专利名称：抗Lewis Y抗独特型抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，更特别地涉及抗体。
背景技术：
25年前单克隆抗体(mAb)技术的出现提供了大量有用的研究试剂并且创造了使用抗体作为癌症治疗、自身免疫失调、移植排斥、抗病毒预防中的批准试剂以及作为抗血栓药的机会(Glennie and Johnson2000)。运用分子工程将鼠mAbs转变成嵌合mAbs(小鼠V-区域，人C-区域)和人源化试剂，其中只有鼠源的mAb互补决定区(CDR)对mAb治疗的临床成功是关键的。工程化mAbs已经显著降低或失去了免疫原性、增加了血清半衰期并且mAb的人Fc部分增加了募集补体和细胞毒性细胞的免疫效应物的能力(Clark 2000)。研究生物分布、药物动力学和任何对临床施用的mAbs的免疫应答诱导都需要开发分析法来辨别药用和内源性蛋白质。
抗体通常是根据它识别的抗原来确定的。抗体对特定抗原的特异性是通过它的抗原结合位点决定的，该位点是与抗原接触的抗体分子的独特区域。这个位点是在免疫球蛋白重链和轻链的可变区里发现的。尽管如此，抗体也可以由其独特型确定，独特型是与单一特异性的抗体分子群的特有重链和轻链区域相关的独特位或表面标志的集合。抗体特有的抗原决定簇称为独特位，通过抗独特位抗体与具有独特位的抗体的反应来确定。独特型是有用的标志，因为它们使研究者能够跟踪在免疫应答和遗传性免疫球蛋白基因中的特定抗体的出现和持续。独特型也是能够刺激抗独特型抗体产生的唯一决定簇。
抗独特型抗体结合其它抗体的可变区，在免疫系统中结合针对内部(自身)抗原所产生的抗体方面起着主要作用(Jerne 1974)。由诱导性独特型抗体的可变区所引起的抗独特型抗体可以是三类中的一种1)识别抗原结合位点中的表位(互补位)；2)在互补位附近结合并空间上干扰独特型抗体-抗原的相互作用；或者3)结构上模拟由独特型抗体所识别的抗原(“内部影像”抗独特型抗体)。已经生产了后一类抗独特型并且作为疫苗研究，给出了它们在调节宿主对细菌、病毒和寄生感染外的肿瘤相关抗原的免疫应答方面的潜力(在(Bhattacharya-Chatterjee，Chatterjee et al.2001)中综述)。啮齿动物抗独特型抗体需要佐剂并缀合到载体，通常是匙孔血蓝蛋白(KLH)上以引起免疫或抗肿瘤应答。
抗独特型抗体也可用作免疫治疗试验中的酶联免疫吸附测定(以下称为ELISA)试剂，用于检测所注射的独特型抗体的患者血清水平或对所施用的独特型抗体的免疫应答。这样的免疫应答包括人抗小鼠抗体、人抗嵌合抗体、以及人抗人源化抗体(下文分别称为HAMA、HACA、HAHA)。抗独特型抗体NUH-82针对鼠mAb G250的结合位点，其识别人肾细胞癌上的G250抗原(Uemura，Okajima 1994)。已经证明NUH-82用于测定接受了cG250抗体放射免疫疗法的患者中的HACA应答是有用的(Steffens，Boerman et al.1997)，更为近来NUH-82已经用于夹心式ELISA中，用于药物动力学分析测定患者血清中cG250的血清水平(Liu，Smyth et al.2002)。
开发了hu3S193抗体用于靶向表达二岩藻糖基化糖抗原Lewis Y的上皮肿瘤，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌(Kitamura，Stockert et al.1994；Scott，Geleick et al.2000)。Lewis Y是在例如肺癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌或卵巢癌来源的上皮肿瘤分子表面上表达的糖分子。Lewis Y抗原在正常组织中表达，但是在某些肿瘤类型中的表达水平更高，所以该抗原可用作一些乳腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、十二指肠癌、肺癌、膀胱癌和肾癌以及胃和胰岛细胞神经内分泌肿瘤的细胞标志。与Lewis Y有关的抗原是免疫疗法的很有吸引力的目标，这是由于它们在原发性和转移性病变中高密度的和均一的表达(Kim，Yuan et al.1986；Sakamoto，Furukawa et al.1986；Zhang，Cordon-Cardo et al.1997)。
Hu3S193在体外引起强烈的ADCC和CDC，这显示了其作为临床前研究中所选实体肿瘤的免疫疗法的前景(Clarke，Lee et al.2000b；Clarke，Lee et al.2000a)，目前处于I期剂量增加临床试验。临床前的生物分布研究追踪了引导hu3S193的放射性标记来评估乳腺癌动物模型中的稳定放射性缀合物的肿瘤靶向能力(Clarke，Lee et al.2000a)。在临床中，可以用放射性标记来追踪诸如hu3S193的mAbs以评估生物分布和肿瘤图像、以及血清中的放射性缀合物的清除、作为mAb药物动力学的测定(Clarke，Lee et al. 2000a；Scott，Geleick etal.2000；Hoffman，Scott et al.2001)。然而，在没有临床症状时不能检测到HAHA免疫应答。
假设hu3S193的免疫效应物功能，确定早期试验中给予的抗体的血清水平将有助于将来治疗方法的计划并使得能够确定未标记hu3S193的药物动力学，同时测定HAHA的能力将有助于评估hu3S193的安全性。
