该解了寡核苷酸序列插入质粒的随机位点。该寡核苷酸可以是随机的寡核苷酸，具有已知序列的寡核苷酸或者编码附加表位的寡核苷酸。在该图中，限制性酶CviJI随机切割pSVV衣壳DNA。在单个位点切割的线性化pSVV衣壳DNA分离并纯化自凝胶，并且与寡核苷酸连接。
图58显示了产生包括编码衣壳的区域中的序列突变的全长SVV突变体的文库的示意图(实施例16)。例如，来自pSVV衣壳突变体文库的编码衣壳的区域(根据图57中描述的流程图产生的)是通过限制消化以及凝胶纯化分离的。包含全长SVV序列的载体也被消化由此切下编码衣壳的区域。然后将来自pSVV衣壳突变体文库的编码衣壳的区域连接到失去其野生型衣壳序列的pSVV载体，由此产生在编码衣壳的区域具有大量突变的全长SVV突变体的文库(“pSVVFL”载体)。
图59显示了产生包括衣壳突变文库的SVV病毒粒子的一般方法(实施例16)。将pSVVFL载体被逆转录产生SVV RNA。将SVV RNA转染允许的细胞，其中产生SVV突变体病毒粒子。病毒粒子消解细胞以及包括大量衣壳变体的SVV病毒粒子群，分离“SVV衣壳文库”。
图60显示了筛选可以特异性感染肿瘤细胞而不能感染非肿瘤细胞的SVV衣壳突变体的一般方法。用肿瘤细胞系或者所考虑的组织培养SVV衣壳文库。最初培育期后，洗涤细胞使得不能进入细胞的SVV病毒粒子被排除。然后保持细胞培养直到观察到病毒消解。然后收集温育上清液分离能够消解性感染肿瘤细胞的SVV衣壳突变体。然后这些病毒可以在反筛选之前通过感染已知的允许的细胞-系进行温育。通过用正常细胞培养能够感染肿瘤细胞的SVV衣壳突变体病毒进行反筛选。只收集那些在上清液中保持未结合的病毒，由此分离具有肿瘤特异性的突变体SVV病毒。可以重复本方法更进一步提纯SVV肿瘤-特异性病毒的分离。
图61显示了用于试验病毒突变体是否可以结合和/或感染细胞系的传统方法。传统方法使用的常常是温育细胞系的低效率方法，即瓶温育，因此大量筛选与大量不同的细胞系相关的病毒突变体文库变成繁重的工作。
图62显示了本发明用于筛选能够特异性感染不同细胞系的病毒突变体的高通量方法(实施例16)。在该图中，大量不同的肿瘤细胞系成长在384孔板中。向每一孔中，添加病毒样品(例如，SVV衣壳文库的样品)。从那些显示细胞病变效应的孔收集培养基，由此可以通过感染温育瓶或者大组织培养板的允许细胞系(例如，SVV，H446或PER.C6)扩增培养基中的病毒。温育病毒由此分离RNA并且对序列进行分析确定由寡核苷酸插入致衣壳突变插入的编码的肽序列。然后可以检测肽本身确定肽是否可以与肿瘤细胞类型特异性结合。
图63显示了另一高通量筛选示意图(实施例16)。肿瘤以及正常细胞系温育在多孔板中。将病毒添加入每一孔试验细胞是否被病毒介导的消解杀伤。可以通过读取每一孔中的吸光度迅速分析细胞病变效应。温育来自显示细胞病变效应的孔的病毒并更进一步地在体外(肿瘤以及正常细胞系的再试验)以及体内模型(试验病毒是否可以杀伤小鼠的移植的肿瘤)中试验。
图64显示了可以分析具有新的肿瘤特异性趋性的SVV衣壳突变体产生肿瘤选择性肽。对那些能够特异性感染肿瘤细胞系的SVV衣壳突变体进行测序以确定通过寡核苷酸插入序列编码的肽。由此可以由成功的衣壳突变体确定氨基酸共有序列。然后可以检测具有共有序列的肽以确定它们是否可以与所查询的肿瘤细胞类型特异性结合。因此肿瘤-选择性的肽可以与毒素或者药物连接以便作为肿瘤-特异性靶介质。
图65图解了可以被首先体内试验的SVV衣壳文库。小鼠(包括正常，去胸腺，裸，CD-1转基因，等)可以一移植有特异性肿瘤。然后给这些小鼠注射SVV衍生物文库，诸如SVV衣壳文库。在某些时间点，从小鼠回收肿瘤细胞，因此在那些显示肿瘤消除的小鼠中，将从最初的肿瘤样品分离病毒并在允许细胞系中生长。
图66显示了用于本发明SVV衍生物的临床试验方案。
图67图解了编码衣壳中的附加表位的SVV衍生物(具有新的肿瘤趋性)可用于多种目的。它们可以被用作通过分析表位的存在检测特异性肿瘤细胞是否存在于组织样品中的筛选试剂。或者，毒素或者其它治疗剂可以连接附加表位，然后将病毒施用于患者。更进一步地，可以辐射或者灭活野生型SVV或者SVV衍生物，由此病毒粒子本身被用作治疗装置。病毒粒子由于存在细胞程序性死亡诱导肽诱导细胞程序性死亡，或者粒子可以具有附着的毒素或者其它治疗剂，由此使病毒用作特异性靶向递送装置。
图68显示了微小RNA病毒的基本生活周期。
图69显示了与其它微小RNA病毒相比SVV的多肽长度。
图70列举了微小RNA病毒2A-类NPG/P蛋白的氨基酸比较。SVV的序列列举在SEQ ID NO2的残基635-656处。
图71列举了EMCV-R的氨基酸序列(SEQ ID NO23)。
图72列举了EMCV-PV21(登录号CAA52361)的氨基酸序列(SEQID NO24)。
图73列举了EMCV-B(登录号P17593)的氨基酸序列(SEQ IDNO25)。
图74列举了EMCV-Da(登录号P17593)的氨基酸序列(SEQ IDNO26)。
图75列举了EMCV-Db的氨基酸序列(SEQ ID NO27)。
图76列举了EMCV-PV2(登录号CAA60776)的氨基酸序列(SEQID NO28)。
图77列举了EMCV-mengo(登录号AAA46547)的氨基酸序列(SEQID NO29)。
图78列举了TMEV/DA(登录号AAA47928)的氨基酸序列(SEQ IDNO30)。
图79列举了TMEV/GDVII(登录号AAA47929)的氨基酸序列(SEQID NO31)。
图80列举了TMEV/BeAn8386(登录号AAA47930)的氨基酸序列(SEQ ID NO32)。
图81列举了TLV-NGS910(登录号BAC58035)的氨基酸序列(SEQID NO33)。
图82列举了VHEV-Siberia-55(登录号AAA47931)的氨基酸序列(SEQ ID NO34)。
发明详述术语“病毒”，“病毒粒子”，“载体粒子”，“病毒载体粒子”以及“病毒子”可以互换使用并广义上可以理解为当例如本发明的病毒载体转导或者转染合适的细胞或者细胞系时形成的用于产生感染性粒子的感染性病毒粒子。
术语“衍生物”，“突变体”，“变体”以及“修饰的”可以互换使用，大体上显示衍生物，突变体，变体或者修饰的病毒可以具有相对于模板病毒核酸或者氨基酸序列的核酸或者氨基酸序列差异。例如，SVV衍生物，突变体，变体或者修饰的SVV可以指与ATCC专利保藏号PTA-5343的野生型SVV核酸或者氨基酸序列具有核酸或者氨基酸序列差异的SVV。
在这里使用的术语“癌症”，“癌细胞”，“赘生性细胞”，“肿瘤形成”，“肿瘤”以及“肿瘤细胞”可以互换使用并指显示出相对自动生长的细胞，因此显示出由显著失去细胞增殖控制表征的异常生长表型。赘生性细胞可以是恶性的或者良性的。根据本发明，一种优选的肿瘤细胞类型是具有亲神经特性的那些。
术语两个或更多核酸或者蛋白序列角度“同一的”或者百分比“同一性”是指当使用序列比较算法诸如Protein-ProteinBLAST(Protein-Protein BLAST of GenBank databases(Altschul S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.＆Lipman，D.J.(1990)“Basic localalignment search tool.”J.Mol.Biol.215403-410))或者通过目测检查测定的最大一致性的比较以及比对时相同或者具有指定百分比的相同的氨基酸残基或者核苷酸的两个或更多序列或者子序列。BLAST算法描述在Altschul等人的J.Mol.Biol.，215403-410(1990)中，并且可公开获得的BLAST软件由National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供。
例如，在这里使用的术语“至少90％同一”是指相对于参比多肽(或者多核苷酸)从90到100的百分比同一性。90％或更高水平的同一性显示出如下的事实假定所比较的用于例证目的100个氨基酸的试验以及参比多肽长度，在试验多肽中至多10％(即，100个中的10个)氨基酸不同于参比多肽的氨基酸。可以在试验以及参比多核苷酸之间进行类似的比较。这种差异可以表示为全部长度的氨基酸序列上随机分布其中的点突变或者可以簇集在改变长度以至最大可以在100个氨基酸中有10个氨基酸差异(90％的同一性)的一个或者多个位置。
差异被定义为核酸或者氨基酸取代，插入或者缺失。在约85-90％以上的同一性水平，结果应该是独立于程序以及缺口参数背景；这种高水平的同一性可以很容易评价，常常不依赖于软件。
在本发明的上下文，术语“分离的”是指核酸分子，多肽，病毒或者细胞经人类的手远离其天然的环境存在。分离的核酸分子或者多肽可以纯化形成存在或者可以存在于非天然环境，诸如例如重组体寄主细胞中。分离的病毒或者细胞可以纯化形成存在，诸如存在于细胞培养物中，或者可以存在于非天然环境，例如重组体或者异基因生物体中。
术语“天然发生的”或者“野生型”用来描述可以从天然，不同于人类人工产生发现的实体。例如，存在于可从天然来源分离以及未经人类在实验室中有意修饰的生物体(包括病毒)中的蛋白或者核苷酸序列是天然存在的。
术语“高严格性”，“中等严格性”或者“低严格性”是指核酸杂交条件。高严格性条件是指需要靶核酸序列以及探针核酸序列之间更高同一性以便在靶和探针之间发生退火或者杂交的条件。低严格性条件是指需要靶核酸序列以及探针核酸序列之间更低同一性以便在靶和探针之间发生退火或者杂交的条件。严格性条件可以由缓冲液的盐浓度或者进行杂交的温度进行控制，其中较高的盐浓度产生较低的严格条件，而较高的温度产生较高的严格条件。虽然严格性条件会跟据进行杂交的序列的长度和核酸含量的改变而改变，高，中等和低严格性的特征条件描述在下列示范性条件中。通常使用的杂交缓冲液是具有20×对应于0.3M柠檬酸三钠和3M NaCl的母液浓度的SSC(氯化钠柠檬酸钠)。对于高严格性条件，SSC的工作浓度可以是0.1×-0.5×(1.5-7.5mM柠檬酸三钠，15-75mM NaCl)，杂交温度设在65℃。中等条件通常利用在55-62℃温度下的0.5×-2×SSC浓度(7.5-30mM柠檬酸三钠，75-300mM NaCl)。
在低严格性条件下进行的杂交可以使用50-55℃温度下的2×-5×SSC浓度(30-75mM柠檬酸三钠，300-750mM NaCl)。注意这些条件仅仅是示范性的并且不能被认为是限制。
Seneca Valley病毒(SVV)SVV是一种新的，迄今未被发现的RNA病毒，最紧密关联于微小RNA病毒科的心脏病毒属。因此，为了本发明的目的，SVV被认为是心脏病毒属以及微小RNA病毒科的成员。心脏病毒与其它微小RNA病毒的区别特征在于其基因组构成，共同的病理学特征以及在0.1MNaCl中5以及7之间的pHs下其病毒子的分离性(Scraba，D.等人，“Cardioviruses(Picornaviridae)”Encyclopedia of Virology，第二版，R.G.Webseter and A.Granoff，编辑，1999)。SVV及其他心脏病毒之间序列分析的结果在下文论述。
SVV的基因组由一具有预测大小约7.5kb的单链(+)有义链RNA分子组成(参见图4A)。因为SVV是微小RNA病毒，在所有微小RNA病毒中具有大量保守的如下特征(i)基因组RNA是感染性的，因此可以转染细胞回避病毒-受体结合并进入病毒生活周期；(ii)基因组所5′末端的长(约600-1200bp)非翻译区(UTR)以及较短的3′非翻译区(约50-100bp)；(iii)5′UTR包含三叶草叶形二级结构被称为内部核糖体进入位点(IRES)；(iv)其余的基因组编码单个多蛋白以及(v)基因组的两个末端被修饰，5′末端共价连接小碱性蛋白“Vpg”，3′末端被聚腺苷酸化。
本发明提供了分离的SVV病毒(ATCC专利保藏号PTA-5343)以及其中的SVV的全基因组内容物。目前，已经测序的最大的SVV基因组片段是来源于PTA-5343分离物的分离的SVV核酸，包括大部分SVV基因组序列，并列在图5A-5E以及图6A-6D中，在这里具有SEQ ID NO1的命名。这种核苷酸序列的翻译显示SVV的大部分单个多蛋白是由SEQ ID NO1编码的。由SEQ ID NO1的核苷酸1至5673编码的氨基酸序列列在图5A-E和图7A-7B中并且在这里具有SEQ ID NO2的命名。因此本发明提供了SEQ ID NO1的分离的部分，包括SEQ IDNOs3，5，7，9，11，13，15，17，19以及21，其可被亚克隆表达载体中，由此可以分离由SEQ ID NO1的这些部分编码的多肽。此外本发明还包括可以与SEQ ID NO1或者其任一部分在高，中等或者低严格性条件下杂交的分离的核酸。
本发明还提供了具有图9(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸2-143)所列的SEQ ID NO4的氨基酸序列的分离的部分SVV VP2(1B)蛋白。部分SVV VP2蛋白的氨基酸序列由列在图8中(对应于SEQ ID NO1的核苷酸4-429)的SEQ ID NO3的核酸序列编码。
本发明还提供了具有图11(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸144-382)所列的SEQ ID NO6的氨基酸序列的分离的SVV VP3(1C)蛋白。SVV VP3蛋白的氨基酸序列由列在图10中(对应于SEQ ID NO1的核苷酸430-1146)的SEQ ID NO10的核酸序列编码。
本发明还提供了具有图13(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸383-641)所列的SEQ ID NO8的氨基酸序列的分离的SVV VP1(1D)蛋白。SVV VP1蛋白的氨基酸序列由列在图12中(对应于SEQ ID NO1的核苷酸1147-1923)的SEQ ID NO7的核酸序列编码。
本发明还提供了具有图15(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸642-655)所列的SEQ ID NO10的氨基酸序列的分离的SVV 2A蛋白。SVV 2A蛋白的氨基酸序列由列在图14中(对应于SEQ ID NO1的核苷酸1924-1965)的SEQ ID NO9的核酸序列编码。
本发明还提供了具有图17(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸656-783)所列的SEQ ID NO12的氨基酸序列的分离的SVV 2B蛋白。SVV 2B蛋白的氨基酸序列由列在图16中(对应于SEQ ID NO1的核苷酸1966-2349)的SEQ ID NO11的核酸序列编码。
本发明还提供了具有图19(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸784-1105)所列的SEQ ID NO14的氨基酸序列的分离的SVV 2C蛋白。SVV 2B蛋白的氨基酸序列由列在图18中(对应于SEQ ID NO1的核苷酸2350-3315)的SEQ ID NO13的核酸序列编码。