特别地，本发明也涉及抗独特型在免疫治疗试验中作为诊断试剂的用途，用于监测它们在患者循环中识别的所给予的独特型的药物动力学。类似地，抗独特型可用作对所给予的独特型mAb的HAHA、HACA或HAMA免疫应答的阳性对照。这样的免疫应答可能对患者群体中的临床结果没有影响(Gruber，van Haarlem et al.2000)，或者可能与预防进一步治疗的免疫治疗mAb的药物动力学和生物分布中的超敏反应和剧烈变化有关(Clark 2000)。
附图简述
图1A-B抗hu3S193单克隆抗体LMH-1(●)、-2(△)、-3(◇)、以及抗hulgG-4(◇)的结合特异性由ELISA确定。检查连续稀释的杂交瘤培养物上清液结合到包被了A)hu3S193(图1A)和B)hulgG(图1B)的微量滴定板上的活性。也包括第二缀合物(▲)和单独底物(o)的对照。用LMH-1、-2和-3、LMH-4观察到的对hu3S193的特异结合证明了抗hulgG结合活性。
图2.在克隆扩展之后，经ELISA对杂交瘤培养物上清液中和hu3S193抗原结合活性的能力进行三次检查。平均值±标准差的结果证实了抗hu3S193mAbs、LMH-1、-2和-3的拮抗物活性，其阻断了hu3S193结合到包被了合成Ley抗原的板上。
图3A-D验证LMH-2和LMH-3对3S193独特位的特异性。图3A.将蛋白质-A纯化的LMH-3包被到ELISA板上，将10μg/mlhu3S193、mu3S193、BR55.2以及对照IgG1 mAbs huA33和muA33的三份连续稀释样品加入孔中以进一步表征LMH-3的结合特异性。这个克隆的额外有利特征是可以利用生物素化的LMH-3来检测用LMH-3捕获的被结合3S193mAb。图3B.通过对hu3S193-Ley抗原结合的抗Ley和抗独特型mAbs来防止结合到包被了Ley-四糖的板上的拮抗结合；图3C.mu3S193-Ley抗原结合；以及图3D.BR55.2-Ley抗原结合活性。
图4A-C用于测定患者血清样品中hu3S193的ELISA的开发。图4A.在可得到抗独特型之前的现有方法-用合成抗原Ley-BSA缀合物捕获、用抗hulgG检测，其证实了用hu3S193标准的低灵敏度和患者预输注血清样品中的高背景。图4B.用抗hu3S193独特型LMH-2捕获并用LMH-2-生物素检测。观察到了很低的灵敏度。以及图4C.用抗hu3S193独特型LMH-3捕获并用LMH-3-生物素检测，证实了对血清中的3ng/ml hu3S193的最小背景和灵敏度。
图5对hu3S193的血清HAHA应答的Biacore分析法进行优化，并使用抗独特型LMH-3作为阳性对照来验证。将hu3S193固定在生物传感器芯片上，将抗独特型mAb LMH-3(■)和人血清中的同种型匹配的对照抗体(▲)的三份连续稀释物(μg/ml)从芯片上通过。
发明概述本发明涉及抗人源化抗Lewis Y单克隆抗体hu3S193的抗独特型抗体。本发明也涉及由杂交瘤克隆产生的mAbs与hu3S193的可变区的特异性结合以及抗独特型mAB抑制hu3S193结合到Lewis Y抗原的能力的ELISA筛选方法。
本发明也涉及用本发明的抗体来检测HAMA、HACA和HAHA应答的方法。
本发明的一个方面是提供特异于抗Lewis Y单克隆抗体的抗独特型抗体。本发明的另一方面是提供特异于抗Lewis Y抗体的抗独特型抗体，其结合到抗Lewis Y单克隆抗体的可变区。类似地，本发明的另一方面是阻断抗Lewis Y单克隆抗体结合的抗独特型抗体。本发明的另一方面是提供特异结合hu3S193的抗独特型抗体。特别地，本发明提供的抗独特型抗体可选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或单链抗体。
本发明的另一方面是提供能够产生特异于抗Lewis Y单克隆抗体的抗独特型抗体的杂交瘤。本发明进一步的方面是提供特异于抗LewisY单克隆抗体的杂交瘤，其选自LMH-1、LMH-2和LMH-3。
本发明的另一方面是提供检测抗独特型抗体抑制抗体结合到抗原的能力的方法。本发明的另一方面是提供检测抗独特型捕获并检测被结合的独特型抗体的能力的方法。本发明的另一方面是提供检测抗独特型抗体结合到独特型抗Lewis Y抗体上的能力的方法。本发明的另一方面是检测样品血清中的抗体量的方法。
本发明包括通过ELISA测定血清样品中的hu3S193的方法，其使用偶联到BSA上的合成Lewis Y四糖作为捕获hu3S193的抗原并使用商业上获得的抗人抗体制剂作为被结合的hu3S193的检测物。由在高背景中产生的第二抗hulgG抗体所检测到的血清样品hulgG的非特异结合极大限制了分析法的灵敏度。基于用抗独特型NUH-82测定对cG250的HACA应答以及cG250血清水平的经验，合适的抗独特型hu3S193mAb的产生变得必要。
本发明也涉及使用本发明的抗体检测HAMA、HACA和HAHA应答的方法。
发明详述本发明提供特异于抗Lewis Y单克隆抗体的抗独特型抗体。这些抗独特型抗体特异于抗Lewis Y抗体，其结合到抗Lewis Y单克隆抗体的可变区。类似地，本发明的另一方面是阻断抗Lewis Y单克隆抗体结合的抗独特型抗体。本发明的另一方面是提供特异结合抗Lewis Y单克隆hu3S193的抗独特型抗体。特别地，本发明提供的抗独特型抗体可以选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或单链抗体。