本发明还提供了具有图21(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸1106-1195)所列的SEQ ID NO16的氨基酸序列的分离的SVV 3A蛋白。SVV 3A蛋白的氨基酸序列由列在图20中(对应于SEQ ID NO1的核苷酸3316-3585)的SEQ ID NO15的核酸序列编码。
本发明还提供了具有图23(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸1196-1217)所列的SEQ ID NO18的氨基酸序列的分离的SVV 3B(VPg)蛋白。SVV 3B蛋白的氨基酸序列由列在图22中(对应于SEQ ID NO1的核苷酸3586-3651)的SEQ ID NO17的核酸序列编码。
本发明还提供了具有图25(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸1218-1428)所列的SEQ ID NO20的氨基酸序列的分离的SVV 3C(“pro”或者“蛋白酶”)蛋白。SVV 3C蛋白的氨基酸序列由列在图24中(对应于SEQ ID NO1的核苷酸3652-4284)的SEQ ID NO19的核酸序列编码。
本发明还提供了具有图27(其对应于SEQ ID NO2的氨基酸1429-1890)所列的SEQ ID NO22的氨基酸序列的分离的SVV 3D(“pol”或者“聚合酶”)蛋白。SVV 3C蛋白的氨基酸序列由图24(其相当于SEQID NO1的核苷酸4285-5673；核苷酸5671-5673，“tga”编码终止子，在氨基酸序列表中描述为星号“*”)所列的SEQ ID NO19的核酸序列编码。
本发明的核酸包括RNA以及DNA形式，并且暗含提供的序列表的互补序列。
因此，由SEQ ID NO1显示的分离的SVV核酸具有5,752个核苷酸，其编码由SEQ ID NO2显示的氨基酸序列的多肽。SVV基因组序列被翻译为被切割成多种下游“翻译产物”的单个多蛋白。本发明包含SEQ ID NO1的所有核酸片段以及由这种片段编码的所有多肽。
大部分全长SVV多蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO1的核苷酸1-5673编码。多蛋白被切割成3个前体蛋白，P1，P2以及P3(图4B)。P1，P2以及P3被更进一步切割成较小的产物。结构区域P1的裂解产物(1ABCD；或者衣壳区域)为1ABC，VPO，VP4，VP2，VP3以及VP1。非结构蛋白P2(2ABC)的裂解产物为2A，2BC，2B以及2C。非结构区域P3多蛋白(3ABCD)的裂解产物为3AB，3CD，3A，3C，3D，3C′以及3D′。在某些实施方案中，本发明提供了包含如下成分的分离的核酸(i)2ABC(SEQ ID NO1的核苷酸1924-3315)的序列及其编码的蛋白；(ii)2BC(SEQ NO1的核苷酸1966-3315)的序列及其编码的蛋白；(iii)3ABCD(SEQ ID NO1的核苷酸3316-5673)的序列及其编码的蛋白；(iv)3AB(SEQ ID NO1的核苷酸3316-3651)的序列及其编码的蛋白；以及(v)3CD(SEQ ID NO1的核苷酸3652-5673)的序列及其编码的蛋白。
微小RNA病毒的基本衣壳结构由密集包装的二十面体排列的60个前粒子组成，每个包括4种多肽，VP1，VP2，VP3以及VP4，所有均源于原始前粒子VPO的裂解。SVV病毒粒子直径为约27nm(参见图2)，其与其它直径为约27-30nm的微小RNA病毒粒子的大小相符。
微小RNA病毒复制的很快速，完成的周期为约5-10小时(通常约8小时)(参见图68的微小RNA病毒复制循环的示意图)。受体结合后，基因组RNA从粒子释放到细胞质中。然后由多核糖体直接翻译基因组RNA，但是感染后约30分钟，细胞的蛋白质合成迅速下降至几乎为零。这种现象被称作“关闭”并且是细胞病变效应(cpe)的根本原因。关闭似乎是由于寄主细胞220kDa帽-结合复合物(CBC)的裂解，所述复合物参与所有真核mRNA在翻译起始期间m7G帽式结构的结合。CBC的裂解似乎是由2A蛋白酶所引起。
5′UTR包含IRES。通常，当核糖体与5′甲基化帽结合时引发真核翻译然后沿着mRNA扫描寻找最初的AUG起始密码子。IRES克服了该过程并可以使微小RNA病毒RNA在CBC降解后继续被翻译。
病毒多蛋白最初由2A蛋白酶裂解成多蛋白P1，P2和P3(参见图4B)。然后由3C，主要的微小RNA病毒蛋白酶进行更进一步的裂解事件。由3C制成的一种裂解产物是病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(3D)，其拷贝基因组RNA产生(-)链无义。(-)无义链形成用于(+)有义链(基因组)RNA合成的模板。一些(+)有义链被翻译产生附加的病毒蛋白，一些(+)有义链被包装到衣壳中形成新的病毒粒子。
(+)有义链RNA基因组被认为被包装到预形成的衣壳中，虽然尚不清楚基因组和衣壳之间的分子间相互作用。空衣壳是所有微小RNA病毒感染共通的。衣壳由P1多蛋白前体裂解成由VPO，VP3和VP1组成的前粒子进行组装，其连接在一起封入基因组。病毒粒子的成熟和感染性依赖于VPO内部自动催化裂解成VP2和VP4。当消解时发生新近形成的病毒粒子的释放。
本发明还提供了具有ATCC专利保藏号PTA-5343的所有鉴定特性和核酸序列的分离的病毒。本发明的病毒可以指PTA-5343分离物，PTA-5343分离物的变体，同系物，衍生物和突变体以及其它相对于SVV(在本文公开的野生型以及突变型)决定其肿瘤消解特性的序列进行修饰的微小RNA病毒的变体，同系物，衍生物和突变体。
本发明此外提供了特异性抗如下成分的抗体ATTC专利保藏号PTA-5343的分离的SVV以及来自具有SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，14，16，18，20以及22的氨基酸序列的分离的SVV蛋白的表位。本发明还包括特异性针对来自由SEQ ID NO1的片段或者部分编码的蛋白的表位的抗体。
来自多种心脏病毒分离物的RNA序列的比较分析显示基因组之间＞45％的核苷酸同一性。心脏病毒可以被亚分成EMC-类病毒(“EMCV”-诸如，Mengo，B，R；以及MM，ME，Columbia-SK)，Theiler氏-类病毒(“TMEV”-诸如，BeAn，DA以及GD VII株)以及Vilyuisk病毒。
在对其它病毒分析SVV序列中，发现SVV是心脏病毒(参见实施例4以及其中引用的附图)。如果EMCV和TMEV被作为标准的心脏病毒，显而易见SVV不是典型的心脏病毒。然而，即使这2种病毒也具有差异，值得注意的是在5’UTR(Pevear等人，1987，J.Virol.，611507-1516)。SVV与EMCV和TMEV在其大量多蛋白(P1，2C，3Cpro和3Dpol区域；参见图31-37)方面系统簇集，显示SVV很可能是心脏病毒。
癌症的治疗方法本发明提供了使用鉴于SVV的肿瘤消解特性修饰的病毒，包括微小RNA病毒，其衍生物，变体，突变体或者同系物治疗癌症的方法。本发明显示野生型SVV(即ATTC专利保藏号PTA-5343)能够选择性杀伤一些类型的肿瘤。例如，SVV可以选择性杀伤具有亲神经或者神经内分泌特性的肿瘤细胞，包括小细胞肺癌(SCLC)和成神经细胞瘤。预计由本发明的病毒治疗的神经内分泌的肿瘤的其它实例包括但是不局限于肾上腺嗜铬细胞瘤，胃泌素瘤(引起卓-艾氏综合征)，胰升血糖素瘤，胰岛细胞瘤，髓样癌(包括甲状腺髓样癌)，多发性内分泌瘤综合症，胰腺内分泌瘤，副神经节瘤，VIPomas(血管活性肠多肽肿瘤)，胰岛细胞瘤和嗜铬细胞瘤。
本发明还包含4种神经内分泌肺肿瘤。最严重的类型的小细胞肺癌(SCLC)是所有癌症最迅速生长和扩散的癌症。大细胞神经内分泌癌是罕见的癌症，除形成癌症的细胞的大小之外在其预后以及如何治疗病人方面非常类似于SCLC。类癌瘤又名类癌包含另2种肺神经内分泌癌症。这2个类型是典型的类癌以及非典型的类癌。
不希望受限于理论，SVV特异性杀伤肿瘤细胞的能力可以包括但是不局限于经肿瘤-选择性细胞进入，肿瘤选择性翻译，肿瘤选择性蛋白水解，肿瘤选择性RNA复制及其组合选择性复制，细胞程序性死亡，消解细胞。
SVV具有许多优于肿瘤消解病毒包括修饰的腺病毒有益特性，包括例如(i)SVV对具有神经特性的癌症，包括SCLC，维耳姆斯瘤，成视网膜细胞瘤以及成神经细胞瘤具有很高的选择性-例如，SVV显示对神经内分泌肿瘤细胞大于10,000倍的选择性；(ii)SVV比化疗已经显示出好于1，000倍的细胞杀伤特异性；(iii)小鼠在系统施用每公斤高达1014病毒粒子后SVV没有显示明显的毒性；(iv)SVV的效力非常强，因为小鼠的100％的较大的预形成肿瘤可以被根除，没有肿瘤生长的复发；(v)SVV可以被纯化至高滴度并且可以在允许细胞系中以每细胞超过200,000个粒子产生；(vi)SVV具有比其它的肿瘤消解病毒能够较好渗透以及扩撒的小尺寸(SVV直径小于30nm)，(vii)SVV复制迅速(小于12小时)以及(viii)对于SVV用作特异性抗肿瘤剂无需修饰。
此外，最初的研究(参见实施例6)显示一些附加因素使SVV成为用于肿瘤消解病毒治疗的有利工具(i)人血清样品不包含直接针对SVV的中和抗体；(ii)SVV被补体抑制；以及(iii)SVV不被血细胞凝集抑制。所有的这些因素使SVV显示出比其它的肿瘤消解病毒较长体内循环时间的事实(例如，参见实施例7)。
本发明提供了选择性杀伤细胞群体中赘生性细胞的方法，包括将有效量SVV与所述细胞群体在病毒可以转导细胞群体中的赘生性细胞的条件下接触，复制以及杀伤赘生性细胞。除SVV体内杀伤肿瘤细胞的方法之外，本方法包含肿瘤可以被进行如下操作的实施方案(1)当被SVV感染时体外温育；(2)非肿瘤细胞存在下温育；以及(3)细胞为哺乳动物的细胞(肿瘤以及非肿瘤细胞)，包括细胞是人细胞。细胞的体外温育以及由SVV感染可以具有多种应用。例如，体外感染被用作产生大量SVV的方法，作为用于确定或者检测赘生性细胞是否存在于细胞群体中的方法，或者作为筛选突变体SVV是否可以特异性靶向以及杀伤多种肿瘤细胞或者组织类型的方法。
本发明还提供了治疗癌症的离体方法，其中细胞分离自人癌症患者，体外温育的细胞，感染有选择性杀伤癌细胞的SVV的细胞，并且非肿瘤细胞被导回患者。或者，分离自患者的细胞可以感染SVV并被立即导回患者作为将SVV施用给患者的方法。在一个实施方案中，癌细胞是造血来源的。任选地，患者可以接受治疗(例如化疗或者放疗)在将温育细胞导回患者之前体内破坏患者的肿瘤细胞。在一个实施方案中，该治疗可用来破坏患者的骨髓细胞。
SVV对具有神经特性的抗肿瘤细胞类型存在有效的抗肿瘤活性。SVV不显示出抗正常人，大鼠小鼠，牛或者绵羊细胞系或者非神经肿瘤细胞系的消解活性。此外SVV对初级人肝细胞无细胞毒性。下表1概括了已经进行的确定SVV对选择的肿瘤细胞类型体外消解效力的研究。
表1SVV抗选择的肿瘤细胞类型的消解效力

鼠的研究(参见实施例)显示SVV可以高效力以及高特异性体内杀伤肿瘤。这些体内研究显示SVV具有大量优于其它肿瘤消解病毒的优点。例如，影响肿瘤消解肿瘤病毒根除形成的肿瘤能力的一个重要因素是病毒渗透。在用腺病毒载体的研究中，基于Ad5的载体对无胸腺小鼠的SCLC肿瘤发育没有影响。根据免疫组织化学的结果，腺病毒看起来不能渗透形成的肿瘤。相比之下，在单次系统施用后SVV能够清除无胸腺裸鼠的H446SCLC肿瘤。SVV具有比其它病毒能够良好渗透肿瘤组织并在其中扩散的较小大小(直径＜30nm)，这种小尺寸的SVV可以促进其成功渗透并根除已形成肿瘤的能力。
化学抗性是那些接受化疗作为癌症治疗的一个方面的任何患者面临的主要争论问题。产生化学抗性的患者即使不总是但也常常具有非常差的预后并且不能进行选择性治疗。众所周知，化学抗性的一个主要原因是被称作多重耐药蛋白(MRPs)家族的蛋白的表达，过表达或者活性增加。本申请人发现某些肿瘤细胞对于SVV的灵敏性也与癌细胞的化学抗性状态和MRP表达相关。H69是对SVV具有体外抗性的化学敏感的(阿霉素)细胞系，而H69AR是过表达MRPs并且对SVV敏感(参见表1)的化学抗性的细胞系。证据显示包括MDR的MRPs过表达与细胞对SVV杀伤的敏感性相关。因此，在一个实施方案中，本发明提供了癌症的治疗方法，其中SVV杀伤过表达MRP的细胞。
本发明还提供了治疗由于异常细胞诸如异常增殖细胞引起的疾病的方法。该方法包括将所述异常细胞与SVV以引起异常细胞部分或者全部破坏的方式接触。SVV可用于治疗多种由于异常细胞引起的疾病。这些疾病的实例包括但是不局限于肿瘤细胞显示神经内分泌特征的癌症以及神经纤维瘤。
神经内分泌肿瘤可以通过多种方法进行鉴定。例如，神经内分泌肿瘤产生并分泌大量肽类激素以及胺。一些物质引起特异性临床综合症良性肿瘤，卓-艾氏综合征，高血糖，胰升血糖素瘤以及WDHA综合症。这些综合症的特异性标记分别是尿5-HIAA，血清或者血浆胃泌素，胰岛素，胰高血糖素以及血管活性肠多肽的基础和/或刺激水平。一些类癌瘤以及约三分之一的内分泌胰腺肿瘤不表现任何临床症状并称作“无功能”肿瘤。因此，诸如嗜铬粒蛋白A，胰多肽，血清神经元-特异性烯醇酶以及糖蛋白激素亚基的常规肿瘤标记物已经被用于不具有明显临床的激素相关症状的患者的筛选目的。
在这些常规肿瘤标记物之中，虽然嗜铬粒蛋白A的确切功能尚不清楚，但是已经显示出可做为多种型式的神经内分泌瘤很敏感并特异性的血清标记。这是因为它还可能在较差分化的不分泌已知激素的神经内分泌来源的肿瘤的很多情况下得以提高。目前，嗜铬粒蛋白A被认为是可用于诊断以及疗效评价最好的常规神经内分泌血清或者血浆标记以及对于具有不同神经内分泌肿瘤的病人增加50-100％。嗜铬粒蛋白A血清或者血浆水平反映了肿瘤的载量并且可能是患有中肠良性肿瘤的病人预后的独立标记。
本发明还提供了包括SVV以及药用载体的药物组合物。可以包含有效量药用载体中的SVV的这种组合物可适于以单位剂型，无菌肠胃外溶液或者悬浮液，无菌非肠胃外溶液或者口服的溶液或者悬浮液，水包油型或者油包水乳化液等形式局部或者系统施用给个体。用于肠胃外以及非肠胃外给药的制剂是本领域已知的。组合物还包括冻干和/或重组形式的SVV。可接受的药物载体是例如，盐溶液，硫酸精蛋白(Elkins-Sinn，Inc.，Cherry Hill，NJ)，水，水性缓冲液，诸如磷酸盐缓冲液以及Tris缓冲液或者聚凝胺(Sigma Chemical，St.Louis，MO)以及磷酸缓冲盐水以及蔗糖。根据本发明的教导适合的药物载体的选择被认为是对于那些本领域技术人员而言是显而易见的。这些溶液是无菌的并且通常不含除了SVV的粒子物质。组合物可以包含生理条件所需的药用助剂物质，诸如pH调节以及缓冲剂，毒性调节剂等等，例如，乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等。加强由SVV感染细胞的赋形剂也包括在内。
SVV以经由病毒在肿瘤细胞中的复制有效抑制，阻止或破坏肿瘤细胞生长的量施用于宿主或者受试者。利用SVV用于癌症治疗的方法包括以安全，可开发以及耐受的剂量系统，区域或者局部递送病毒以便引发治疗有效地破坏肿瘤细胞。甚至在系统施用后，SVV的治疗指数为至少10，优选至少100或更优选至少1000。通常，SVV以1×108以及1×1014vp/kg之间的量施用。所施用的确切剂量依赖于多种因素，包括患者的年龄，体重，以及性别，以及所治疗的肿瘤的大小以及严重程度。病毒可以施用一或者多次，取决于宿主的免疫应答潜能。单次或者多次施用组合物可以治疗医师选择的剂量水平以及模式进行。如有必要，免疫应答可以通过采用多种免疫抑制剂削弱，以便可以通过降低对病毒的免疫应答反复性施用和/或加强复制。本发明的抗肿瘤病毒治疗可以与其它的抗肿瘤方案组合。递送可以多种方式实现，采用脂质体，直接注入，导管，局部施用，吸入等等。此外，SVV基因组RNA或者其部分的DNA拷贝还可以作为递送方法，其中随后DNA由细胞转录产生SVV病毒粒子或者特定的SVV多肽。
治疗有效剂量是指引起患者症状的改善或者存活延长的病毒的量。病毒的毒性以及治疗效能可以由细胞培养或者实验动物的标准方法确定，例如用于确定LD50(50％的动物或者细胞群致死的剂量；对于病毒，该剂量是vp/kg的单位)以及ED50(50％动物或者细胞群治疗有效的剂量-vp/kg)或者EC50(50％动物或者细胞群的有效浓度-vp/细胞(例如，参见表1)。毒性和治疗治疗之间的剂量比率是治疗指数并且可以表示为LD50和ED50或者EC50之间的比率。优选显示出高治疗指数的病毒。这些细胞培养分析以及动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。病毒的剂量优选处于包括没有毒性的ED50或者EC50的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型以及所利用的给药途径在这个范围内变化。在另一方面，提供了治疗具有肿瘤病症的宿主生物体的方法，包括给所述宿主生物体施用治疗有效量的本发明的病毒组合物。在一个实施方案中，肿瘤组织异常增殖并且肿瘤组织可以是恶性肿瘤组织。优选地，病毒由于其在肿瘤组织中的选择性复制能力分布遍及组织或者肿瘤团。可能用本发明方法治疗的肿瘤病症包括那些具有亲神经特性的肿瘤病症。
产生本发明病毒的方法产生很高滴度以及产量的本发明病毒的是本发明的附加方面。如上所述，SVV可以被纯化至高滴度并且可以在允许细胞系中每细胞产生超过200,000个粒子。能够产生大量病毒的细胞包括但是不局限于，PER.C6(Fallaux等人，Human Gene Therapv，91909-1917，1998)，H446(ATCC#HTB-171)以及在表1中列举的其它细胞系，其EC50值小于10。
例如，微小RNA病毒的温育可以如下所述进行。目的病毒经噬斑纯化一次并且在允许细胞系，诸如PER.C6中挑选以及扩增充分分离的噬斑。来自受感染细胞的粗病毒裂解物(CVL)可由多循环的冷冻以及解冻产生并用于感染大量的允许细胞。允许细胞可以温育在不同的组织培养瓶中，例如50×150cm2瓶，使用不同培养基，诸如包含10％胎牛血清(Biowhitaker，Walkersvile，MD)以及10mM氯化镁(Sigma，StLouis，MO)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen，Carlsbad，CA)。可以在感染后24-48小时之间或者当注意到完全的细胞病变效应(CPE)时收获受感染细胞，并且由在1500rpm，4℃离心10分钟收集。将细胞沉淀再悬浮在细胞培养上清液中并进行多循环的冷冻以及解冻。通过在1500rpm，4℃离心10分钟对所产生的CVL进行澄清化。可以通过梯度离心纯化病毒。例如，2轮CsCl梯度离心可以足以纯化SVV一步梯度离心(CsCl的密度为1.24g/ml以及1.4g/ml)，继之以一次连续梯度离心(CsCl的密度为1.33g/ml)。由分光光度计确定纯化病毒的浓度，假定1A260＝9.5×1012个粒子(Scraba D.G.，以及Palmenberg，A.C.1999.Cardioviruses Picornaviridae)。InEncyclopediaof Virology.第二版，R.G.Webster and A Granoff Eds)。纯化病毒的滴度也使用PER.C6细胞通过标准的酸菌斑法确定。PER.C6细胞的SVV的产量大于每细胞200,000个粒子，粒子与PFU的比率为约100。其它允许细胞(H446-ATCC#HTB-171)的SVV的产量可能至少这样高或者更高。
此外，商业上的大规模的药品生产质量管理规范(GMP)的几个步骤也适于纯化SVV。本发明也包括基于纯化腺病毒的方法纯化SVV的方法。这些方法包括基于其密度分离SVV，因为SVV与腺病毒具有非常类似的密度并且可以与腺病毒共纯化。
检测以及研究肿瘤的方法本发明提供了使用本发明的病毒检测患者的肿瘤或者赘生性细胞的方法。细胞样品可以获自患者并通过用附加表位的SVV(或者由本发明提供的其它肿瘤特异性病毒，即肿瘤特异性突变体心脏病毒)温育样品，然后通过检测附加表位筛选样品与SVV的结合进行筛选。或者可以通过检测SVV是否引起任何的消解筛选样品。如果SVV确实引起消解，或者如果SVV可以与样品中的细胞特异性结合，将显示样品可能包含已知能够结合或者被SVV感染的肿瘤或者肿瘤细胞。
另外，SVV可用于检测体内肿瘤细胞的方法。在该方法中，附加表位的SVV可以首先以某种方式灭活，其中SVV可以仍然特异性结合肿瘤细胞但是不能复制。已经结合SVV的肿瘤细胞可以通过分析附加表位进行检测。附加表位的检测可以通过特异性结合表位的抗体实现，其中抗体或者被标记(例如，荧光标记)或者其中抗体能因此通过标记的第二抗体检测。
本发明的检测方法包含检测由本发明的任何病毒特异性靶向的任何类型的肿瘤或者赘生性细胞。特异性肿瘤类型包括例如，神经内分泌型肿瘤，诸如成视网膜细胞瘤，SCLC，成神经细胞瘤成胶质细胞瘤以及成神经管细胞瘤。
本发明还提供了SVV作为研究肿瘤细胞的工具的应用。SVV选择性破坏一些肿瘤细胞类型，并且即使有已经对非肿瘤细胞几乎没有毒性。因为这些特性，SVV可用于研究肿瘤并且可能发现了一种新的肿瘤特异基因和/或途径。换句话说，肿瘤细胞有一些特性可以使SVV复制，其中正常细胞不显示出所述特性。在鉴定了一种新的肿瘤特异基因和/或途径后，然后可以设计或者筛选治疗抗体或者小分子从而确定这些试剂是否是抗肿瘤剂。
本发明还提供了用于鉴定对SVV应答的所有类型的癌症的方法。在一个实施方案中，用于鉴定SVV-应答的细胞的方法包括获得细胞，将所述细胞与SVV接触以及检测细胞杀伤或者检测病毒复制。细胞杀伤可以使用本领域技术人员已知的不同方法进行检测(例如，MTS分析，参见本文的高通量部分)。检测病毒复制的方法是本领域已知的(例如，观察CPE，噬菌斑法，DNA定量分析法，FACS以检测肿瘤细胞中的病毒量，RT-PCR分析以检测病毒RNA等)。在一个实施方案中，细胞是癌症细胞。癌细胞的实例包括但是不局限于形成的肿瘤细胞系以及获自哺乳动物的肿瘤细胞。在一个实施方案中，哺乳动物是人。在另外的实施方案，细胞是获自人类癌症患者的癌细胞。
用于鉴定SVV-应答的癌细胞的方法可用来发现允许用于SVV复制的肿瘤细胞系或者肿瘤组织。此外，通过确定允许的肿瘤细胞的特性，将可以鉴定引起细胞被SVV选择性杀伤的肿瘤细胞的特性。这些特性的发现可以产生用于癌症药物的新靶。同样，用于鉴定SVV应答的癌细胞的方法可用作将受益于SVV治疗的人类癌症患者的筛子。
因为尚未确定SVV的天然寄主，所以需要一种检测SVV的方法。因此，本发明提供了检测SVV的方法。在一个实施方案中，检测分析是基于特异于SVV多肽表位的抗体。在另一实施方案中，该检测分析是基于核酸杂交。在一个实施方案中，从SVV分离RNA，标记(例如，放射性，化学发光，荧光等)制备探针。然后从硝化纤维(或者类似或者功能等效的基材)结合的试验材料分离RNA，用标记的SVV RNA探测并检测结合的探针的量。此外，可以对病毒的RNA直接或者间接测序并基于序列开发PCR分析。在一个实施方案中，PCR分析是实时PCR分析。
制备改变趋性的病毒的方法本发明提供了用于构建SVV突变体(或者变体或者衍生物)的方法，其中这些突变体具有改变的细胞类型趋性。具体地，选择能够特异性结合和/或杀伤已知抗野生型SVV结合的肿瘤或者赘生性细胞的SVV突变体。
天然或者野生型SVV具有可以使天然病毒修饰使其靶向其它癌症指标的简单的基因组以及结构。这些新的衍生物具有针对非神经癌症的延伸的趋性并且在天然的SVV中仍然保持较高的治疗指数。靶向的一种可能的方式是将组织特异性肽或者配体包含在病毒上。
为了挑选癌症靶向病毒候选物，本发明提供了用编码天然SVV的衣壳区域中的随机肽序列的遗传插入子构建以及筛选肿瘤消解病毒文库的方法。具有108种的随机的肽文库被认为是足够的并且将产生将病毒特异性导向肿瘤组织的肽。
多种研究已经显示肿瘤细胞显示出与正常细胞不同的特性(1)肿瘤细胞具有更可渗透的细胞膜；(2)肿瘤具有特异性基质细胞类型诸如血管发生内皮细胞，其先前已经显示可以表达细胞型特异性受体；以及(3)肿瘤细胞差异表达某些受体，抗原以及细胞外基质蛋白(Arap，W.等人，Nat.Med.，2002，8(2)121-127；Kolonin，M.等，Curr.Opin.Chem.Biol.，2001，5(3)308-313；St.Croix，B.等人，Science，2000，289(5482)1997-1202)。这些研究显示肿瘤以及正常组织在分子水平是不同的，并且靶向药物递送以及癌症治疗是可行的。具体地，通过小鼠模型的血管复位选择的几个肽已经被用来靶向递送细胞毒性药物(Arap，W.等人，Science，1998，279(5349)377-380)，pro-apoptotic肽(Ellerby，H.M.等人，Nat.Med.，1999，17(8)768-774)，金属蛋白酶抑制剂(Koivunen，E.等人，Nat.Biotechnol，1999，17(8)768-774)，细胞因子(Curnis，F.等人，Nat.Biotechnol.，2000，18(11)1185-1190)，荧光团(Hong.F.D.以及Cayman，G.L.，Cancer Res.，2000，60(23)6551-6556)以及基因(Trepel，M.等人，Hum.Gene Ther.，2000，11(14)1971-1981)。已经证实肿瘤靶向肽可以提高母体药物的效力并且降低其毒性。
SVV衍生物的文库可以通过将随机的肽序列插入病毒的衣壳区域产生。如图57所示，首先产生包含SVV衣壳区域的载体，即“pSVV衣壳”。这种衣壳载体可被例如用在随机位置切割DNA的限制性酶，即CviJI(一种钝切割酶)切割载体进行诱变处理。在多个位置切割载体，并且可以通过凝胶纯化分离只被CviJI切割一次的DNA(参见图57)。这种分离的DNA群包含大量已经在衣壳区域不同位置被切割的DNA。然后用寡核苷酸以及连接酶温育这个群，使得一定百分比的寡核苷酸连接到载体衣壳区域中的大量不同位置。以这种方式，可以产生突变体SVV衣壳的文库。
被插入编码衣壳的区域中的寡核苷酸可以是随机的寡核苷酸，非随机的寡核苷酸(即预确定的寡核苷酸的序列)，或者半随机的(即预确定的一部分寡核苷酸以及具有随机序列的部分)。所考虑的寡核苷酸的非随机方面可以包含一个表位编码区域。所考虑的表位包括，但是不局限于c-myc-人原癌基因myc的10氨基酸片段(EQKLISEEDL(SEQ IDNO35)；来自人流行性感冒血球凝集素蛋白的HA-凝血素蛋白(YPYDVPDYA(SEQ ID NO36))；以及His6-6个连续组氨酸的编码序列。
然后可以用限制性酶消化突变体衣壳多核苷酸的文库(例如，图57中的“pSVV衣壳文库”)，因此只切除了突变体编码衣壳的区。然后将这个突变体编码衣壳的区连接到包含全长基因组序列减去衣壳区域的载体中(例如，参见图58)。该连接产生具有全长基因组序列的载体，其中载体群(或者文库)包含大量突变体衣壳。在图58中，包括不同衣壳的SVV突变体的这个文库表示为“pSVVFL衣壳”。然后对pSVVFL衣壳载体文库线性化并逆转录以便产生突变体SVV RNA(参见图59)。然后将突变体SVV RNA转入允许细胞系，使得寄主细胞翻译那些在其衣壳中具有合格突变的SVV序列产生大量的突变体SVV粒子。在图59中，大量的突变体SVV粒子表示为“SVV衣壳文库”。
被插入编码衣壳的区域的由寡核苷酸编码的肽可以作为特异性病毒感染的靶向部分。靶向特异性癌症的病毒将只选择性感染那些具有肽的受体的癌细胞，在这些细胞中复制，杀伤这些细胞，并只扩散那些相同类型的细胞。本方法可以鉴定新的肿瘤靶向肽和配体，肿瘤选择性受体，治疗的SVV衍生物及其他病毒衍生物，包括微小RNA病毒衍生物。
SVV突变体文库的体外和体内筛选具有优于诸如肽珠文库和噬菌体展示的其它技术相比的几个优点。与其他的技术不同，可以原位复制本文的所希望的候选物，即选择性结合癌细胞的SVV衍生物。这种基于复制的文库方法比在先的发现新的结合部分的方法诸如噬菌体展示具有很多优点。首先，SVV文库的筛选是基于复制。只可以在靶组织中，在这里为某些癌细胞中复制所期望的病毒衍生物。该筛选/选择过程将产生具有靶向肽部分并且可能是癌症治疗本身的非常特异性的病毒候选物。相反，噬菌体展示筛选只会产生结合事件并只产生靶向肽候选物。因此，SVV文库筛选提供了非常快速以及选择性的方法。第二，在体外或者体内噬菌体展示筛选期间，从靶细胞回收的噬菌体必须在细菌中扩增，而SVV衍生物可以直接回收并纯化自受感染细胞(或者消解性感染的细胞的温育上清液)。第三，SVV具有可以很容易进行操纵的较小基因组；因此可以将遗传信息随即插入衣壳区域确保最佳化插入。因此，SVV文库的构建以及筛选非常有可能产生高度有效的病毒衍生物。设计以及筛选这些衍生物从而特异性感染具有非神经特性的癌症。
将寡核苷酸插入编码衣壳的区域将产生一些缺陷突变株。突变体在在一定意义上有缺陷，以致寡核苷酸序列的插入可以产生终止密码子，因此将不会产生病毒多蛋白。同时，突变体在一定意义上可能有缺陷，以致寡核苷酸序列的插入可能引起衣壳结构的改变，使得衣壳不再能被组装。为了减少寡核苷酸序列的插入可能引起终止密码子或者不稳定的衣壳结构的几率，可以使用诸如TRIM法设计随机的寡核苷酸，使其不编码终止密码子或者某些氨基酸。
为了确定衣壳区域中是否有寡核苷酸的最佳插入点，可以产生RGD-SVV文库(参见实施例16)。例如用CviJI随机切割编码SVV衣壳的多核苷酸。然后将随机线性化的衣壳多核苷酸连接至至少编码RGD氨基酸序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的寡核苷酸。然后将这些RGD-衣壳序列连接至缺失衣壳序列的SVV全长序列载体中。产生RGD-SVV衍生物病毒并试验其在某些表达整联蛋白的细胞系中(因为RGD肽已经显示可以将实体靶向整联蛋白受体)感染以及复制的能力。然后分析成功感染表达整联蛋白的细胞系的RGD-SVV衍生物以确定是否具有RGD寡核苷酸的主要插入位点。然后该位点可用于随机，非随机或者半随机的寡核苷酸的位点定向插入。