另外，本发明提供能够产生特异于抗Lewis Y单克隆抗体的抗独特型抗体的杂交瘤。本发明进一步的方面是提供特异于抗Lewis Y单克隆抗体的杂交瘤，其选自LMH-1、LMH-2和LMH-3。
如这里所使用的术语“人源化”抗体是指具有源自非人物种免疫球蛋白的CDR′s(互补决定区)并且抗体分子的其它部分主要源自人免疫球蛋白的分子。
如这里所使用的术语“抗体”，除非另外指出，它被广泛用于指抗体分子和各种抗体衍生的分子。这样的抗体衍生的分子包括至少一个可变区(重链或轻链可变区)，包括分子例如Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fd碎片、Fabc片段、Fd片段、Fabc片段、Sc抗体(单链抗体)、双抗体、单独的抗体轻链、单独的抗体重链、抗体链和其它分子之间的嵌合融合体以及类似物。
这里所使用的关于免疫球蛋白分子的术语“可变区”具有由免疫学普通技术人员给予该术语的通常意义。抗体重链和抗体轻链都可以分成“可变区”和“恒定区”。可变区和重链区的分隔点可以很容易由本领域普通技术人员根据描述抗体结构的标准文字来确定，如Kabatet al.″Sequences of Proteins of Immunological Interest5th Edition″U.S.Department of Health and Human Services，U.S.GovernmentPrinting Office(1991)。
这里所使用的术语“独特型”表示能够决定其对抗原的特异性的抗体分子片断。独特型位于Fab区，其表达通常需要组成抗原结合位点的重链和轻链的可变区的参与。
这里所使用的术语“同种型”是指决定免疫球蛋白分子重链的类或亚类或者轻链的型和亚型的抗原。例如，IgG的四种同种型被命名为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
人源化抗Lewis Y单克隆抗体hu3S193特异性靶向Lewis Y上皮抗原。为辅助hu3S193的药物动力学分析并确定对临床施用的hu3S193的任何免疫应答，产生了抗独特型hu3S193抗体并表征为适合作为ELISA试剂，用于测定患者血清样品中的hu3S193以及作为HAHA分析中的阳性对照。将用hu3S193免疫的来自小鼠的脾细胞与SP2/0-AG14浆细胞瘤细胞融合，由所得杂交瘤产生的抗独特型抗体通过ELISA选择与hu3S193的特异结合以及与Lewis Y抗原的竞争性结合。初步选择出九个杂交瘤，其中三个命名为LMH-1、-2和-3的杂交瘤示出特异结合到hu3S193、以及与hu3S193竞争性结合Lewis Y抗原。hu3S193独特位的识别是特异性的，如用抗Lewis Y单克隆抗体BR55.2和用其它非相关的人IgG、鼠IgG、人源化或嵌合单克隆抗体缺乏交叉反应性所证明。
产生了抗Lewis Y单克隆抗体hu3S193的小鼠单克隆抗独特型，它们确定的特异性使得能够选择出特定的抗独特型，用于临床中监测药物动力学和对所施用的hu3S193的免疫应答的分析。
产生了三种抗独特型hu3S193抗体，命名为LMH-1、-2和-3，它们能够特异结合hu3S193并抑制hu3S193和mu3S193的结合，但不抑制BR55.2与Lewis Y抗原的结合。也分离到了抗hulgG mAbLMH-4，证实了结合到所有被测试的嵌合人源化mAbs或纯化的hulgG上的强活性。所有四种Abs都被确定为鼠IgG1 kappa同种型。杂交瘤LMH-3在滚瓶培养物中每ml培养上清液产生13μg纯化的LMH-3，LMH-4产生15μg/ml，表明这些克隆经可以进行大规模生产。LMH-4具有在实验室中作为检测hulgG的试剂、或者在污染了牛IgG的组织培养上清液的单克隆抗体的亲和纯化中作为试剂的潜力。BIAcore分析法确定了LMH-3对hu3s193很高的表现亲和力，Ka＝4.76×108M-1(Kd＝2.10×10-9M)。这个亲和力使得能够开发高度可重复的、灵敏的、特异性的ELISA分析法，用于确定使用纯化的LMH-3进行捕获和生物素化LMH-3以进行检测的hu3S193的血清浓度。通过BIAcore建立的血清样品HAHA分析使用LMH-3作为患者血清中免疫应答定量的阳性对照是可能的，也可以使用这些抗独特型通过肿瘤活组织检查物的免疫组织化学分析来研究hu3S193对肿瘤细胞的渗透和结合。能够同时结合靶抗体每个可变结构域的抗独特型抗体的产生提供了高灵敏度的试剂，用于评估临床施用的靶抗体的安全性和药物动力学图谱。已经产生了抗独特型hu3S193mAbs，其作为诊断性实验室试剂具有有意义的用途，用于研究来自接受了hu3S193免疫疗法的患者的临床样品。
本发明的另一方面提供检测抗独特型抗体抑制抗体结合到抗原的能力的方法。本发明的另一方面提供检测抗独特型捕获并检测被结合的独特型抗体的能力的方法。本发明的另一方面提供检测抗独特型抗体结合到独特型抗Lewis Y抗体的能力的方法。本发明的另一方面是检测样品血清中的抗体量的方法。本发明也涉及用本发明的抗体检测HAMA、HACA和HAHA应答的方法。