此外，在比较SVV及其他微小RNA病毒的编码衣壳的区域部分中(参见图28)，在序列相似性最低的病毒之间有不同的没有框出的区域。这些区域在促进病毒之间不同趋性方面是非常重要的。因此，这些区域可能是寡核苷酸插入致SVV衣壳(以及其它的病毒衣壳)突变的候选位点。
灭活SVV用于肿瘤-特异性治疗因为SVV以及SVV-衣壳衍生物可以靶向特异性肿瘤细胞类型和/或组织，SVV粒子本身可用作治疗的递送介质。在这种方法中，对SVV肿瘤消解能力的需要是任选的，因为递送的治疗剂可以杀伤靶肿瘤细胞。
例如，可以灭活野生型SVV，使得病毒不再消解感染的细胞，但是其中病毒仍然可以特异性结合并进入靶肿瘤细胞类型。存在许多本领域已知的病毒复制功能灭活的标准方法。例如，由甲醛液或者β-丙内酯灭活病毒疫苗，使病毒无法复制。野生型SVV本身可以包含引起细胞程序性死亡的肽。或者，可以辐射SVV。然而，应该首先试验辐射的病毒以确保它们仍然能够特异性靶向肿瘤细胞，因为某些辐射条件可以引起蛋白以及衣壳的改变。此外，可以产生缺失包装信号序列的突变体SVVs。这些SVV突变体能够特异性结合并进入靶细胞，但是复制的SVV基因组RNA不会包装并组装到衣壳中。然而，本方法已被证实有效，因为这些突变体SVVs的最初进入将引起宿主蛋白质合成关闭因此仍然实现了肿瘤-细胞死亡。
还可以灭活具有突变体衣壳的衍生物SVVs并用于杀伤癌症细胞。被插入衣壳区域的具有寡核苷酸编码附加表位的衍生物SVVs可用作将毒素递送至肿瘤细胞的介质。如本文所述，可以随机诱变处理衍生物SVVs并筛选肿瘤特异性趋性。毒素可以附着于附加表位，由此病毒将毒素递送至肿瘤细胞。或者，可以使用特异性结合附加表位的治疗抗体，由此病毒将治疗抗体递送至肿瘤细胞。
高通量筛选本发明包含用于筛选能够特异性感染不同细胞系的病毒的高通量方法。可以通过分析细胞病变效应检测感染的特异性。例如，可以将大量的不同肿瘤细胞系温育在可用于高通量筛选的多孔板，例如384孔板的不同孔中。将病毒样品添加入每一孔试验细胞是否被病毒介导的消解杀伤。从那些显示细胞病变效应的孔收集培养基，培养基中的任何病毒可以通过感染瓶或者大组织培养板中的允许细胞系进行扩增。温育病毒，由此分离RNA并进行序列分析确定可能决定提供对于病毒的肿瘤细胞类型特异性趋性的序列突变。
多种比色和荧光法可以迅速分析细胞病变效应，包括基于荧光染料的分析，基于ATP的分析，MTS分析以及LDH分析。基于荧光染料的分析可以包括核酸染色检测死亡的细胞群，因为细胞-不透核酸染色可以特异性检测死亡的细胞群。如果希望同时检测活的细胞以及死亡的细胞群，可以将核酸染色与胞内酯酶底物，透膜核酸染料，膜电位感应探针，细胞器探针或者其它的透膜指示物结合检测活的细胞群。例如，Invitrogen(Carlsbad，CA)提供了只渗透具有平衡质膜的细胞的不同的SYTOXTM核酸染剂。溴化乙锭以及碘化丙锭还可以用来检测死亡的或者正在死亡的细胞。这些染剂是高亲合性核酸染剂，可以通过任何-吸光度读数器进行检测。
例如，消解可以基于对从破裂细胞释放到上清液的细胞液的乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定。为了检测细胞培养上清液中LDH的存在，可以添加底物混合物，由此LDH将通过偶联的酶促反应将四唑鎓盐INT还原至三苯基甲脂。可以通过光学吸光度读数器检测三苯基甲脂染料。或者，使用甲硫酸吩嗪(PMS)作为电子耦合试剂的MTS分析[3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-5(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，内盐]也可用来检测细胞毒性。Promega(Madison，WI)提供CellTiter 96；AQueous一种溶液细胞增殖分析试剂盒，其中将溶液试剂直接添加至温育孔，温育1-4小时然后在490nm记录吸光度。由490nm吸光度的量测定的三苯基甲脂产物的量与温育中活细胞的数目成正比。
有大量用于读取吸光度的高通量装置。例如，SpectraMax Plus 384Absorbance Platereader(Molecular Devices)以1nm的增量可以检测190-1000nm的波长。该装置可以在5秒中读取96-孔微板，在16秒中可以读取384-孔板，用于超快的试样处理量。
还可以分析病毒复制作为成功感染的的指标，并且这种检测方法可被用于高通量的方式。例如，实时RT-PCR法可用于检测细胞培养上清液中病毒转录本的存在。在将病毒RNA逆转录成cDNA后，可以通过借助于双链DNA-结合染料的PCR扩增以及检测cDNA(例如，SYBRGreen，Qiagen GmbH，德国)。然后可以使用荧光计直接测定PCR产物的量。
温育来自显示细胞病变效应的孔的病毒并更进一步地在体外(肿瘤以及正常细胞系的再试验)以及体内模型(试验病毒是否可以杀伤小鼠的移植的肿瘤)中试验。
抗体本发明还涉及特异性结合本发明的病毒，包括病毒的蛋白的抗体。本发明的抗体包括天然存在的以及非天然存在的抗体，包括，例如单链抗体，嵌合抗体，双功能抗体以及人源化抗体，及其抗原结合片段。这种非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建，可以重组产生或者例如通过筛选由可变重链以及可变轻链组成的组合文库获得(Huse等人，Science 2461275-1281，1989)。这些及其它制备例如，嵌合，人源化，CDR-移植的，单链，以及双功能抗体的方法是本领域技术人员已知的(Winter and Harris，Immunol.Todav 14243-246，1993；Ward etal.，Nature 341544-546，1989；Harlow and Lane，AntibodiesAlaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)；Hilyardet al.，Protein EngineeringA practical approach，IRL Press 1992；Borrabeck，Antibody Engineering，2d ed.，Oxford University Press 1995)。发明的抗体包括完整的分子以及片段，诸如能够结合本发明多肽存在的表位决定簇的Fab，F(ab′)2，以及Fv。
本发明的SVV多肽的肽部分(即，SEQ ID NO2的任何肽片段)或者本发明用作抗体产生的免疫原的另一病毒多肽的肽部分是非免疫原性的，可以通过将半抗原与诸如牛血清白蛋白(BSA)或者钥孔血蓝素(KLH)的载体分子偶联或者通过表达作为融合蛋白的肽部分产生免疫原性。多种其它的载体分子以及用于将半抗原与载体分子偶联的方法是本领域公知的(例如，Harlow and Lane，supra，1988)。用于产生兔，山羊，小鼠或者其它哺乳动物的多克隆抗体的方法是本领域公知的(参见，例如，Green等人，“Production of Polyclonal Antisera”，inImmunochemical Protocols，Manson，ed.，Humana Press 1992，1-5页；Coligan等人，“Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Miceand Hamsters，”，Curr.Protocols Immunol.(1992)，2.4.1部分)。
还可以使用本领域公知的方法获得单克隆抗体(Kohler andMilstein，Nature 256495，1975；Coligan et al.，supra，1992，sections 2.5.1-2.6.7；Harlow and Lane，supra，1988)。例如，来自用病毒，病毒多肽或者其片段免疫的小鼠的脾细胞可以融合合适的骨髓瘤细胞系产生杂交瘤细胞。可以使用例如标记的SVV多肽筛选克隆的杂交瘤细胞系鉴定分泌具有合适的特异性的单克隆抗体的克隆，以及可以分离以及使用表达具有所希望的特异性以及亲合性的抗体的杂交瘤作为抗体的连续来源。例如可以类似地从免疫动物血清分离多克隆抗体。除了用于进行本发明的方法，这种抗体还可用于例如制备标准化试剂盒。例如表达单链抗体的重组噬菌体还提供了可用来制备标准化试剂盒的抗体。例如可以从杂交瘤培养物通过多种沿用已久的技术分离以及纯化单克隆抗体，所述技术包括例如用Protein-A琼脂糖凝胶，筛析色谱法以及离子交换色谱法进行亲和层析(Barnes等人，in Meth.Mol.Biol.1079-104，Humana Press 1992)；Coligan等，上述，1992，参见2.7.1-2.7.12部分以及2.9.1-2.9.3部分)。
可以通过特定抗体的蛋白水解或者通过DNA编码片段的表达制备抗体的抗原结合片段。可以通过常规方法的全抗体的胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化获得抗体片段。例如，可以通过用胃蛋白酶酶解抗体提供表示为F(ab′)2的5S片段产生抗体片段。这种片段可以使用硫醇还原剂，以及任选的源于二硫键裂解的巯基的保护基的更进一步切割产生3.5S的Fab的单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶解直接产生2个单价的Fab′片段以及一个Fc片段(参见，例如，Goldenberg，U.S.Pat.Nos.4，036，945以及4，331，647；Nisonhoff等人，Arch.Biochem.Biophys.89230.1960；Porter，Biochem.J.73119，1959；Edelman et al.，Meth.Enzymol.，1422(Academic Press 1967)；Coligan等人，上述，1992，参见2.8.1-2.8.10和2.10.1-2.10.4部分)。
抗体的抗原结合片段的另一实例是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽可以通过构建编码目的抗体的CDR的多核苷酸获得。这种多核苷酸可以例如使用聚合酶链式反应制备从而合成由从产生抗体的细胞获得的RNA编码的可变区(例如，Larrick等，MethodsACompanion to Methods in Enzymology 2106，1991)。
本发明的抗体可适用于例如，可用于液相中或者与固相载体结合的免疫分析中。此外，这些免疫分析中的抗体可以多种方式可检测性的标记。可以利用本发明的抗体进行免疫分析的实例是直接或者间接形式的竞争性以及非竞争性免疫分析。这种免疫分析的实例是放射免疫分析(RIA)以及三明治(免疫测量)分析。使用本发明的抗体检测抗原可以利用以正向，逆向或者同时的方式进行的免疫分析进行，包括在生理样品上的免疫组织化学分析。本领域技术人员已知或者可以不用过度的试验很容易地意识到其它的免疫分析形式。
本领域技术人员已知多种不同的标记以及标记抗体的方法。可被用于本发明的标记类型的实例包括酶，放射性同位素，荧光化合物，胶态金，化学发光化合物，磷光化合物以及生物发光化合物。本领域技术人员可以知道其它用于结合抗体或者抗原的适合的标记，或者利用常规试验能够确定这种标记。
可对上述方法以及组合物进行多种改变，只要不背离上述的本发明的范围以及精神，应该认识到上述说明书中所含的，附图中显示的或者附属权利要求限定的主题是说明性的，而非限制性的。
实施例下列实施例用来举例说明本发明，并且本发明并不限于实施例。
实例1病毒的扩增以及纯化在PER.C6细胞中温育SVVSVV经噬斑纯化一次并在PER.C6细胞中挑选以及扩增充分分离的噬斑(Fallaux等人，1998)。来自SVV感染的PER.C6细胞的粗病毒裂解物(CVL)可由3循环的冷冻和解冻产生并用于感染PER.C6细胞。将PER.C6细胞使用包含10％胎牛血清(Biowhitaker，Walkersvile，MD，USA)以及10mM氯化镁(Sigma，St Louis，MO，USA)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)在50×150cm2的T.C瓶中进行温育。感染后30小时当观察到完全的CPE时收获受感染细胞并在1500rpm，4℃离心10分钟进行收集。将细胞沉淀再悬浮在细胞培养上清液中(30ml)并进行3个循环的冷冻以及解冻。在1500rpm，4℃离心10分钟澄清所产生的CVL。经2轮CsCl梯度纯化SVV一步梯度离心(CsCl的密度为1.24g/ml以及1.4g/ml)，继之以一次连续梯度离心(CsCl的密度为1.33g/ml)。由分光光度计确定纯化病毒的浓度，假定1A260＝9.5×1012个粒子(Scraba D.G.，以及Palmenberg，A.C.1999.Cardioviruses Picornaviridae)。InEncyclopedia of Virology.第二版，R.G.Webster and A Granoff Eds)。纯化病毒的滴度也使用PER.C6细胞通过标准的噬斑法确定。PER.C6细胞的SVV的产量大于每细胞200,000个粒子，粒子与PFU的比率为约100。其它允许细胞(H446-ATCC#HTB-171)的SVV的产量可能至少这样高或者更高。
实例2电子显微镜检查使用直接的施用法将SVV安放在聚醋酸甲基乙烯酯碳包被的网格上，用乙酸双氧铀染色并经透射电子显微镜检测。以高倍放大拍摄病毒的代表性显微照片。对于透射电子显微镜，从包埋块切割超薄型的SVV-感染的PER.C6细胞切片，并经透射电子显微镜检验所产生的切片。
纯化的SVV粒子是球状的并且直径约为27nm，在网格上呈单个或者少量聚集。SVV的代表性图像显示在图2中。在一些地方，还可见破裂的病毒粒子以及染料可以穿透的空衣壳。感染的PER.C6细胞的超微结构的研究显现出细胞质中的晶状包涵体。SVV感染的PER.C6细胞的代表性图像显示在图3中。病毒感染细胞显示几个大泡囊体(空泡)。
实例3SVV的核酸分离RNA分离使用硫氰酸胍以及使用Trizol(Invitrogen)的苯酚提取法提取SVV基因组RNA。根据厂商的说明书进行分离。简要地，将250μl的纯化的SVV与3体积的TRIZOL以及240μl的氯仿混合。用600μl异丙醇沉淀包含RNA的水相。用70％乙醇洗涤RNA沉淀两次，干燥并溶于DEPC-处理过的水中。由260nm的光密度测量估计提取的RNA的量。经由1.25％变性琼脂糖凝胶(Cambrex Bio SciencesRockland Inc.，Rockland，ME USA)溶解等分试样的RNA并由溴化乙锭染色观察并对条带拍摄(图4)。
cDNA合成由RT-PCR合成SVV基因组的cDNA。在标准条件下使用1μg的RNA，AMV逆转录酶，以及随机的14-聚体的寡核苷酸或者寡-dT进行cDNA的合成。扩增cDNA的片段，克隆到质粒中，并对克隆测序。
实施例4SVV序列分析