研究了两种确定血清hu3S193水平的ELISA分析法。第一种分析法涉及捕获合成的Lewis Y抗原；第二种采用抗独特型抗体。比较了分析法的灵敏度和特异性，发现使用LMH-3的分析法较好，因为其比合成抗原具有更高的对hu3S193的亲和力、没有非特异性结合的低背景使其具有高灵敏度，能够定量3ng/ml的血清hu3S193极限。BIAcore分析法确定了LMH-3对hu3S193的表观结合亲和力，Ka＝4.76×108M-1(Kd＝2.10×10-9M)。杂交瘤产生高水平的抗体LMH-3。
提供以下实施例是为了说明发明，不应被解释为对发明的限定。
实施例实施例1细胞培养所有分析级试剂购自Sigma Chemical Co.(St Louis，MO，USA)，除非另外指出。
SP2/0-Ag14浆细胞瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA，USA)。SP2/0和所选杂交瘤克隆在标准RPMI-1640培养基中培养；它是含有10％热灭活的胎牛血清(FCS，TRACE Biosciences Pty Ltd，Sydney，Australia)、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素(Gibco)和4mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基(Gibco Invitrogen Corp.，Mt Waverley，Victoria，Australia)。融合产物初始的少量传代用上述含有20％FCS、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640来培养。使用HAT培养基来选择杂交瘤；它是含有20％FCS、HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)、OPI(草酰乙酸盐、丙酮酸盐、胰岛素培养基补充物)(Sigma)、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基。对于杂交瘤扩展，在HT培养基中培养细胞；它是含有20％FCS、HT(次黄嘌呤、胸腺嘧啶)、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基。
实施例2用于免疫和筛选的抗体人源化抗Lewis Y IgG1抗体hu3S193(批号D01097，10mg/mlPBS)、鼠3S193(mu3S193)、对照的同种型匹配人源化mAb huA33(批号5GMA3310mg/ml)以及无关的同种型匹配的小鼠人嵌合IgG1抗体由 Biological Production Facility，Ludwig Institute for CancerResearch，Melbourne，Australia提供。纯化的人IgG购自SigmaChemical Co.。根据厂商说明(Pierce，Rockford，IL，USA)用固定化的胃蛋白酶消化来制备F(ab)′2片段，由未消化的hu3S193和含有Fc的片断通过1ml蛋白质-A柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)来纯化。纯化的片断在Millipore离心滤器(Biomax 10k membrane，Millipore，Sydney，Australia)中浓缩到1mg/ml。
实施例3免疫方案购自Breeding Facility，Walter and Eliza Hall Institute，Melbourne，Australia的六到八周龄的雌性BALB/c小鼠用不限量提供的食物和水喂养。所有用于这个研究的对动物执行的步骤都经Austin and Repatriation Medical Centre的动物伦理委员会批准。从每个动物收集预免疫静脉血样品(200μl)，在室温凝结1小时，4℃过夜。收集所得血清(约100μl/小鼠)并在-20℃下贮存。
用六只小鼠进行免疫步骤。第0天通过腹膜内注射200μl含有40μg纯化的hu3S193完全弗氏佐剂(1∶1，v∶v)免疫BALB/c小鼠。小鼠在第14和28天接受加强注射含有40μg hu3S193的不完全弗氏佐剂。在第35天，从尾部静脉收集免疫后的血样，小鼠抗hu3S193抗体的血清滴度由ELISA确定。包括了作为对照的预免疫血清样品。在最后静脉内单独加强注射含40μg hu3S193后的4天的三个时候处死小鼠。无菌收集脾脏放入5ml PBS/G中，制备用于融合的脾细胞悬浮液。
实施例4融合和杂交瘤产生所有步骤都在室温下进行并基于以前公开的方法(12)。收集脾细胞并用RPMI-1640培养基清洗3次，确定细胞浓度。同时收获融合配偶体SP2/0细胞，在无血清培养基中清洗并计数。将每个细胞沉淀重悬浮在5ml无血清RPMI中，然后在50ml管中以5∶1的脾细胞SP2/0比例组合。在300xg离心细胞混合物10分钟，通过轻轻敲打使所得细胞沉淀逐渐碎裂。试管在37℃的水浴中温育，在1分钟时间内逐滴加入培养基(1ml)中的50％PEG。然后在2分钟时间内加入预热的无血清RPMI(2ml)，然后在3分钟时间内加入8ml培养基。在300xg下将细胞离心10分钟，然后轻轻地重悬浮在HAT培养基中(60ml HAT培养基/小鼠脾，含有约1×105脾细胞、2×104SP2/0骨髓瘤细胞)。混合的细胞悬浮液分成小份(100μl/孔)到六个96孔组织培养板(Falcon；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)中，在湿润的5％CO2/空气培养箱中于37℃培养。