分析SVV SEQ ID NO1的核苷酸序列确定其与其它病毒的进化关系。该ORF的翻译产物(SEQ ID NO2)是微小RNA病毒类的并且从VP2的中间达到3D聚合酶末端的终止密码子并且是1890个氨基酸长(图5A-5E以及7A-7B)。紧接ORF的3′非翻译区(UTR)，核苷酸5671-5734是64个核苷酸(nt)长，包括终止密码子并排除了提供了18个残基的聚腺苷酸尾部(图5E)。
SVV的3个部分基因组片段的初步比较(未显示)显示SVV是心脏病毒(微小RNA病毒科)最密切相关的成员。因此构建了SVV、脑心肌炎病毒(EMCV；脑心肌炎病毒种)、Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒(TMEV；Theilovirus种)、Vilyuisk人脑脊髓炎病毒(VHEV；Theilovirus种)以及大鼠TMEV类介质(TLV；Theilovirus种)的多蛋白序列(图28)的比对。由此，SVV多蛋白加工与心脏病毒属的最接近的相关成员多蛋白加工进行比较。个体多肽之间的切割位点在图28中通过“/”符号来区别。
在微小RNA病毒中，大多数多蛋白裂解是通过一或多种病毒-编码的蛋白酶进行的，尽管在心脏-，aphtho-，erbo-和teschoviruses中P1-2A和2B之间的裂解是通过未充分了解与2A序列本身相关并且精密地包括序列“NPG/P”的顺式-作用机制来进行的，其中“/”表示2A和2B多肽之间的断裂(Donnelly等，1997，J.Gen.Virol.7813-21)。副肠孤病毒，Ljungan病毒中的一种，具有存在于典型的副肠孤病毒2A上游的序列(NPGP)并且是其它的2A或是P1衣壳区域的C-末端。在所有目前确认的微小RNA病毒属中，3Cpro具有除顺式-作用自我裂解反应外几乎所有的作用(即2A在其肠-和鼻病毒的N-末端裂解且L在口蹄疫病毒和erboviruses的C-末端裂解)。衣壳多肽VPO裂解为VP4和VP2后装配不通过3Cpro进行，但是通过一种其可能涉及病毒RNAde未知机制进行。VPO裂解在副肠孤病毒和kobuviruses中没有出现。正常的心脏病毒3Cpro切割位点在-1位置具有谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)并且在+1位置具有甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，腺嘌呤(A)或天冬酰胺(N)(表2)。SVV多蛋白的裂解遵照此模式，除了VP3/VP1位点其是组氨酸(H)/丝氨酸(S)(表2)；然而，在马鼻炎A病毒(ERAV；口疮病毒属)至少一个毒株中，H/S可能存在3A和3BVPg之间的切割位点(Wutz等，1996，J.Gen.Virol.771719-1730)。
表2.SVV和心脏病毒的切割位点

*2A和2B之间的断裂不是裂解作用。
SVV的初级裂解(P1/P2和P2/P3)这些初级裂解作用被预测在心脏-，aphtho-，erbo-和teschoviruses中以类似的方式发生，包括通过涉及序列NPG/P的新机制以及通过2BC和P3之间3Cpro的传统的裂解作用将P1-2A与2B分离(表2)。
P1裂解通过用EMCV和TMEV的序列比对，SVV P1编码衣壳的区内的裂解是相对容易预测的(表2)。
P2裂解2C蛋白与RNA合成有关。SVV的2C多肽含有存在于推断的螺旋酶和所有微小RNA病毒2Cs中的NTP-结合基序GxxGxGKS/T(功能域A)和hyhyhyxxD(其中hy是疏水性残基；功能域B)(图29)。
P3裂解P3切割位点的预测同样也是相对简单的。关于3A多肽的功能了解很少。然而，所有微小RNA病毒3A蛋白含有推断的跨膜α-螺旋。SVV和心脏病毒之间蛋白初级序列的同一性是很低的(参见图28的位置1612至1701之间)。
基因组-连接的多肽，VPg，其由3B区域编码，其与其它心脏病毒共有很少的氨基酸，然而，第三个残基是酪氨酸，此与其连接病毒基因组的5′端相符合。(Rothberg等，1978)。参见图28位点1703和1724之间。
目前已经确定四个微小RNA病毒3C半胱氨酸蛋白酶的三维结构并且鉴定了活性位点残基(HAV，Allaire等，1994，Nature，36972-76；Bergmann等，1997，J.Virol.，712436-2448；PV-1，Mosimann等，1997，J.Mol.Biol.，2731032-1047；HRV-14，Matthews等.，1994，Cell，77761-771；以及HRV-2，Matthews等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9611000-11007)。图29中粗体表示的半胱氨酸为亲核物质，而第一个粗体组氨酸为常规碱基并且对于谷氨酰胺残基的特异性主要通过第二个粗体组氨酸显示；所有的三个残基在SVV序列中(图29)且其它已知的微小RNA病毒(图28；3C序列比较参见1726和1946之间的位点)是保守的。
3D多肽是RNA依赖的RNA聚合酶的主要组分且SVV含有在细小核糖核酸-类病毒RNA-依赖的RNA聚合酶中保守的基序即KDEL/IR，PSG，YGDD和FLKR(图3；图28的1948和2410之间的位点)。
P1N-末端的十四酰化在大多数微小RNA病毒中P1前体多肽通过酰胺键将其N-末端甘氨酸残基共价结合(当存在N-末端甲硫氨酸时被除去)于肉豆蔻酸的分子(Chow等，1987，Nature，327482-486)。因而裂解产物含有P1N-末端的VP0和VP4也被十四烷基化。通过识别从甘氨酸开始的八氨基酸信号的十四酰转移酶进行十四酰化。在微小RNA病毒中，已经鉴定了五个残基共有序列基序，G-x-x-x-T/S(Palmenberg，1989，In Molecular Aspects of Picornavirus Infection andDetection，pp.211-241，Ed.Semler&Ehrenfeld，Washington D.C.，Amer.Soc.for Micro.)。没有VP0的成熟裂解的副肠孤病毒(人副肠孤病毒和Ljungan病毒)显然不被十四烷基化，然而，似乎某些类型的分子阻断了这些病毒的VP0的N-末端。
个体SVV多肽与公众序列数据库的比较利用位于欧洲生物信息学学会(EBI；http//www.ebi.ac.uk/)的FASTA在线程序将每一SVV多肽(SEQ ID NOs4，6，8，10，12，14，16，18，20和22)与公众蛋白序列数据库进行比较。这些比较的结果(最佳匹配)显示于表3。衣壳多肽(VP2，VP3和VP1)与2C，3Cpro和3Dpol一起作为一个整体，与心病毒属最紧密相关，然而，短的预测的2A序列与Ljungan病毒(副肠孤病毒属)的较接近。SVV 2A核苷酸序列与类似序列的更具体的比较显示于图28中(参见图70的2A类NPG/P蛋白比较)。
表3.Seneca Valley病毒的个体预测多肽的数据库匹配

*光合的、厌氧的、绿色-硫细菌2-磷酸甘油酯脱水酶2)(2-磷酸-D-甘油酸酯水裂解酶2SVV 2B与溶脲脲原体多重条带抗原或3A与Chlorobium tepiduna烯醇化酶2的匹配的显著性不明确，然而，这些关系也许值得进行进一步的研究。
SVV多肽与其它微小RNA病毒的系统发生比较可与心病毒属(VP2，VP3，VP1，2C，3C和3D)比对的SVV多肽与每一微小RNA病毒种的相同蛋白的典型成员相比较(表4)。将程序BioEdit v5.0.9(Hall，1999，Nucl.Acids.Symp.Ser.，4195-98)和Clustal X vl.83(Thompson等，1997，Nucl.Acids Res.，254876-4882)用于进行比对以及根据Saitou和Nei的算法(Satiou和Nei，1987，Mol.Biol.Evol.，4406-425)用于构建距离矩阵和迁离的相邻-连接树。通过引导程序再取样读取分支上的置信限度(1000个假复制子)。利用TreeView 1.6.6(Page，1996)绘制系统发生树(图31至37)。距离矩阵用于构建多重取代校正的值所使用的系统树，而图38-44表明了实际的氨基酸同一性百分比。表4表明了微小RNA病毒的目前的分类以及在这些比较中使用的代表性病毒序列。
表4.用于与SVV比较的微小RNA病毒的系统分类

*目前的分类学将SV2和PEV-8分在肠道病毒属，然而，其已经表明它们可能被分在新属中(Krumbholz等，2002；Oberste等，2003)。
个体衣壳蛋白(图31至33)的系统发生树并不全表示当将所有的发生树的多肽的数据组合时(图34)产生的树。这可能是因为难以对衣壳多肽进行比对，尤其是不是全长时，和VP2的情况一样(图31)。然而，P1，2C，3CPro以及3DPol发生树都同意并显示SVV与EMCV和TMEV簇集。
作为心脏病毒成员的Seneca Valley病毒显而易见SVV的3Dpol与心脏病毒相关，几乎与EMCV和TMEV彼此接近(图37；图44)。在通常被认为是在微小RNA病毒相对保守的其它多肽，2C和3C中，SVV也与心脏病毒最密切相关，虽然它并不向EMCV和TMEV彼此那样的与EMCV和TMEV相关(分别图42和图43)。在外部的衣壳蛋白(作为一个整体来看)中，SVV也与心脏病毒最相关并与2个口蹄疫病毒种，口蹄疫病毒和马鼻病毒A具有几乎相同的关系(约33％)。SVV与心脏病毒在2B和3A多肽方面大大偏离并且与任何已知的微小RNA病毒没有可检测的关系。
然而，不是没有前例；禽脑脊髓炎病毒与甲型肝炎病毒(HAV)在2A，2B和3A方面相当不同(Marvil等人，1999，J.Gen.Virol.，80653-662)但是被暂时地与HAV一起分类在肝病毒属内。
如果EMCV和TMEV作为标准的话，Seneca Valley病毒显而易见不是典型的心脏病毒。然而，这2种病毒甚至也具有差异，值得注意的是在5’UTR(Pevear等人，1987，J.Virol.，611507-1516)。然而，在很多蛋白(P1，2C，3Cpro和3Dpol区域)方面SVV与EMCV和TMEV系统性簇集。最终，SVV在微小RNA病毒内的分类位置可能由国际病毒分类委员会(ICTV)的执行委员会(EC)，根据微小RNA病毒研究组和公布的证明材料的推荐决定。有两个选择i)将SVV纳入在心脏病毒属中作为新种；或者ii)将SVV指定为新属。暂时为了本发明的目的，SVV被分在心脏病毒属中。
实施例4SVV衣壳蛋白的SDS-PAGE和N-末端序列分析将纯化的SVV使用NuPAGE预成形的Tris聚丙烯酰胺小凝胶电泳系统(Novex，San Diego，Ca，美国)进行电泳。通过银染观测一半凝胶，而另一个半用来制备对衣壳蛋白N-末端氨基酸进行测序的样品。在转移蛋白至膜之前，凝胶浸泡在10mM CAPS缓冲液中，pH11，1小时，并且在甲醇中润湿PVDF膜(Amersham)。将蛋白转至PVDF膜上。转移后，通过酰胺黑染色约1分钟来观察蛋白，并且用解剖刀切下目的条带并风干。可通过Edman降解法利用脉冲相位测序仪对N-末端自动测定蛋白的序列。
纯化的SVV的三个主要的结构蛋白显示于图45(约36kDa，31kDa，和27kDa)中。
实施例5分析人血清样品中的SVV的中和抗体特定病毒载体的先前存在抗体可以限制这种载体在例如治疗转移性癌症的系统递送施用的应用，因为先前存在抗体可以结合系统递送的载体并在载体有机会转导靶组织或者器官之前将它们中和。因此，希望保证人不携带选择用于系统递送的病毒载体的中和抗体。为了确定人血清样品是否包含SVV-特异性中和抗体，使用随机收集的人血清样品进行中和分析。
组织培养半感染剂量实验之前一天，将包含1×104个细胞的180μl的PER.C6细胞悬液铺板在96-孔组织培养皿中。在对数步骤将SVV的粗病毒裂解物(CVL)从10-0到10-11稀释在DMEM培养基中(Dulbecco修饰的Eagle′s Medium)，并将20μl每一稀释物转入包含PER.C6细胞的Falcon 96-孔组织培养板的3个孔。在37℃，5％CO2中温育平板并在第3天观察细胞病变效应(CPE)的显微镜证据的，并计算组织培养半感染剂量(TCID50)。
中和分析首先将40μl的培养基置于所有的孔中，然后向第一孔添加40μl加热灭活血清并由吸量管混合，制成用于筛选目的的1∶4的稀释物。然后将40μl转入下一孔进行血清样品的两倍稀释。将包含100TCID50的40μl的SVV病毒添加给包含稀释的血清样品的孔。在37℃温育平板1小时。取40μl的混合物并转入包含PER.C6细胞(1×104个细胞/160μl/孔)的平板中。在37℃温育平板3天。此后次，显微镜下读取培养物的CPE。
如上所述在进行代表性中和分析中，检验随机从美国，欧洲以及日本收集的二十二份人血清样品的SVV特异性中和抗体。连续稀释血清样品并与定量的包含100TCID50的SVV混合。然后将血清-病毒混合物用于感染PER.C6细胞并温育24小时。中和抗体滴度确定为能阻断CPE形成的血清的最高稀释度的倒数。在本实验中，阻断CPE形成的血清的稀释度没有显示人血清样品不包含SVV中和抗体。
PER.C6的更进一步SVV感染没有受到与人血液温育的抑制(参见实施例6)，显示SVV感染不受补体或血细胞凝集的抑制。结果，SVV显示出比其它的肿瘤消解病毒更长的体内循环时间，其是使用肿瘤消解腺病毒的显著问题。
实施例6SVV与人红细胞的结合和血细胞凝集多种病毒血清型已经显示引起分离自多种动物血液的红细胞的体外血细胞凝集。血细胞凝集或者与红细胞结合可能引起体内毒性并也可能影响病毒载体的体内分布和效力。因此，希望分析选择用于系统施用治疗转移性癌症的病毒载体的红细胞凝集特性。
血细胞凝集分析为了确定SVV是否引起人红细胞的凝集，在U型底96-孔板中进行血细胞凝集分析。在25μl PBS(磷酸盐缓冲盐水)中连续稀释纯化的SVV，一式两份，并向每一孔添加等体积的1％红细胞悬浮液。用肝素作为抗凝血剂从健康的个体获得被用来分离红细胞的血样。通过在冷PBS中洗涤血液3次除去血浆以及白血球制备红细胞。最后洗涤后，将红细胞悬浮在PBS中制备1％(V/V)的细胞悬液。温和地混合病毒以及红细胞并在室温下温育平板1小时并监控血细胞凝集方式。
全血灭活分析为了排除SVV被血液组分的直接灭活，在室温下分离血浆之前将等分试样的病毒用属于A，B，AB和O血型的肝素化人血液或者PBS温育等分试样的病毒，之后感染PER.C6细胞并计算滴度。
在如上所述进行的代表性分析中，在SVV的任何试验的稀释度没有看见不同血型(A，B，AB和O)的人红细胞的血细胞凝集。当SVV与人血液样品混合并温育30分钟和1小时观测到病毒滴度的少量增加，显示病毒没有被血液组分灭活但是在试验条件下更具感染性。
实施例7体内清除血循环时间为了确定病毒在肿瘤中的血循环时间和量，用SVV在1×1012vp/kg由尾部静脉注射处理具有H446肿瘤的裸鼠。在注射后0，1，3，6，24，48，72小时和7天(189小时)对小鼠取血并在聚集之后立即将血浆与血液分离，稀释在感染培养基中并用于感染PER.C6细胞。在注射后6，24，48，72小时以及7天处死注射的小鼠并收集肿瘤。将肿瘤切成小切片并悬浮在1ml的培养基中，并进行3个循环的冷冻以及解冻从受感染的细胞释放病毒。连续的对数稀释上清液并分析PER.C6细胞上的滴度。SVV滴度表示为pfu/ml。肿瘤切片也进行H&E染色以及免疫组织化学分析来检测肿瘤中的病毒衣壳蛋白。
基于7.3％的小鼠体重为血液的假设确定血液中病毒粒子的循环水平。在基本上如上所述进行的代表性分析中，病毒施用6小时内，SVV的循环水平降低为0个粒子并且在随后的时间点没有检测到SVV(图46A)。在肿瘤中，注射后6小时可检测到SVV，之后病毒的量以2倍对数稳定地增加(图46B)。只在注射后7天才在肿瘤中检测到病毒(图46B)。进行免疫组织化学染色的肿瘤切片显示了肿瘤细胞中的SVV蛋白(图47，上面)。当由H&E染色时，肿瘤切片显示几个圆形的肿瘤细胞(图47，下面)。
SVV也显示出与类似剂量i.v.的腺病毒相比在血液中显著延长的驻留时间。单次i.v.剂量后，SVV保存在血液中高达6小时(图46C；图46C是与图46D相比的图46A的重复)，而在约一个小时腺病毒被从血液清除(图46D)。
实施例8肿瘤细胞选择性SVV的体外细胞杀伤活性为了确定敏感度，从不同的来源获得人，牛，猪以及小鼠细胞，正常以及肿瘤细胞并且感染SVV。所有的细胞型被培养在培养基中并在厂商推荐的条件下培养。初级人肝细胞可以购自In Vitro Technologies(Baltimore，MD)并温育在Hepatocye培养基中(HCMTM，BioWhittaker/Clonetics公司，圣迭戈，CA)。
体外细胞病理分析为了确定哪些类型的细胞对SVV感染敏感，用纯化SVV的系列稀释感染单层增殖正常细胞和肿瘤细胞。监控细胞的CPE并与未感染的细胞相比较。感染后3天，进行MTS细胞毒性测定并计算每细胞粒子中半致死剂量百分比(LD50)值。参见以下的表5和6
表5.EC50值小于100的细胞系

表6.EC50值超过1000的细胞系

根据厂商的说明书进行MTS分析(CellTiter 96；AQueousAssay byPromega，Madison，WI)。Cell Titer 96；AQueousAssay优选地使用四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，内盐；MTS)和电子耦合试剂，甲硫酸吩嗪(PMS)。研究中评价的接触-抑制的正常人细胞包括HUVEC(人脐静脉内皮细胞)，HAEC(人主动脉内皮细胞，Clonetics/BioWhittaker#CC-2535)，Wi38(正常人胚胎肺成纤维细胞，ATCC#CCL-75)，IMR90(人正常肺成纤维细胞，ATCC CCL-186)，MRC-5(人正常肺成纤维细胞，ATCC#CCL-171)和HRCE(人肾皮层上皮细胞，Clonetics/BioWhittaker#CC-2554)。
SVV在任意上述接触-抑制的正常细胞中不产生CPE。在下列人肿瘤细胞系中没有观察到病毒-诱导的CPEHep3B(ATCC#HB-8064)，HepG2(人肝细胞癌，ATCC#HB-8065)，LNCaP(人前列腺癌，ATCC#CRL-10995)，PC3M-2AC6，SW620(人结肠直肠腺癌，ATCC#CCL-227)，SW 839(人结肠直肠腺癌，ATCC#HTB-49)，5637(人膀胱癌，ATCC#HTB-9)，DMS-114(小细胞肺癌，ATCC#CRL-2066)，DMS153(人小细胞肺癌，ATCC#CRL-2064)，A549(人肺癌，ATCC#CCL-185)，HeLa S3(人子宫颈癌，ATCC#CCL-2.2)，NCI-H460(人大细胞肺癌，ATCC#HTB-177)，KK(成胶质细胞瘤)以及U-118MG(人成胶质细胞瘤，ATCC#HTB-15)。注意-表6中具有EC50值大于1000的细胞系很可能不允许SVV复制和/或病毒粒子产生；尽管可能性依然是SVV可结合和进入这些细胞但是没有观察到CPE因为SVV复制不能在细胞内部出现或复制不发生但是没有观察到CPE，因为有某些其它的进入后阻断(即，没有复制的SVV基因组包装到病毒粒子中)。然而，考虑到CPE在这些细胞系中的缺乏，这些细胞-系，及其潜在的肿瘤型，是试验细胞和肿瘤型是SVV复制允许或不允许的良好的候选物。尽管野生型SVV是肿瘤-特异性的，且已显示靶向神经内分泌肿瘤，包括小细胞肺癌和成神经细胞瘤，可能存在单独的病人其具有多种类型的病因使得SVV不允许为其神经内分泌肿瘤的形式。因此本发明预期可杀死由其中肿瘤不是野生型SVV的个别病人分离的肿瘤细胞类型的SVV衍生物的产生，且由此个体分离的肿瘤型可包括，例如，成胶质细胞瘤，淋巴瘤，小细胞肺癌，大细胞肺癌，黑色素瘤，前列腺癌，肝癌，结肠癌，肾癌，结肠癌，膀胱癌，直肠癌和鳞状上皮细胞肺癌。
通过LDH释放分析(CytoTox96非放射性的细胞毒性分析，Promega，#G1780)测定SVV-介导的对初级人肝细胞(InVitroTechnologies)的细胞毒性。用以1，10和100和1000个粒子每细胞(ppc)的SVV感染在骨胶原包被的12-孔板中铺板的初级人肝细胞。感染3小时后，将感染培养基替换为2ml的生长培养基并在CO2恒温箱中温育3天。分别测定温育上清液中的细胞相关的乳酸脱氢酶(LDH)和LDH。测定细胞毒性百分比作为上清液中的LDH单位与最大的细胞LDH加上清液LDH的比。
图48中的数据说明在所有试验的多重感染中缺乏SVV介导的肝脏毒性。
实施例10病毒产生分析为评价SVV的复制能力，用SVV以每细胞一个病毒粒子(ppc)感染若干选择的接触-抑制的正常细胞和积极分裂的肿瘤细胞。72小时后，将细胞和培养基用于三个冻融循环并离心来收集上清液。制备上清液的系列对数稀释并分析PER.C6细胞的滴度。对每一细胞系而言，SVV复制的效率表示为pfu/ml(图49)。
实施例10毒性最大耐受剂量(MTD)定义为动物(例如小鼠)用SVV治疗后表现出紧接剂量限制毒性(DLT)之前的剂量。DLT定义为动物在研究的全部期间由于施用SVV显示出体重减少，病症和死亡率的剂量。在基线，第15天和第21天评价SVV的中和抗体。如早先描述的进行中和分析。
将逐步升高剂量(1×108-1×1014vp/kg)的SVV静脉内施用于购自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN，USA)的免疫缺陷和CD-1远系繁殖的免疫活性小鼠来测定每一剂量水平10个小鼠的MTD。病毒在所有试验的剂量水平较好的耐受，没有显示出任何临床症状且没有体重减少(图50)。在第15天和第21天对小鼠取血并在中和试验中监控血清的SVV-特异性中和抗体的存在。SVV注射的CD1小鼠产生中和抗体且滴度从1/1024到大于1/4096的范围。
对免疫活性的小鼠株(A/J)进行另一毒性研究。已经证明SVV显示出细胞杀死活性且在N1E-115细胞中复制(参见表1)。鼠细胞系N1E-115(成神经细胞瘤细胞系，即，神经内分泌癌)获自A/J小鼠株。因此，建立同基因的小鼠模型，其中在A/J小鼠中皮下植入N1E-115细胞来形成肿瘤，且用SVV处理小鼠来研究其效力和毒性。
在A/J研究中，小鼠i.v注射SVV来测定A/J小鼠是否可耐受系统性施用的SVV。获得血液结果学结果来寻找毒性的信号，且还可以获得血清化学作用的结果。研究设计显示于下表7中表7A/J研究设计

A/J小鼠为获自Jackson实验室(Bar Harbor，Maine)的8-10周龄的雌性小鼠。在-80℃储存分离的病毒粒子直至使用，备用SVV。在冰上解冻新近制备SVV并用HBSS稀释(Hank′s平衡盐溶液)。对于组2将SVV稀释到107粒子/mL的浓度，对于组3为1010粒子/mL，对于组4为1013粒子/mL。HBSS用作组1的介质对照。所有剂量给药的溶液维持在润湿的冰上直至用于配制。
通过尾部静脉将SVV以10mL/kg体重的剂量体积静脉注射施用于动物。在给药当天对动物进行称重并根据体重调整剂量体积(即，0.0200kg小鼠使用0.200mL的剂量给药溶液)。每天两次监控小鼠的发病率和死亡率。每周称重小鼠两次。立即记录垂死动物和显示出任意异常病症(身体上或行为上)的动物的信息。
完成的观察和测定需要在处死时收集所有存活动物的血液用于标准的血液学和血清化学作用(AST，ALT，BUN，CK，LDH)。在处死时收集下列器官脑，心脏，肺，肾，肝和生殖腺。将每一器官样品的一半在干冰上快速冷冻且将另一半置于福尔马林中。
SVV注射两周后获得最初的血液结果(CBC，微分)且结果概括在下表8中。将来自每一试验组的5只小鼠用于试验(参见表7)表8A/J毒性结果-血液学


这些结果表明获自用低的、中和高剂量的SVV处理的小鼠的分布图与获自未处理小鼠的血液学分布图比较没有异常。由这些研究，其可断定SVV系统性给药之后没有可检测的毒性信号，此表明SVV被i.v注射的A/J小鼠耐受。
实施例11效力在效力研究中使用购自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)的6-7周龄的无胸腺雌性裸鼠(nu/nu)。利用人工保定将5×106H446细胞皮下注射到小鼠右侧。定期测定肿瘤大小，并利用公式π/6x W x L2计算体积，其中L＝肿瘤的长度且W＝肿瘤的宽度。当肿瘤达到约100-150mm3时，将小鼠(n＝10)随机分组。将逐步升高剂量的SVV以10mL/kg体重的剂量体积尾部静脉注射施用于小鼠。用等体积的HBSS注射小鼠的对照组。剂量由每公斤体重1×107增加到1×1013粒子。通过每周两次测定SVV给药后的肿瘤体积测定抗癌效力。完全应答定义为异种移植物的完全消失；部分应答为肿瘤体积的衰退等于或大于50％；且无应答为肿瘤如在对照组中一样继续生长。
来自HBSS处理小鼠的肿瘤迅速生长且肿瘤体积在第20天达到超过2000mm3(图51；参见具有空心菱形的线)。相比之下，进行一次系统注射所有试验剂量的小鼠(除最低剂量外)在第20天变成无肿瘤的。在最低剂量组中，在第31天，有8个小鼠变成无肿瘤的，一个小鼠具有非常大的肿瘤且其它的具有小的可触知的肿瘤(25mm3)。为评价SVV对大肿瘤的抗癌活性，在第20天用单剂量的1×1011vp/kg系统性注射来自具有肿瘤＞2000mm3的HBSS组的五只小鼠。在后续检查(SVV注射后第11天)期间，发现肿瘤体积急剧减小(图51)。
图52显示了用SVV“未处理的”(即，用HBSS处理)或用SVV“处理”的小鼠照片。如可观察到的，未处理的小鼠具有非常大的肿瘤且处理的小鼠没有显示可见的肿瘤信号。此外，对于用SVV处理的未处死的小鼠，在200天的研究期间没有观察到肿瘤再生长。
SVV对于特异性肿瘤细胞系的体外效力数据显示于表1和5中。该数据表明SVV特异性感染特定的肿瘤细胞类型且不感染正常的成年细胞，优于任意其它肿瘤消解病毒的显著的优点。SVV已显示具有比化疗高1,000倍的细胞杀伤特异性(SVV的细胞杀伤特异性值已被证明大于10,000，而化疗的细胞杀伤特异性值在10左右)。
在H446人SCLC细胞中证明了SVV的特异性细胞毒性活性。用增加浓度的SVV温育两天后，测定细胞的活力。结果显示于图53中。图53显示了SVV用H446SCLC肿瘤细胞(上图)或正常人H460细胞(下图)温育后的细胞存活。SVV特异性杀死肿瘤细胞，具有约10-3粒子每细胞的EC50。相反，正常人细胞不会被任意浓度的SVV杀死。此外，如表1-3所概括的，SVV对大量的其它肿瘤细胞系也具有细胞毒性，包括SCLC-多重耐受性肿瘤细胞。对于其它肿瘤细胞系的SVV细胞毒性的EC50值为10-3到大于每细胞20,000粒子的范围。SVV对其它非-神经肿瘤和正常人组织是无细胞毒性的。另外，SVV对初级人肝细胞是无细胞毒性的，如通过LDH以每细胞释放高达1000粒子所测定的(参见图48)。
实施例12对啮齿动物进行的生物分布和药代动力学研究通过正常小鼠和具有H446 SCLC肿瘤的无免疫应答无胸腺裸鼠进行SVV的药代动力学和生物分布研究。此研究评价了单一静脉注射给药后，正常和无免疫应答的有肿瘤小鼠的SVV的生物分布，消除和保留时间。小鼠组各接受单i.v剂量的对照缓冲液或三个剂量(108，1010或1012vp/kg)的SVV之一且监控临床指标。给药1，6，24和48小时后以及给药后第1，2，4，和12周由5个小鼠的组获取血样。剂量水平包括已知低有效剂量和两个高剂量水平来测定病毒消除的线性关系。给药后24小时和2，4和12周处死小鼠组。选择的组织，包括肝，心脏，肺，脾脏，肾，淋巴结，骨髓，大脑和脊髓组织被无菌收集并利用有效的RT-PCR试验用于检验SVV RNA的存在。
在处死时，给药后24小时和第2，4以及12周获得尿液和粪便的样品并检查感染性病毒的存在。此实施例中的实验设计显示于下表9中
表9CD-1小鼠和具有SCLC肿瘤的无胸腺裸鼠的SVV的生物学分布

通过正常小鼠和具有H446SCLC肿瘤的无免疫应答无胸腺裸鼠进行急性的i.v.毒理学研究。对正常和SCLC肿瘤小鼠进行的初步i.v.研究表明SVV剂量的安全性高达1014vp/kg。没有观察不利的临床指标且单一i.v.剂量的1014vp/kg后直至2周没有体重减轻。
实施例13对正常成年和怀孕小鼠进行的病毒扩散研究此实施例的目的是测定在未感染的正常小鼠与用高浓度SVV注射的小鼠共处之后SVV是否感染小鼠。因为SVV在正常的，无肿瘤小鼠中不复制，肿瘤小鼠还可以用高浓度SVV注射且随后暴露于正常的，健康的动物来较好的模拟临床方案。第二个目的是评价SVV由感染的雌性感染至未感染怀孕的DAM且随后感染发育的胎儿的传染可能性。
将三组五只天然雌雄CD-1小鼠暴露于用108，1010或1012vp/kg感染的同性单个小鼠，并且通过血样监控SVV的存在。
类似地，将暴露SVV的雌性与大量怀孕的雌性混合，并且测定病毒由感染的雌性传递给未感染的怀孕雌性，以及随后传递给发育的胎儿的能力。
实施例14非-人的灵长类动物研究同样也测定SVV在非-人灵长类中的安全性，毒性和毒物动力学。在一个剂量范围确定阶段，单个猴接受108vp/kg的单i.v.剂量的SVV并且密切监控感染或毒性的临床指标。如果这个剂量被较好的耐受，其它的动物用高i.v.剂量处理直至获得1012vp/kg的剂量。随后，主要的研究包括三个雌性和雄性猴的组，并且每只猴被每周用单独载体或三个SVV剂量之一给药一次持续六周时间并监控毒性的信号。每一性别的其它两只猴用单独载体给药以及用高剂量水平的SVV给药持续六周时间，并且允许在处死之前另外恢复4周时间。
在第1周和第6周过程中给药后获取血样。在首次给药以及在处死之前获得临床病理学和血液学血样。在每次给药之后获得另外的血样用于评价对SVV的中和抗体的存在。
对存活的猴实施安乐死，用于完全尸体解剖并由主要研究收集完全组织列表以及回收猴。评价对照和高剂量组的组织的组织病理学。在第1周和第6周给药后收集尿液和粪便样品并用于评价感染性SVV的存在。此实施例的总体设计显示于下表10中。
表10灵长类中SVV的多剂量毒理学研究