实施例5单克隆抗体选择杂交瘤培养物上清液经ELISA筛选与hu3S193mAb和纯化的人IgG的阳性结合活性。所选克隆在24孔培养板(Falcon)中扩展，它们的结合活性和竞争性结合活性经ELISAs进一步表征。用小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(IsoStrip，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)来确定培养物上清液中所选抗独特型hu3S193抗体的亚类。
实施例6经有限稀释克隆杂交瘤初次稀释系列。所选杂交瘤克隆以100细胞/孔的密度铺板到96孔板的内部60个孔中的200μl HAT培养基中。外部孔用含有抗生素的RPMI-1640培养基填满以防止脱水以及HAT培养基/含有细胞的孔的浓缩。当细胞的生长差不多汇合时(约7天)，收集上清液并测试对hu3S193的特异结合以及Lewis Y抗原对hu3S193的拮抗结合。选择阳性克隆用于继续的分析和克隆。
第二次稀释系列。这个步骤的目的是建立由单个细胞长成的杂交瘤，以及利用了脾细胞饲养层的培养。从未免疫的BALB/c小鼠制备脾细胞，重新悬浮在补充了100mM 2-巯基乙醇的106细胞/ml的HAT培养基中，在无菌环境中室温温育过夜以确保没有污染物感染。第二天只使用板的内部60个孔来制备两个96孔微量滴定板用于每个所选克隆，如之前所描述的一样。分成小份(100μl)的HAT培养基被加入到第1排，将脾细胞悬浮液加入到2-6排(105细胞/孔)，板在37℃下温育过夜。所选细胞在HAT培养基中稀释，分别将100μl含有100、10、5、1、或0。5细胞的小份加入2到6排含有饲养细胞的孔中。板在37℃下温育10-14天，从接种1或0.5细胞/孔的孔选择克隆集落。
第三次稀释系列。为确保所选克隆是源自单个细胞的，所有所选细胞系都重复第二次稀释步骤一轮。扩展优选的细胞系并制备储液，然后在液氮下贮存。
实施例7抗体生产产生杂交瘤的所选出的并再克隆的抗独特型抗体在滚瓶(Corning，Corning Incorporated，NY，USA)中培养，无菌收获培养物上清液。抗独特型抗体的纯化通过在5ml蛋白质-A琼脂糖快速流动柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)亲和层析进行，柱在pH 8的50mM Tris-HCl(缓冲液A)中预平衡。在用20倍柱体积的缓冲液A清洗之后，用100mM含有200mM NaCl的甘氨酸-HCl、pH 2.7洗脱被结合的抗体，立即用1M的Tris-HCl、pH 8中和。4℃下在PBS中透析过夜后，用离心滤器(Millipore，Biomax 10k膜)浓缩抗体。在还原和非还原条件下经SDS-PAGE检查纯度。通过考马斯亮蓝染色观测蛋白质。根据厂商说明(Amersham PharmaciaBiotech.)用ECL蛋白质生物素化模块试剂盒制备生物素化的抗独特型抗体。
实施例8ELISA分析结合特异性杂交瘤上清液或纯化的抗独特型抗体的结合特异性经ELISA分析表征。用hu3S193(100μl，4.0μg/ml)、纯化的人IgG或碳酸盐缓冲液(0.05M，pH 9.6)中的其它对照单克隆抗体包被96孔板(NuncMaxiSorp，Roskilde Denmark)，4℃过夜。在室温(23℃)用3％BSA/PBS阻断非特异性结合2小时。制备上清液或纯化的抗体的连续稀释物(1∶2-1∶6300)，将100μl的小份加入每个孔中。每次分析中包括阳性(hulgG)和阴性(单独的缀合物和底物)对照。室温下将板温育1小时，用0.05％Tween 20/PBS清洗三次，然后用第二抗体(缀合碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG)(100μl/孔，1∶3000稀释在1％BSA/PBS))温育1小时。用发色团底物磷酸对-硝基苯酯底物(ICN Biomedicals Inc.，Aurora，Ohio，USA)检测被结合的抗体。用Vmax动力学微量滴定板读数器(Molecular Devices Corporation，Sunyvale，California)测定450nm下的光密度。
实施例9ELISA分析拮抗活性测试了所选抗独特型抗体阻断hu3S193mAb结合到包被Lewis Y-抗原的板上的能力。可得到以约32∶1的摩尔比偶联到BSA上的合成Lewis Y四糖(Alberta Research Council，Edmonton，Alberta，Canada)。用Lewis Y-BSA抗原(50μl，3.0μg/ml PBS)包被ELISA板(Nunc MaxiSorp)，并在4℃温育过夜。用3％BSA/PBS在室温下阻断板上的非特异性结合2小时。将半对数连续稀释的样品(上清液或纯化的抗独特型mAbs)加入到每个孔中，接着加入hu3S193mAb(50μl；1μg/ml的终浓度)。室温温育1小时后，用山羊抗人IgG-HRP来检测被结合的hu3S193mAb，在大量清洗之后用ABTS底物(2，2′-连氮基-双-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸；100μl，40pM/孔；ICN)进行观测。用Vmax动力学微量滴定板读数器在415nm下读取光密度(OD)。