*剂量可根据剂量范围确定阶段的结果的变化而变化实施例15全长和功能性基因组SVV质粒的构建迄今为止，仅仅SVV的约1.5-2Kb的5′基因组序列被测序，代表包括5′UTR，1A(VP4)和1B(VP2)的一部分的核苷酸区域。由ATCC保藏号PTA-5343的分离SVV制备其它的SVV cDNAs。SVV粒子感染允许的细胞系，诸如PER.C6中，以及分离病毒。然后由病毒粒子回收病毒RNA使得由此制备cDNA拷贝。对单独的cDNA克隆测序，使得选择的cDNA克隆在具有SVV序列5′末端的T7启动子上游的质粒中合成为一个全长克隆。通过利用T7聚合酶和体外转录系统对由此质粒得到的全长SVV逆转录，以产生全长RNA(参见图55)。全长RNA转染到允许的细胞系中来试验全长克隆的感染性(参见图55)。
操作如下。RNA分离利用硫氰酸胍和利用Trizol(Invitrogen)的苯酚提取法提取SVV基因组RNA。简而言之，将250μl的纯化SVV与3体积Trizol和240μl氯仿混合。用600异丙醇沉淀含有RNA的水相。用70％乙醇冲洗RNA沉淀两次，干燥并溶于DEPC-处理的水中。通过在260nm测定光密度来评价提取的RNA的量。溶解等分的RNA进行1.25％变性琼脂糖凝胶(Cambrex Bio Sciences Rockland，，ME USA)电泳并通过溴化乙锭染色对条带进行观察并照相。
cDNA合成通过RT-PCR合成SVV基因组的cDNA。在标准条件下利用1μg的RNA，AMV逆转录酶以及随机14-聚体或寡-dT进行cDNA的合成。扩增cDNA片段，克隆到质粒中并对克隆进行测序。可能更广泛测定对于基因组的5′极末端的测序是必需的。
全长基因组的克隆一旦序列已知，则常规分子生物学技术能够构建T7聚合酶启动子的SVV下游的全长克隆(例如，参见图54)。
SVV的回收具有SVV全长基因组的质粒按照标准的方案逆-转录。病毒RNA(100ng)用于转染H446细胞，细胞系已知是允许用于天然SVV的，但是用于病毒RNA转染的最有效的细胞系可凭经验在各种细胞系中确定。
实施例16RGD展示SVV文库的构建为了发现用编码随机肽序列的寡核苷酸随机产生的SVV衣壳突变构建体的最佳插入位点，采用了简单的模式系统(RGD)。RGD(精氨酸，甘氨酸，天冬氨酸)是结合于整合素的短肽配体。成功的RGD-SVV衍生物应该包含下列特性(1)遗传插入不应该改变任一的SVV的独特的和理想的特性；以及(2)成功的RGD衍生物病毒应该具有对含有aVb5整联蛋白的细胞的趋性。
刚好含有邻近的衣壳区域的SVV质粒将在任意位置被单独地裂解且短模式肽序列，称为RGD，将在各位置被插入。病毒SVV-RGD文库将利用图56和57中描述的常规技术由这些质粒文库来构建。
实施cRGD寡核苷酸随机插入到衣壳区域中。简言之，构建质粒使其刚好编码SVV的邻近的2.1Kb的衣壳区域(参见图56，“pSVVcapsid”)。如下所述通过利用CviJI或核酸内切酶V法在pSVVcapsid中部分降解质粒来产生单一的随机裂解(参见图57)。分离单个的裂解质粒后，RGD寡核苷酸将被插入来产生pSVV衣壳-RGD文库。
限制性酶CviJI具有优于其它随机裂解法的若干优点诸如超声处理或剪切。首先，CviJI是钝末端剪切，不需要修复。其次，CviJI已被证明在随机位置裂解因此不会出现热点。该方法同样是简单和快速的。简而言之，CviJI的浓度和/或降解的时间是日益降低的直至大多数裂解的DNA是线性化质粒，即单一裂解的。这些可如图57描述的通过标准的琼脂糖凝胶电泳观察到。然后分离条带，纯化以及与RGD寡核苷酸连接。
可利用的随机裂解DNA的另一方法是核酸内切酶V法(Kiyazaki，K.，Nucleic Acids Res.，2002，30(24)e139)。
核酸内切酶V在尿嘧啶位点的第二或第三磷酸二酯键3′裂解含尿嘧啶的DNA。此方法同样预期随机裂解DNA，通过调整聚合酶链式反应中的dUTP浓度很容易测定其频率。尽管切割位点总是胸腺嘧啶(由尿嘧啶替换)位点下游的两个或三个碱基，此方法被预期产生比其它方法少的多热和冷点。
将随机线性化质粒与cRGD寡核苷酸连接。然后扩增生成的pSVV衣壳文库，因此可纯化具有随机插入的cRGD区域并编码衣壳区域的多核苷酸群体(参见图57和58)。然后将衣壳多核苷酸的群体亚克隆到含有全长SVV序列减去衣壳区域的载体中，由此产生全长SVV序列的文库(其中文库显示衣壳区域中的序列多样性，因为cRGD序列是随机插入的)。然后将这些文库逆转录到RNA中，且将RNA转染允许的细胞系中来产生具有不同衣壳的SVV粒子的群体(参见图59)。一旦回收到这些病毒粒子的RGD-SVV群(″RGD-SVV文库″)，将随机挑选大量的病毒(即，10或更多)来证实RGD序列的插入以及插入位点的多样性。
RGD-展示SVV文库的体外选择。筛选SVV-RGD文库来测定哪些插入位点能够扩大SVV的趋性。RGD-SVV文库被允许感染αvβ5整联蛋白-表达NSCLC系(非-小细胞肺癌细胞系，即，A549表达αvβ5)。仅仅含有功能性和正确展示RGD基序的这些SVV衍生物可感染这些细胞并复制。
通过能够液体处理的高通量自动系统(TECAN)进行体外筛选，共同温育20个细胞系并在384-孔板中进行测定(参见图62和图63)。感染30小时后当观察到完全CPE时收获细胞然后通过在4℃以1500rpm离心10分钟收集细胞。细胞沉淀然后再悬浮在细胞培养物上清液中并用于三个循环的冷冻和解冻。通过在4℃以1500rpm离心10分钟来澄清产生的悬浮液。通过两轮CsCl梯度纯化病毒一步梯度(CsCl密度1.24g/ml和1.4g/ml)然后时一个连续梯度离心(CsCl密度1.33g/ml)。分光光度滴定测定纯化的病毒浓度，假定1A260＝9.5×1012粒子(Scraba，D.G.和Palmenberg，A.C.，1999)。可重复该过程多次直至由αvβ5细胞回收到足够量的病毒。
对所回收的RGD-SVV衍生物的分析。分析少量的单独的RGD-展示SVV衍生物(约10-50个不同的衍生物)。稀释病毒混合物并扩大单个的病毒粒子用于分析。试验各衍生物来测定是否它们已经获得有效和特异性感染-表达αvβ5的细胞的能力。然后对具有这些特性的各衍生物的衣壳区域进行测序来测定RGD插入的位点。回收的eRGD-展示SVV衍生物应该具有下列特性(1)病毒的原始特性仍然是完整的；和(2)衍生物已经获得感染高水平表达结合于RGD的整联蛋白的细胞的能力。此方法目的是用RGD插入鉴定一或多个能够扩大趋性的位点，使得随机寡核苷酸可插入到这些位点来产生改变趋性的SVV衍生物。
对测序的cRGD SVV衍生物进行编号并通过它们与整联蛋白的结合能力进行排序。为测定结合活性，将重组的β2整联蛋白固定在PBS中的96-孔滴定板上，用PBS冲洗两次，用3％BSA的PBS溶液封闭，然后用独特的RGD-展示病毒温育。没有肽插入的天然病毒用作阴性对照。温育1-5小时后，用PBS冲洗孔至少三次。然后，由抗-SVV抗体检测结合于板的病毒。RGD肽或抗整联蛋白的抗体将能够与RGD-SVV衍生物和结合板的整联蛋白的结合竞争。
分析强烈结合于整联蛋白的cRGD-SVV衍生物(20)来测定cRGD寡核苷酸插入“成功的”位点。插入位点提供了对SVV趋性的观察。根据对插入位点及其它已知结构的分析，可测定放置随机肽文库的理想位点(此方法为任选的用于产生SVV衍生物的方法，其中寡核苷酸(已知序列或随机序列)被插入到衣壳中的随机位点)。按照如上所述的用于RGD-SVV文库的大体上相同的方法构建用随机序列寡核苷酸产生的SVV衍生物，除此之外，还有两个其它的新方法。为了避免在目的编码区内不必要的终止密码子和有害的氨基酸插入(例如半胱氨酸或脯氨酸)，可利用Morphosys(Munich，Germany)发展的TRIM(三核苷酸-致突变)来产生用于衣壳插入的随机寡核苷酸。TRIM利用仅仅编码目的位置氨基酸的三-核苷酸(Virnekas，B等，Nucleic Acids Res，1994，22(25)5600-5607)。具有108种多样性的随机-肽展示SVV被认为是足够的且预期产生特异性将病毒导向靶肿瘤组织的肽。如上所述体外测定随机-肽展示SVV，或利用患有肿瘤的小鼠体内测定。
权利要求
1.分离的核酸，包括与SEQ ID NOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者这些序列任一个中的至少20个核苷酸长的相邻部分具有至少95％的序列同一性的核酸序列。
2.在高严格条件下与权利要求1的核酸杂交的分离的核酸。
3.在中等严格条件下与权利要求1的核酸杂交的分离的核酸。
4.在低严格条件下与权利要求1的核酸杂交的分离的核酸。
5.载体，包括与SEQ ID Nos 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者这些序列任一个中的至少20个核苷酸长的相邻部分具有至少95％的序列同一性的核酸序列。
6.权利要求1的分离的核酸，其中核酸是RNA或者DNA。
7.分离的多肽，由与包括SEQ ID Nos 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者这些序列任一个中的至少10个核苷酸长的相邻部分的核酸序列具有至少95％的序列同一性的核酸编码。
8.分离的多肽，包括与SEQ ID Nos 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或者这些序列任一个中的至少10个氨基酸长的相邻部分具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
9.分离的抗体，其特异性结合权利要求8的多肽或者权利要求11的分离的病毒。
10.权利要求9的抗体，其中的抗体是多克隆抗体，单克隆抗体或者嵌合抗体。
11.分离的Seneca Valley病毒或者其衍生物，包括ATCC专利保藏号PTA-5343的鉴定特性。
12.分离的Seneca Valley病毒或者其衍生物或者相关物，具有包括与SEQ ID NO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列的基因组。
13.分离的Seneca Valley病毒或者其衍生物或者相关物，包括下列特性约7.5kb的单链RNA基因组；～27nm的直径；包括具有约31kDa，约36kDa以及约27kDa的分子量的至少3种蛋白的衣壳；CsCl梯度上大约1.34g/ml的浮力密度；以及在肿瘤细胞中的复制能力。
14.分离的Seneca Valley病毒或者其衍生物或者相关物，包括下列特性在肿瘤细胞中的复制能力，肿瘤-细胞趋性，以及在正常细胞中不能消解细胞。
15.权利要求12或者13的病毒，其中所述病毒在具有神经内分泌特性的肿瘤细胞类型中是有复制能力的。
16.权利要求12的病毒，其中31kDa蛋白包含与SEQ ID NO8具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的氨基酸序列。
17.权利要求12的病毒，其中36kDa蛋白包含与SEQ ID NO4具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的氨基酸序列。
18.权利要求12的病毒，其中27kDa蛋白包含与SEQ ID NO6具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的氨基酸序列。
19.药物组合物，包含有效量的权利要求11-18任一项的病毒以及药用载体。
20.细胞，包含权利要求11-18任一项的病毒。
21.病毒裂解物，包含权利要求11-18任一项的病毒的抗原。
22.分离的病毒抗原，获自权利要求11-18任一项的病毒。
23.用于治疗癌症的方法，包括施用有效量的病毒或者其衍生物，以便治疗癌症，其中病毒具有包含与SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19或者21有至少95％同一性的序列的基因组序列。
24.用于治疗癌症的方法，包括施用有效量的病毒，所述病毒具有包含与SEQ ID NO3，5或者7有至少95％同一性的序列的编码衣壳的区域。
25.用于抑制癌症发展的方法，包括将癌细胞与病毒或者其衍生物接触，其中病毒具有包含与SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19或者21有至少95％同一性的序列的基因组。
26.用于杀伤癌细胞的方法，包括将癌细胞与有效量的病毒或者其衍生物接触，其中病毒具有包含与SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19或者21有至少95％同一性的序列的基因组。
27.权利要求23，24，25或者26的方法，其中的病毒是微小RNA病毒。
28.权利要求27的方法，其中的微小RNA病毒是心脏病毒。
29.权利要求28的方法，其中心脏病毒选自vilyuisk人脑脊髓炎病毒，Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒，脑心肌炎病毒以及Seneca Valley病毒。
30.权利要求29的方法，其中脑心肌炎病毒选自如下的分离物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695，以及NC-88-23626。
31.权利要求29的方法，其中的Seneca Valley病毒的ATCC保藏号为PTA-5343。
32.纯化权利要求11-18任一项的病毒的方法，包括a.用权利要求11-18任一项的病毒感染细胞；b.收获细胞裂解物；c.将细胞裂解物进行至少一轮梯度离心；以及d.从所述梯度分离所述病毒。
33.杀伤异常增殖细胞的方法，包括将细胞与权利要求11-18任一项的病毒接触。
34.权利要求33的方法，其中异常增殖细胞是肿瘤细胞。
35.权利要求34的方法，其中的肿瘤细胞选自人小细胞肺癌，人成视网膜细胞瘤，人成神经细胞瘤，人成神经管细胞瘤，小鼠成神经细胞瘤，维耳姆斯瘤以及人非小细胞肺癌。
36.治疗受试者肿瘤病症的方法，包括给受试者施用有效量的权利要求11-18任一项的病毒。
37.权利要求36的方法，其中的肿瘤病症是神经内分泌癌症。
38.权利要求36的方法，其中的受试者为人类。
39.产生权利要求11-18任一项的病毒的方法，包括在允许病毒复制以及由细胞或者上清液回收病毒的条件下温育用权利要求11-18任一项的病毒感染的细胞。
40.权利要求39的方法，其中的细胞是PER.C6细胞。
41.权利要求39的方法，其中的细胞是H446细胞。
42.权利要求39的方法，其中的细胞产生每细胞超过200,000个病毒粒子。
43.检测权利要求11-18任一项的病毒的方法，包括从怀疑含有权利要求11-18任一项的病毒的试验材料分离RNA；标记对应于SEQ ID NO1的至少15个相邻核苷酸的RNA；用标记的RNA探测试验材料；以及检测标记的RNA与分离自试验材料的RNA的结合，由此结合显示病毒的存在。
44.核酸探针，包括对应于SEQ ID NO1的至少15个相邻核苷酸的核苷酸序列。
45.制备肿瘤消解病毒的方法，该方法包括(a)将Seneca Valley病毒基因组序列与所试验的病毒基因组序列进行比较；(b)鉴定由Seneca Valley病毒基因组序列编码的多肽与由试验的病毒基因组序列编码的多肽之间至少第一个氨基酸的差异；(c)使试验的病毒基因组序列突变，以便由试验的病毒基因组序列编码的多肽与由Seneca Valley病毒基因组序列编码的多肽具有至少一个氨基酸的差异；(d)将突变的试验病毒基因组序列转染到肿瘤细胞中；以及(e)确定肿瘤细胞是否由突变的试验病毒基因组序列消解性感染。
46.权利要求45的方法，其中Seneca Valley病毒基因组包括与SEQ ID NO1具有至少95％同一性的序列。
47.权利要求45的方法，其中的试验病毒是微小RNA病毒。
48.权利要求45的方法，其中的试验病毒是心脏病毒。
49.权利要求45的方法，其中的氨基酸差异是在Seneca Valley病毒衣壳蛋白和试验的病毒衣壳蛋白之间。
50.权利要求45的方法，其中使试验的病毒基因组序列突变包括使具有试验的病毒基因组序列的cDNA突变。
51.权利要求51的方法，其中转染突变的试验病毒基因组序列包括转染RNA，其中RNA由具有突变的试验病毒基因组序列的cDNA产生。
52.权利要求48的方法，其中心脏病毒基因组序列选自vilyuisk人脑脊髓炎脑病毒，Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒和脑心肌炎病毒。
53.权利要求52的方法，其中的心脏病毒基因组序列选自脑心肌炎病毒。
54.权利要求53的方法，其中的脑心肌炎病毒选自如下的分离物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695，以及NC-88-23626。
55.权利要求52方法，其中的心脏病毒选自其基因组包括与SEQID NO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列的分离物。
56.权利要求45方法，其中氨基酸差异是在包含如下序列的多肽的范围内与SEQ ID NO4，6，8或者这些序列任一个中的至少10个氨基酸长的相邻部分具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％的同一性的序列。
57.制备改变细胞类型趋性的突变体病毒的方法，所述方法包括(a)产生包括大量核酸序列的病毒突变体的文库；(b)将病毒突变体文库转染到允许的细胞中，由此产生大量突变体病毒；(c)分离大量的突变体病毒；(d)用分离的大量突变体病毒温育不允许的细胞；以及(e)回收在不允许的细胞中产生的突变体病毒，由此制备改变趋性的突变体病毒。
58.权利要求57的方法，其中的病毒突变体文库由包括与SEQ IDNO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列的亲本序列产生。
59.权利要求57的方法，进一步包括(f)在不允许的细胞中温育回收的突变体病毒；以及(g)回收在不允许的细胞中产生的突变体病毒。
60.权利要求59的方法，更进一步包括反复重复步骤(f)和(g)。
61.权利要求57或者59的方法，其中的温育是在多孔高通量平台中进行的，其中的平台在每一孔中包括不同类型的不允许的细胞。
62.权利要求61的方法，更进一步包括以筛选平台鉴定哪些孔含有杀伤细胞的突变体病毒。
63.权利要求62的方法，其中通过分析每一孔中的吸光度进行筛选。
64.权利要求57的方法，其中的不允许的细胞是肿瘤细胞。
65.权利要求57的方法，其中产生病毒突变体的文库包括(i)提供具有与病毒的部分基因组序列相同序列的多核苷酸；(ii)使多核苷酸突变以便产生大量的不同的突变体多核苷酸序列；以及(iii)将大量的突变的多核苷酸连接到具有除了步骤(i)所含的那部分病毒基因组序列外的病毒基因组序列的载体中，由此产生病毒突变体文库。
66.权利要求65的方法，其中病毒的基因组序列来自于微小RNA病毒。
67.权利要求65的方法，其中病毒的基因组序列包括与SEQ IDNO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列。
68.权利要求66的方法，其中的微小RNA病毒是心脏病毒。
69.权利要求68的方法，其中的心脏病毒选自vilyuisk人脑脊髓炎病毒，Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒，脑心肌炎病毒以及SVV。
70.权利要求69的方法，其中的脑心肌炎病毒选自如下的分离物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695，以及NC-88-23626。
71.权利要求57的方法，其中步骤(ii)的突变是通过将核苷酸随机插入多核苷酸中进行的。
72.权利要求57的方法，其中步骤(ii)的突变是在多核苷酸的编码衣壳的区域中进行的。
73.权利要求71的方法，其中核苷酸的随机插入是由三核苷酸-致突变(TRIM)进行的。
74.权利要求71的方法，其中至少一部分插入多核苷酸的核苷酸编码附加表位。
75.制备改变细胞类型趋性的突变体心脏病毒的方法，该方法包括(a)产生心脏病毒的突变体多核苷酸序列文库，其中该产生包括-提供编码心脏病毒衣壳区域的多核苷酸；-使多核苷酸突变以便产生大量的不同突变体编码衣壳的多核苷酸序列；以及-将大量突变的编码衣壳的多核苷酸连接到具有除了编码衣壳的区域之外的心脏病毒的基因组序列的载体中，由此产生心脏病毒的突变体多核苷酸序列文库；(b)将突变体多核苷酸序列的文库转染到允许的细胞中，由此产生大量的突变体病毒；(c)分离大量的突变体病毒；(d)用分离的大量突变体病毒温育不允许的细胞；以及(e)回收在不允许的细胞中产生的突变体病毒，由此制备改变趋性的突变体心脏病毒。
76.权利要求75的方法，更进一步包括(f)在不允许的细胞中温育回收的突变体病毒；以及(g)回收在不允许的细胞中产生的突变体病毒。
77.权利要求76的方法，更进一步包括反复重复步骤(f)和(g)。
78.权利要求75方法，其中的心脏病毒具有包括与SEQ ID NO1有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列的基因组。
79.权利要求75的方法，其中的突变是通过将核苷酸随机插入编码衣壳的多核苷酸中进行的。
80.权利要求80的方法，其中至少一部分随机插入编码衣壳的多核苷酸的核苷酸编码附加表位。
81.权利要求80的方法，其中核苷酸的随机插入是由三核苷酸-致突变(TRIM)进行的。
82.权利要求75的方法，其中大量的不同突变体编码衣壳的多核苷酸序列包括大于108个不同的编码衣壳的多核苷酸序列。
83.权利要求75的方法，大量的不同突变体编码衣壳的多核苷酸序列包括大于109个不同的编码衣壳的多核苷酸序列。
84.制备改变肿瘤细胞类型趋性的突变体Seneca Valley病毒的方法，所述方法包括(a)产生Seneca Valley病毒突变体的cDNA文库；(b)由Seneca Valley病毒突变体的cDNA文库产生Seneca Valley病毒RNA；(c)将Seneca Valley病毒RNA转染到允许的细胞中，由此产生大量突变体Seneca Valley病毒；(d)分离大量的突变体Seneca Valley病毒；(e)用分离的大量突变体Seneca Valley病毒温育不允许的肿瘤细胞；以及(f)回收消解性感染不允许的肿瘤细胞的突变体Seneca Valley病毒，由此制备改变趋性的突变体Seneca Valley病毒。
85.权利要求84的方法，更进一步包括(g)在不允许的细胞中温育回收的突变体Seneca Valley病毒；以及(h)回收消解性感染不允许的肿瘤细胞的突变体Seneca Valley病毒。
86.根据权利要求85的方法，进一步包括反复重复步骤(g)和(h)。
87.权利要求85的方法，其中在多-孔高通量平台中进行温育，其中该平台在每一孔中包括不同类型的不允许的肿瘤细胞。
88.权利要求87的方法，进一步包括筛选平台来鉴定哪些孔含有消解性感染细胞的突变体Seneca Valley病毒。
89.权利要求的88方法，其中通过分析每一孔中的吸光度进行筛选。
90.权利要求84的方法，其中Seneca Valley病毒突变体的cDNA文库包括大量突变体Seneca Valley病毒衣壳多核苷酸序列。
91.权利要求90的方法，其中大量的突变体Seneca Valley病毒衣壳多核苷酸序列通过将核苷酸随机插入包括如下序列的编码衣壳的区域中产生与SEQ ID NO3，5或7具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或65％的序列同一性的序列。
92.权利要求91的方法，其中至少部分随机插入的核苷酸序列编码附加表位。
93.权利要求91的方法，其中核苷酸的随机插入由三核苷酸-致突变(TRIM)进行。
94.权利要求84的方法，其中Seneca Valley病毒突变体的cDNA文库由ATCC保藏号PTA-5343的Seneca Valley病毒或具有包括与SEQID NO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或65％同一性的序列的基因组的病毒产生。
95.权利要求84的方法，其中不允许的肿瘤细胞是肿瘤细胞-系或分离自患者的肿瘤细胞类型。
96.权利要求95的方法，其中不允许的肿瘤细胞系选自M059K，KK，U118MG，DMS79，H69，DMS114，DMS53，H460，A375-S2，SK-MEL-28，PC3，PC3M2AC6，LNCaP，DU145，Hep3B，Hep2G，SW620，SW839，5637，HeLaS3，S8，HUVEC，HAEC，W138，MRC-5，IMR90，HMVEC，HCN-1A，HRCE，CMT-64，LLC-1，RM-1，RM-2，RM-9，MLTC-1，KLN-205，CMT-93，B16F0，Neuro-2A，C8D30，PK15，FBRC，MDBK，CSL503和OFRC。
97.权利要求95的方法，其中分离自患者的不允许的肿瘤细胞类型选自如下的肿瘤成胶质细胞瘤，淋巴瘤，小细胞肺癌，大细胞肺癌，黑色素瘤，前列腺癌，肝癌，结肠癌，肾癌，结肠癌，膀胱癌，直肠癌和鳞状上皮细胞肺癌。
98.制备具有体内肿瘤细胞类型趋性的突变体病毒的方法，该方法包括(a)产生包括大量核酸序列的病毒突变体的文库；(b)将病毒突变体的文库转染到允许细胞中，由此产生大量的突变体病毒；(c)分离大量的突变体病毒；(d)给患有肿瘤的哺乳动物施用分离的大量突变体病毒，其中的哺乳动物不是突变体病毒未突变形式的天然寄主；以及(e)回收在肿瘤中复制的病毒，由此制备具有体内肿瘤细胞类型趋性的突变体病毒。
99.权利要求98的方法，其中产生病毒突变体的文库包括-提供编码病毒衣壳区域的多核苷酸；-使多核苷酸突变以便产生大量的不同的突变体编码衣壳的多核苷酸序列；以及-将大量的突变编码衣壳的多核苷酸连接到具有除了编码衣壳的区域之外的病毒的基因组序列的载体中，由此产生病毒突变体的文库。
100.权利要求98的方法，其中步骤(e)中回收的病毒消解性感染肿瘤的细胞。
101.权利要求98的方法，其中的肿瘤是异种移植，同种基因的肿瘤，同位肿瘤或转基因肿瘤。
102.根据权利要求98的方法，其中的哺乳动物是小鼠。
103.根据权利要求98的方法，其中的病毒突变体是微小RNA病毒。
104.根据权利要求98的方法，其中的微小RNA病毒是心脏病毒。
105.权利要求104的方法，其中的微小RNA病毒是Seneca Valley病毒或其相关物或者衍生物。
106.权利要求109的方法，其中Seneca Valley病毒是ATCC保藏号为PTA-5343的Seneca Valley病毒或其基因组序列包括与SEQ IDNO1有至少95％同一性的序列。
107.由权利要求45，57，75，84或98的方法制备的肿瘤消解病毒。
108.用肿瘤消解病毒治疗患者的方法，该方法包括(a)灭活权利要求107的肿瘤消解病毒，使得肿瘤消解病毒不具感染性并且肿瘤消解病毒的趋性不受影响；以及(b)给肿瘤患者施用灭活的肿瘤消解病毒。
109.权利要求108的方法，进一步包括将毒素与灭活的肿瘤消解病毒连接。
110.用Seneca Valley病毒治疗肿瘤患者的方法，该方法包括(a)灭活Seneca Valley病毒，使得该病毒不具感染性并且该病毒的趋性不受影响；以及(b)给肿瘤患者施用灭活的Seneca Valley病毒。
111.权利要求110的方法，进一步包括将毒素与灭活的SenecaValley病毒连接。
112.包括灭活的Seneca Valley病毒的Seneca Valley病毒组合物。
113.Seneca Valley病毒，含有整合到衣壳区域的附加表位。
114.用Seneca Valley病毒治疗肿瘤受试者的方法，该方法包括(a)产生含有在衣壳中编码的附加表位的突变体Seneca Valley病毒；(b)将毒素与附加表位连接；以及(c)给患有肿瘤的受试者施用具有连接的毒素的突变体SenecaValley病毒。
115.权利要求114的方法，其中该产生含有-将编码附加表位的寡核苷酸插入Seneca Valley病毒的编码衣壳的区域的多核苷酸中。
116.权利要求115的方法，其中突变体Seneca Valley病毒与ATCC保藏号PTA-5343的Seneca Valley病毒相比不具有改变的细胞类型趋性。
117.权利要求116的方法，进一步包括灭活突变体Seneca Valley病毒，使突变体Seneca Valley病毒不具感染性。
118.检测样品中肿瘤细胞的方法，包括(a)由患者分离肿瘤样品；(b)用附加表位的Seneca Valley病毒温育肿瘤样品；以及(c)通过检测附加表位筛选结合Seneca Valley病毒的肿瘤样品。
119.体内检测肿瘤细胞的方法，包括(a)给患者施用接受辐射的附加表位的Seneca Valley病毒，其中标记与附加表位结合；以及(b)检测患者体内的标记。
120.权利要求118或119的方法，其中的Seneca Valley病毒是突变体，衍生物或相关物。
121.用SVV治疗癌症的方法，包括(a)制备包含缺失包装信号序列的SVV突变体；以及(b)用SVV突变体感染肿瘤细胞，由此通过SVV-介导的宿主细胞关闭引起肿瘤细胞的死亡。
全文摘要
本发明涉及称作Seneca Valley病毒(“SVV”)的新的微小RNA病毒。本发明提供了分离的SVV核酸以及由这些核酸编码的蛋白。此外，本发明提供了抗SVV蛋白的抗体。因为SVV具有选择性杀死某些类型肿瘤的能力，本发明提供了利用SVV以及SVV多肽治疗癌症的方法。因为SVV特异性靶向特定的肿瘤，本发明提供了利用SVV核酸以及蛋白检测癌症的方法。另外，由于SVV的肿瘤特异性机制提供的信息，本发明提供了制备新的肿瘤消解病毒衍生物以及改变病毒使其具有肿瘤特异性趋性的方法。
文档编号C07K16/00GK1875028SQ200480030443
公开日2006年12月6日 申请日期2004年9月23日 优先权日2003年9月26日
发明者保罗·L·哈伦贝克, 卡尔·M·哈伊, 尚西·加内什, 塞希达·雷迪·波利斯, 徐玲, 杨敬平, 程诚 申请人:诺瓦帝斯公司