实施例10抗独特型对Hu3S193的特异性用hu3S193和鼠mAbs mu3S 193以及BR55.2(Ludwig Institute forCancer Research，New York)hu3S193进一步检查纯化的所选克隆结合抗Lewis Y mAbs的特异性。用两种ELISAs检查特异性。第一种利用抗独特型捕获并检测被结合的独特型mAb，第二种检查抗独特型mAb结合溶液中的独特型抗Lewis Y mAbs和抑制Lewis Y抗原结合的能力。
对于第一种分析方法，用所选抗独特型mAb包被ELISA Maxisorp板在4℃下过夜(100μl 4μg/ml 0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)。用3％FCS/PBS阻断后，将10μg/ml hu3S193、mu3S193、BR55.2以及对照无关mAbs huA33和muA33的连续稀释的三份样品加入孔内，然后室温温育1小时。清洗之后，用生物素化的抗独特型mAb检测被结合的mAb(LMH-3-Bt；100 μl/孔、4μg/ml，在1％FCS/PBS中，4℃过夜)。为检测被结合的复合物，在加入抗生物素蛋白链菌素-HRP(在1％FCS/PBS中1∶1000稀释，100μl/孔)之后通过ABTS产生颜色。如之前所描述的一样测定OD415。
对于第二种特异性测试，用合成Lewis Y-BSA抗原(4.0μg/ml，在PBS中，4℃过夜)包被三个ELISA板。然后将连续稀释的抗Lewis YmAbs分成小份到板的每排；板1，hu3S193；板2，mu3S193；板3，BR55.2，终浓度范围(0.003-1oμg/ml)。为测试对Lewis Y抗原的竞争结合，加入其它两种抗Lewis Y mAbs和两种抗独特型mAbs各两份(终浓度10μg/ml)，然后室温温育1小时。清洗之后，使用抗hulgG-HRP(Sigma；100μl，1∶1000于1％FCS/PBS中)、然后通过ABTS产生颜色并测定A415nm来检测板1中被结合的hu3S193。用山羊抗mIgG-碱性磷酸酶和对硝基苯酚发色团在A405测定来检测板2上被结合的mu3S193和板3上的BR55.2。
实施例11血清中的Hu3S193的ELISA测定开发了两种ELISA分析法来检测血清样品中的hu3S193mAb。对于第一种分析法，利用合成Lewis Y-BSA抗原(3.0μg/ml于PBS中，50μl/孔)捕获hu3S193。在与健康供体血清或3％BSA/PBS中的hu3S193连续稀释样品温育之后，用山羊抗人IgG-HRP第二抗体和ABTS底物来检测结合到抗原上的hu3S193mAb的量。
第二种分析法涉及用抗独特型抗体包被和用生物素化的抗独特型抗体检测。用抗独特型hu3S193抗体(3.0μg/ml于0.05M碳酸盐缓冲液中，pH 9.6，100μl/孔)包被板，4℃过夜，然后用3％BSA/PBS室温(23℃)阻断2小时。将3％BSA/PBS或健康供体血清中的hu3S193连续稀释样品(0.0315-10μg/ml)三份加入板中，并室温温育1小时。清洗之后，加入生物素化的抗独特型hu3S193抗体(100μl3μg/ml于1％BSA/PBS中)，并室温温育1小时。为检测被结合的复合物，加入抗生物素蛋白链菌素-HRP(1∶1000在1％BSA/PBS中稀释，100μl/孔)之后通过ABTS产生颜色。如前面所述的一样测定OD415。
生物传感器分析法用包被了羧甲基葡聚糖的传感器芯片(CM5)上的BIAcore 2000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)进行生物传感器分析。用标准NHS/EDC胺偶联化学法，用通道2上的hu3S193、通道3上的LMH-3以及通道4上偶联到牛血清白蛋白(Alberta ResearchCouncil，Edmonton，Canada)上的Lewis y四糖来衍生化芯片。hu3S193和LMH-3的样品在HBS缓冲液(10mMHEPES，pH7.4；150mMNaCl；3.4mM di-Na-EDTA；0.005％Tween-20)中稀释，将小份(30μl)以5μl/分钟的流速注射到传感器芯片表面上。注射阶段后，通过在芯片表面上流过HBS缓冲液300秒来检测解离。将被结合的抗体洗脱，在加样之间通过注射pH为2.7的20μl100mM甘氨酸/100mM NaCl来再生芯片表面。对于结合的动力学分析，将不同浓度的hu3S193和LMH-3注射到传感器芯片表面。使用二价分析物模型来计算表观缔合速度常数(ka)和表观解高速度常数(kd)，使用BIAevaluation v3.0软件(Pharmacia Biosensor，Uppsala，Sweden)经整体和局部拟合来计算Rmax。
患者对施用的单克隆抗体的免疫应答可通过对患者血清的Biocore分析来评估(Ritter，Cohen et al.2001)。抗独特型抗体在这些分析中作为阳性对照试剂是有用的。因此，将LMH-3加入健康供体血清中(3-50μg/ml)，验证了对固定化的hu3S193的结合应答。
实施例12小鼠免疫和杂交瘤克隆选择重复用hu3S193mAb免疫三组BALB/c小鼠，分析其血清中的小鼠抗hu3S193mAb活性。血清样品免疫前和免疫后的免疫活性表明了高滴度小鼠抗完整的和F(ab)′2hu3S193mAbs的发展。用同种型对照人源化IgG(huA33)或嵌合IgG F(ab)′2包被的板也显示出强阳性结合(结果未显示)。处死小鼠并取出它们的脾。脾细胞和融合配偶体Sp2/0浆细胞瘤细胞进行融合，筛选来自这三个融合的杂交瘤。只有证实了对hu3S193mAb的强结合活性、但是对对照huA33或纯化的人IgG弱结合或没有结合的3-4孔被选择并扩展。扩展之后，用ELISA分析法进一步测试抗体特异性(图1)。在从第一个融合选择克隆期间，使用三种对照人源化或嵌合抗体。因为用包被了纯化的人IgG的板通常观察到了交叉结合活性，所以在随后的筛选中，除了hu3S193外，主要使用纯化的人IgG。
实施例13所选抗独特型抗体的结合和阻断活性进一步分析所有所选杂交瘤的结合和拮抗活性以识别产生抗独特型hu3S193抗体的杂交瘤。从每个杂交瘤培养物上清液制备半对数连续稀释物，并通过ELISA进行评价。在最初选择的12个克隆中，识别出三个能够结合hu3S193、但是不能结合hulgG并抑制hu3S193结合到Lewis Y抗原(图1)。这些杂交瘤F1-1、F2-3和F3-27是通过有限稀释从单个细胞克隆的，分别命名为Ludwig Institute for CancerResearch Melbourne Hybridoma(LMH)-1、LMH-2和LMH-3。这些克隆之一(FS2-1)证实了对所有测试的嵌合人源化mAbs或纯化hulgG的强抗hulgG结合活性(图1)，随后被用作hulgG结合的阳性对照。该克隆是从单个细胞制备的，被称为LMH-4。LMH-1到-4抗体经小鼠单克隆抗体同种型分析试剂盒识别为同种型IgG1ê，通过蛋白质-A亲和层析从培养物上清液纯化。这四个克隆的结合特异性通过ELISA确认(图4A-C)。没有观察到LMH-1、-2或-3与hulgG恒定链的交叉反应性(图4B)，所有三种抗体仅特异结合hu3S193mAb(图4A)。通过竞争性ELISA分析法来分析这些抗体的拮抗活性。LMH-1、-2和-3抗hu3S193独特型抗体以剂量依赖性方式结合hu3S193mAb并抑制hu3S193mAb对Lewis Y抗原的结合(图2)。
实施例14抗体结合亲和力的确定用于固定化hu3S193与溶液中的LMH-3相互作用的生物传感器结合实验的表现亲和力确定的Ka为4.76×108M-1(Kd＝2.10×10-9M)。在用芯片表面上固定化的LMH-3进行的交互实验中，流过表面的hu3S193作为分析物，确定的Ka为9.12×108M-1(Kd＝1.10×10-9M)。
实施例15抗独特型对Hu3S193的特异性克隆LMH-2和LMH-3对3S193独特型的特异性在这些实验中得到验证(图5)。将蛋白质-A纯化的LMH-3包被到ELISA板上，将10μg/ml hu3S193、mu3S193、BR55.2和对照IgG1 mAbs huA33和muA33的连续稀释的三份样品加入孔中以进一步表征LMH-3的结合特异性。这个克隆的另一额外的有利特征是，可以利用生物素化的LMH-3来检测用LMH-3捕获的被结合3S193mAb。ELISA结果(图3A)表明，LMH-3特异性结合抗Lewis Y 3S193独特型，没有检测到与鼠抗Lewis Y BR55.2的反应，并且与对照muA33和huA33的鼠和人IgG1恒定结构域没有交叉反应。hu3S193和mu3S193对Lewis Y抗原的结合在溶液中被10μg/ml LMH-2和LMH-3有效竞争，但是抗独特型结合位点一旦饱和，就现察到了一些hu3S193和mu3S193对抗原的结合(分别是图3B和3C)。尽管更高亲和力的mu3S193完全阻断hu3S193结合到Lewis Y抗原上，除了在最高浓度(10μg/ml)外，鼠BR55.2mAb会实现一些竞争性结合(图3B)。在板2的交互实验中，当mu3S193首先加入孔中时，更低亲和力的hu3S193不能竞争Lewis Y抗原(图3C)。板3的结果(图3D)证实了BR55.2对LewisY抗原的结合不能被hu3S193或抗独特型克隆LMH-2和-3竞争或抑制。因此确认了这些克隆对3S193独特型的特异性。图3B中观察到的BR55.2竞争可能是通过高亲和结合到它的不同Lewis Y表位的位阻来实现的。
实施例16用于临床样品中Hu3S193测定的ELISA分析法的开发第一种研究的ELISA分析法采用合成抗原(Lewis Y四糖-BSA缀合物)来捕获血清中的hu3S193，并用缀合了过氧化物酶的第二山羊抗人IgG来检测。合成Lewis Y抗原具有对hu3S193mAb比较低一些的亲和力，这会降低分析法的灵敏度，如记录的低光密度值所显示的。第二缀合抗体检测所有的人免疫球蛋白，因此观察到了所有分析样品的高背景(图4A)。高背景干扰显著降低了分析法的灵敏度和准确性，特别是对于低血清hu3S193浓度来说。第二种ELISA分析法使用纯化的抗独特型hu3S193抗体LMH-1、2和-3来包被，生物素化的LMH-1、-2或-3作为第二抗体，用抗生物素蛋白链菌素-HRP和ABTS底物来观测结合的复合物。LMH-1和LMH-2抗独特型抗体显示出在血清或3％BSA/PBS中对mu3S193mAb的强结合，但是对hu3S193mAb弱结合。然而没有观察到与对照抗体，包括人源化mAb、嵌合mAb、鼠mAb、人血清中的Ig或小鼠血清中的Ig(图4B)的交叉结合活性。研究尝试了通过改变包被抗体或第二抗体的浓度、以及使用不同的包被缓冲液来优化或改进具有LMH-1和LMH-2的ELISAs。一些改进已经实现，但是没有实现对应答模式的改变(数据未显示)。然而使用LMH-3抗独特型mAb来捕获、LMH-3-生物素作为第二抗体，在具有最小非特异性背景活性的血清中观察到了hu3S193和mu3S193mAbs的特异性强结合(图4C)。高度可重复的分析法证明了极好的灵敏度，对血清样品中的hu3S193或mu3S193mAbs的检测极限是3ng/ml。
免疫应答的BIOCore分析用抗独特型LMH-3对于hu3S193开发了血清中HAHA的测定。建立并验证了灵敏的且可重复的方法(图5)。
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权利要求
1.抗独特型抗体，其针对抗Lewis Y单克隆抗体。
2.权利要求1的抗独特型抗体，其结合到抗Lewis Y单克隆抗体的可变区上。
3.权利要求1的抗独特型抗体，其阻断抗Lewis Y单克隆抗体的结合。
4.权利要求1的抗独特型抗体，其特异结合hu3S193。
5.权利要求1的抗独特型抗体，其选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或单链抗体。
6.权利要求2的抗独特型抗体，其选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或单链抗体。
7.权利要求3的抗独特型抗体，其选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或单链抗体。
8.权利要求4的抗独特型抗体，其选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或单链抗体。
9.能够产生权利要求1的抗独特型抗体的杂交瘤。
10.能够产生权利要求2的抗独特型抗体的杂交瘤。
11.能够产生权利要求3的抗独特型抗体的杂交瘤。
12.能够产生权利要求4的抗独特型抗体的杂交瘤。
13.权利要求12的杂交瘤，其选自LMH-1、LMH-2和LMH-3。
14.权利要求4的抗独特型抗体，其是由选自LMH-1、LMH-2和LMH-3的杂交瘤产生的。
15.检测抗独特型抗体的结合特异性的方法，包括a.用抗Lewis Y抗体、纯化的人IgG或其它对照Mab包被Elisa板；b.加入纯化的抗独特型抗体；c.与第二抗体温育；以及d.检测被结合的抗独特型抗体的量，其中抗独特型抗体与抗体的结合证明了结合特异性。
16.权利要求15的方法，其中mAB是hu3S193。
17.权利要求15的方法，其中抗独特型抗体是针对抗Lewis Y抗原的。
18.检测能够阻断抗Lewis Y单克隆抗体的结合的抗独特型抗Lewis Y抗体的方法，包括a.用Lewis Y-BSA偶联的抗原包被Elisa板；b.加入抗独特型抗体；c.加入单克隆抗Lewis Y独特型抗体；以及d.检测被结合的抗Lewis Y单克隆抗体，其中在存在和不存在抗独特型抗体时，结合到抗原上的抗Lewis Y抗体的量是抗独特型抗体阻断抗Lewis单克隆抗体结合的能力的证据。
19.权利要求18的方法，其中抗Lewis Y单克隆抗体是hu3S193。
20.权利要求18的方法，其中抗独特型抗体是针对抗Lewis Y抗体的。
21.检测血清样品中的抗Lewis Y抗体的方法，包括a.用合成的Lewis Y-BSA抗原包被ELISA板；b.加入血清样品到ELISA板；c.加入缀合了过氧化物酶的抗Lewis Y抗独特型抗体到ELISA板；以及d.由结合到包被了抗原的ELISA板的缀合了过氧化物酶的抗Lewis Y抗独特型抗体的量来确定抗Lewis Y抗体的存在。
22.权利要求21的方法，其中单克隆独特型抗体是hu3S193。
23.检测施用了人源化抗Lewis Y单克隆抗体的患者中的抗LewisY HAHA应答的方法，包括a.从患者收集血清样品；b.在存在或不存在缀合了过氧化物酶的抗Lewis Y抗体时，将血清样品与包被了Lewis Y抗原的ELISA板进行反应；以及c.由抗独特型抗Lewis抗体的存在或不存在来确定，其中抗独特型抗Lewis抗体的存在证明了HAHA应答。
全文摘要
本发明提供了特异于抗Lewis Y单克隆抗体的抗独特型抗体。本发明也涉及由杂交瘤克隆产生的mAbs特异结合到hu3S193可变区，以及抗独特型mAB抑制hu3S193结合到Lewis Y抗原的能力的ELISA筛选方法。此外，本发明提供了能够产生特异于抗Lewis Y单克隆抗体的抗独特型抗体的杂交瘤。发明进一步的方面是提供对选自LMH－1、LMH－2、LMH－3或LMH－4的抗Lewis Y单克隆抗体特异的杂交瘤。本发明也涉及使用发明的抗体检测HAMA、HACA和HAHA应答的方法。
文档编号C07K16/28GK1867587SQ200480030361
公开日2006年11月22日 申请日期2004年8月10日 优先权日2003年8月14日
发明者Z·刘, A·M·斯科特, F·E·史密斯 申请人:惠氏公司, 路德维格癌症研究所